饒磊饒敏仇紅紅李紅輝劉靜莊滿嬌

（1. 成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，成都 610500；2. 蚌埠94565部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，蚌埠 233000；3. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006）

納米硒抗胰島β細(xì)胞凋亡作用與機(jī)制的研究

饒磊1饒敏2仇紅紅1李紅輝1劉靜1莊滿嬌3

（1. 成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，成都 610500；2. 蚌埠94565部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，蚌埠 233000；3. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006）

旨在研究納米硒（SeNPs）抗二型糖尿病胰島β細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。通過電子顯微鏡，納米粒度儀等技術(shù)方法對(duì)SeNPs的表征進(jìn)行鑒定，并運(yùn)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)驗(yàn)證其對(duì)于胰島β細(xì)胞凋亡模型的保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果表明，殼聚糖（CS）修飾后的SeNPs表面電荷增加到24.8 mv，其保存期延長到100 d以上。另外，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明濃度在2 μmol/L以下SeNPs不具有毒性，38.1 nmol/L SeNPs可通過激活硫氧還蛋白還原酶（TrxR）活性，從而減輕胞內(nèi)氧化應(yīng)激（ROS）水平，最終使胰島β凋亡模型細(xì)胞存活率提高了31.75%。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明SeNPs能抗胰島β細(xì)胞凋亡。因此，SeNPs可有效減輕二型糖尿病中胰島β細(xì)胞凋亡，對(duì)于二型糖尿病具有潛在的治療價(jià)值。

納米硒；二型糖尿?。谎趸瘧?yīng)激；分子機(jī)制

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，至2030年時(shí)，全球糖尿病患者人數(shù)會(huì)高達(dá)3億6千多萬，其中主要為二型糖尿?。═2DM）患者［1］。我國的糖尿病發(fā)病率雖低于某些發(fā)達(dá)國家，但由于人口基數(shù)大，糖尿病患者的人數(shù)卻居世界之首。因此開發(fā)糖尿病相關(guān)藥物與醫(yī)療技術(shù)具有重要市場價(jià)值與臨床意義。

硒是一種重要的礦物質(zhì)，在改善人類健康狀況扮演重要角色［2］。過去，硒多以有機(jī)硒的形式作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑，輔助治療癌癥。硒本身具有良好的抗氧化作用，是一種良好的癌癥治療劑［3，4］，然而硒酸鹽的有效治療濃度與毒性的界限接近，劑量難以把握［5］。應(yīng)用納米技術(shù)制造的納米硒（SeNPs），不僅低毒，有較好的生物相容性，還保持了硒抗氧化、抗菌、抗癌、增強(qiáng)免疫力等作用［6-8］。

多項(xiàng)研究表明糖尿病人血液硒含量較正常人低［9，10］，補(bǔ)硒成為治療糖尿病的可能選項(xiàng)，但由于毒性問題，在藥物開發(fā)上進(jìn)展緩慢。隨著對(duì)糖尿病發(fā)病機(jī)理的深入研究，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激造成的胰島β細(xì)胞凋亡是二型糖尿病逐年加重的主要病因。適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充硒，可加強(qiáng)含硒蛋白的活性［11］，如硫氧還蛋白還原酶，其活性的加強(qiáng)可顯著降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激（ROS）水平，從而減輕細(xì)胞凋亡。另外，無機(jī)硒酸鹽也可直接激活細(xì)胞內(nèi)的硫氧還蛋白還原酶（TrxR），減低細(xì)胞內(nèi)ROS水平［12］。制備的SeNPs雖然降低了毒性，但SeNPs表面電荷接近零價(jià)態(tài)，零價(jià)態(tài)的納米顆粒很不穩(wěn)定，容易聚集沉淀［13］。殼聚糖（CS）是一種有效、具有良好緩釋性能、生物相容性、生物降解性和抗酶活性的有機(jī)多糖［14］，已被用來穩(wěn)定SeNPs。CS修飾SeNPs（CS-SeNPs），表面帶有大量正電荷，穩(wěn)定性大大提高，可在4℃穩(wěn)定存放數(shù)月。這對(duì)研究SeNPs的治療效果及機(jī)制十分必要，可方便有效確定藥物濃度和保存。本研究在前期利用CS制備均勻、穩(wěn)定的SeNPs顆粒的基礎(chǔ)上，對(duì)其穩(wěn)定性、表面電荷等指標(biāo)進(jìn)行鑒定。并針對(duì)CS-SeNPs的毒性、抗氧化活性及作用機(jī)制做初步研究，以求獲得有潛在價(jià)值的治療二型糖尿病新型藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

亞硒酸鈉、CS和維生素C（Vc）購于Sigma-Aldrich（美國）；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購買于Gibco公司（美國）；MTT購于 R&D公司（美國）；DCFH-DA購于碧云天公司（中國）；透析袋購于Viskase公司（美國）；MGD購于Enzo公司（美國）。

透射電鏡（TEM），荷蘭Philips公司；掃描電鏡（SEM），日本Horiba公司；納米粒度儀，英國Malvern公司；冷凍離心機(jī)，德國Beckmann公司；分光光度計(jì)，美國Eppendorf公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 CS修飾的SeNPs制備 配制0.87 mg/mL的亞硒酸鈉母液，3.5 mg/mL的Vc母液，0.8 mg/mL的CS母液，在5 mL容量瓶中加入亞硒酸鈉母液1 mL，CS母液0.1 mL，渦旋混勻，再逐滴加入1 mL的Vc母液混勻，4℃反應(yīng)8 h后避光透析，隔8 h換水，再透析48 h［15］。

1.2.2 SeNPs表征鑒定 通過電子顯微鏡和納米粒度儀對(duì)制備好的SeNPs樣品進(jìn)行表征鑒定。TEM觀察樣品形貌，將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，在電鏡下觀察樣品的大小、形貌和均勻性，并拍攝具有代表性的電鏡照片，利用SEM觀察樣品表面形貌。用納米粒度儀鑒定分析樣品的電位及其粒徑隨時(shí)間的變化。不同時(shí)間取保存樣品，檢測粒徑，驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 胰島瘤細(xì)胞系INS-1購自武漢中科院。RPMI-1640中培養(yǎng)，添加10%FBS胎牛血清，80 mg/mL 青霉素，100 mg/mL鏈霉素，10 mmol/L HEPES和50 μmol/L的12-巰基乙醇，恒溫培養(yǎng)（5% CO2，37℃），細(xì)胞在6孔板（4×105個(gè)/孔）中鋪板，2 d后長滿底部用于胰島素檢測和Western blot。在96孔板（1×104個(gè)/孔）中鋪板，用于增殖、凋亡檢測，培養(yǎng)3 d用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡模型 細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加，引起的氧化應(yīng)激是胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞凋亡以及二型糖尿病發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。因此使用雙氧水處理胰島β細(xì)胞，選擇適當(dāng)?shù)臐舛?，通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平調(diào)控細(xì)胞凋亡，檢測藥物對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響。在96孔板中加入雙氧水，終濃度分別為0、10、25、50、100、200、1 000 μmol/L，1 h后吸取培養(yǎng)基，MTT法檢測細(xì)胞活性，最終取大約50%凋亡的H2O2濃度建立細(xì)胞凋亡模型。

1.2.5 檢測CS-SeNPs抗凋亡活性 用雙氧水制備細(xì)胞的凋亡模型，吸取培養(yǎng)基，加20 μL（10 mg/mL）MTT，孵育4 h，吸出MTT，加100 μL的DMSO，37℃孵育10 min，中間搖動(dòng)幾次，570 nm測吸光度值。

1.2.6 檢測ROS水平 用DMSO溶解DCFH-DA，配置濃度為4 mmol/L的母液，使用時(shí)加入400 μL的KRBB配成溶液。將培養(yǎng)在96孔板的細(xì)胞先吸取培養(yǎng)基，加入50 μL的DCFH-DA溶液，37℃孵育30 min。PBS洗滌一次，37℃孵育30 min，以便細(xì)胞內(nèi)DA充分與DCFH斷裂。加入藥物和雙氧水在37℃條件下于10、20、30、40、50和60 min用熒光酶標(biāo)儀檢測，激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.7 檢測TrxR活性 TrxR是細(xì)胞內(nèi)一類主要發(fā)揮抗氧化活性的含硒蛋白，多項(xiàng)研究證實(shí)硒酸鹽可激活TrxR活性，因此我們首先檢測了TrxR活性。

TrxR催化NADPH將DTNB還原為TNB，通過測定412 nm 波長處TNB的增加量，即可計(jì)算TrxR活性。在六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞到鋪滿平面，加不同濃度CS-SeNPs處理1 h。隨后，每孔細(xì)胞加A液1 mL清洗，換1 mL的A液混勻細(xì)胞。4℃，1 000 r/min 5min，去上清。加入150 μL B液裂解細(xì)胞，渦旋30 s，冰浴30 min。4℃，13 400 r/min 5 min，取上清到預(yù)冷EP管中，冰浴。BCA定量檢測蛋白含量，采用TrxR活性檢測試劑盒按表1順序檢測TrxR活性。

表1 TrxR檢測順序

混勻后，412 nm處測在0 min和5 min的吸光值，0 min測得為A1，5 min測得為A2。

按下列方程計(jì)算TrxR活性：TrxR（U/mg）=（△A測定管-△A空白對(duì)照管）/6.75×10÷Cpr×1000。其中，△A=（A2-A1）/5，Cpr：蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.8 檢測凋亡蛋白Caspase的活性 按照1.2.4方法，誘導(dǎo)細(xì)胞建模，并分正常細(xì)胞組、建模細(xì)胞組和建模細(xì)胞處理組，建模細(xì)胞處理組分CS-SeNPs高濃度（381 nmol/L）組和低濃度（38.1 nmol/L）組。處理好的細(xì)胞用PBS 洗滌兩次，加入細(xì)胞裂解液裂解，4℃ 12 000 r/min 離心15 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，然后用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下以5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Caspase-3、 Caspase-9和Caspase-12一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次。以ECL 化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影、定影。

1.2.9 模型鼠實(shí)驗(yàn) 小鼠種屬：BKS.Cg-m +/+ Leprdb 糖尿病模型鼠。飼養(yǎng)條件：小鼠每3 d加滿飼料及飲水；環(huán)境，SPF級(jí)；溫度，18-22℃；相對(duì)濕度，50%-60%；藥物處理分為兩組：模型鼠分為模型組、模型治療治療組，每組3只，每日下午注射藥物1 mg/kg，4周后處死，取胰腺組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（HE），進(jìn)行觀察。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測 應(yīng)用SPSS17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單組數(shù)據(jù)間使用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間使用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)間標(biāo)記相同字母表示無顯著差異，不同字母表示有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 CS-SeNPs表面形貌與粒徑分布

通過透射電鏡、掃描電鏡以及納米粒度儀檢測粒徑分布的結(jié)果。透射電鏡（圖1-A）顯示，CSSeNPs分布均勻，形態(tài)一致，呈球形，粒徑主要分布在90 nm左右。這是由于CS的羥基的作用，CS的羥基鍵可以和SeO32-反應(yīng)形成一個(gè)穩(wěn)定的中間化合物，因此CS修飾后的SeNPs形態(tài)更加均一穩(wěn)定。另外，掃描電鏡結(jié)果（圖1-B）顯示，SeNPs被CS均勻的覆蓋在外面，CS-SeNPs表面光滑，分布均勻。納米粒徑分布結(jié)果（圖1-C）表明，溶液中CSSeNPs粒徑分布均勻，其粒徑主要分布在90 nm左右。

2.2 CS-SeNPs表面電位與穩(wěn)定性

圖2-A顯示，SeNPs表面電荷為-3.6 mV，接近零價(jià)態(tài)，零價(jià)態(tài)物質(zhì)一般穩(wěn)定性差，CS-SeNPs表面電荷增加到24.8 mV，顯著增加了納米顆粒的穩(wěn)定性。圖2-B顯示，CS-SeNPs的粒徑在保存時(shí)間的初期維持穩(wěn)定，然后CS-SeNPs的粒徑在隨后一段時(shí)間出現(xiàn)輕微變化，但極少見到沉淀。在第120天的時(shí)候BAY-CS-SeNPs的粒徑迅速上升，且在第140天出現(xiàn)大量沉淀。CS-SeNPs在保存初期，由于表面負(fù)載大量高電荷CS，粒徑保持穩(wěn)定。在第100天以后，由于CS的降解，SeNPs表面負(fù)載的CS逐漸減少，SeNPs開始發(fā)生聚合，從而導(dǎo)致粒徑迅速增大，出現(xiàn)沉淀渾濁。高穩(wěn)定性的CS-SeNPs為其以后在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

圖1 CS-SeNPs的表征

圖2 CS-SeNPs的表面電位（A）和穩(wěn)定性（B）

2.3 細(xì)胞凋亡模型的建立以及硒毒性

由于SeNPs在高濃度時(shí)具有毒性，所以用梯度濃度CS-SeNPs孵育細(xì)胞，檢測細(xì)胞活性，確定CS-SeNPs的毒性范圍。按照逐漸遞增的濃度梯度（0.002、0.02、0.2、2、20、40 μmol/L） 檢 測 CSSeNPs對(duì)INS-1細(xì)胞的毒性，結(jié)果（圖3-A）顯示在濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，CS-SeNPs的毒性發(fā)揮主要作用，開始促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在濃度達(dá)到40 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性減少到正常對(duì)照組的72.41%，顯著小于對(duì)照，而CS-SeNPs在濃度小于2 μmol/L時(shí)，INS-1細(xì)胞增殖約50%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的CS-SeNPs具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，高濃度的CS-SeNPs抑制細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞有毒性，故選擇CS-SeNPs濃度低于2 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 CS-SeNPs的毒性與凋亡模型的建立

用雙氧水建立INS-1細(xì)胞的凋亡模型，用不同濃度的H2O2（10、25、50、100和1 000 μmol/L）處理細(xì)胞后，檢測這5個(gè)濃度狀態(tài)下的細(xì)胞活性。如圖3-B所示，50 μmol/L H2O2使細(xì)胞活性降低了47.61%，故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用50 μmol/L的雙氧水建立INS-1細(xì)胞凋亡模型。

2.4 CS-SeNPs抗凋亡活性及胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平ROS如圖4-A所示，38.1 nmol/L的CS-SeNPs處理的細(xì)胞與模型對(duì)照組相比細(xì)胞活性提高31.75%，表明CS-SeNPs具有抗凋亡的活性。T2DM發(fā)展過程中，ROS水平的提高是引起胰島β細(xì)胞凋亡的主要原因。圖4-B顯示在CS-SeNPs處理50 min后，顯著抑制雙氧水引起的細(xì)胞ROS水平上升，表明CS-SeNPs能有效降低細(xì)胞內(nèi)的ROS。

圖4 CS-SeNPs的抗凋亡作用

2.5 CS-SeNPs抗凋亡活性與細(xì)胞內(nèi)ROS水平的關(guān)系

已有文獻(xiàn)顯示抗氧化蛋白TrxR通過還原Trx發(fā)揮降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平的作用，無機(jī)硒具有激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白TrxR的作用，因此有必要檢測TrxR的活性。圖5-A顯示，CS-SeNPs在38.1 nmol/L的時(shí)候顯著激活細(xì)胞內(nèi)的TrxR活性。為了驗(yàn)證TrxR所發(fā)揮的作用，本研究使用了TrxR的抑制劑MGD。圖5-B顯示，CS-SeNPs可以顯著抑制ROS引起的細(xì)胞凋亡，加入MGD能抑制CS-SeNPs的抗凋亡作用，MGD是TrxR的抑制劑，這說明CS-SeNPs通過激活細(xì)胞內(nèi)TrxR活性發(fā)揮抗凋亡作用。

圖5 CS-SeNPs抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制

圖5-C顯示，H2O2能使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，同時(shí)使細(xì)胞凋亡率升高；而CS-SeNPs可降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，同時(shí)降低細(xì)胞凋亡率；MGD在抑制了CS-SeNPs的抗凋亡作用同時(shí)，也抑制了CS-SeNPs對(duì)胞內(nèi)ROS的降低作用，而MGD是TrxR的抑制劑，說明CS-SeNPs是通過激活細(xì)胞內(nèi)TrxR活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)揮抗INS-1細(xì)胞凋亡作用。

2.6 CS-SeNPs對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白活性的影響

已有文獻(xiàn)［16-18］顯示，在發(fā)生氧化應(yīng)激過程中，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡蛋白caspase 3、caspase 9、caspase 12，從而啟動(dòng)凋亡過程。通過對(duì)caspase 3、caspase 9、caspase 12三種凋亡蛋白激活片段caspase 3（17 kD）、caspase 9（37 kD）、caspase 12（36 kD）的檢測，驗(yàn)證CS-SeNPs對(duì)caspase激活的抑制作用。圖6顯示，抵抗模型細(xì)胞caspase活性顯著增高，而經(jīng)藥物處理CS-SeNPs 1（38.1 nmol/L）和CS-SeNPs 2（381 nmol/L），顯著抑制caspase的激活，進(jìn)一步驗(yàn)證CS-SeNPs的抗凋亡活性。

圖6 CS-SeNPs對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白活性的影響

2.7 胰島HE染色結(jié)果

圖7為糖尿病模型小鼠治療4周后胰腺HE染色結(jié)果。如圖7-A所示二型糖尿病模型組，胰腺細(xì)胞胞質(zhì)較少，胰島增大，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮壞死樣，顏色加深，散亂的分布于胰島中，且有不同程度的空泡樣變。具有外分泌功能的腺泡細(xì)胞可見變性和壞死。圖7-B為CS-SeNPs治療組，胰島邊緣較清晰，胰島細(xì)胞核有少量變形，細(xì)胞分布較均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，胞漿較豐富，病癥較模型組明顯減輕。

3 討論

目前已有多種方法可用于制備SeNPs，包括氣相蒸發(fā)凝聚法、無外源調(diào)控液劑相法、有外源調(diào)控劑液相法。其中有外源調(diào)控劑液相法，通過還原劑的選擇、陳化條件及時(shí)間的調(diào)整，可有效調(diào)控納米粒子形貌。在此基礎(chǔ)上，通過在制備的納米粒子表面連接不同材料，可增加納米粒子的溶解性、吸附性，還可以通過靜電吸附、共價(jià)偶聯(lián)等方式連接蛋白、化學(xué)藥物，改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性。本課題組主要目的在于在SeNPs表面覆蓋CS，由于CS自帶大量正電荷，大大提高SeNPs表面電荷水平，進(jìn)而提高納米粒子穩(wěn)定性。通過對(duì)還原劑濃度、陳化條件的調(diào)整，制備了粒徑均勻，高表面電荷CS-SeNPs顆粒，經(jīng)檢測，穩(wěn)定保存時(shí)間可達(dá)3個(gè)月，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的藥品來源。

圖7 胰島組織HE染色結(jié)果

已有文獻(xiàn)報(bào)道，我們?nèi)梭w內(nèi)存在許多還原性的含硒酶類，這些酶可有效降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，而它們的活性與體內(nèi)硒濃度息息相關(guān)，補(bǔ)充硒酸鹽可以增加這些酶的活性。而無機(jī)硒酸鹽可直接激活TrxR［12］，所以本課題組的研究方向就放在了對(duì)TrxR的激活上。前文提到SeNPs的生物學(xué)活性主要在于降低了毒性，有利于成為藥物，通過檢測我們選擇了一個(gè)遠(yuǎn)低于毒性劑量的CS-SeNPs濃度。通過對(duì)含硒蛋白活性的檢測，發(fā)現(xiàn)CS-SeNPs可有效激活細(xì)胞內(nèi)TrxR的活性，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，發(fā)揮抗凋亡活性。在糖尿病領(lǐng)域，從長期來看，由于細(xì)胞ROS水平升高造成的胰島β細(xì)胞凋亡是二型糖尿病發(fā)展的主要病因，在周圍組織以及肝臟等器官，由于脂肪的胞內(nèi)積累、高糖高脂外環(huán)境，以及高糖高脂誘發(fā)的炎癥都會(huì)升高胞內(nèi)的ROS水平。因此降低細(xì)胞ROS水平，對(duì)于延緩糖尿病進(jìn)程，以及輔助常規(guī)藥物治療二型糖尿病保護(hù)胰島β細(xì)胞功能以及保護(hù)周圍組織方面將具有良好的應(yīng)用前景。

在糖尿病藥物研究中，往往關(guān)注藥物在及時(shí)改善疾病指標(biāo)中的作用。然而像糖尿病這樣一類慢性病，尤其是發(fā)生了胰島素抵抗，比較嚴(yán)重的患者，短期的治療可以迅速改善某些疾病指標(biāo)，但難以迅速從根本上扭轉(zhuǎn)相關(guān)組織的器質(zhì)性病變。如果想徹底治愈糖尿病，扭轉(zhuǎn)相關(guān)組織的器質(zhì)性病變，恢復(fù)其響應(yīng)人體信號(hào)功能，減輕胰島素抵抗十分重要。簡單刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素或促進(jìn)周圍組織吸收葡萄糖，增強(qiáng)病態(tài)細(xì)胞功能有可能對(duì)細(xì)胞造成新的損傷，在治療時(shí)應(yīng)考慮保護(hù)細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞活性作為藥物治療的輔助措施。SeNPs具有保護(hù)細(xì)胞避免凋亡的活性作用，具有潛在的長期的治療價(jià)值。保護(hù)組織細(xì)胞避免凋亡，恢復(fù)其正常體內(nèi)信號(hào)響應(yīng)，扭轉(zhuǎn)相關(guān)組織的器質(zhì)性病變相關(guān)藥物有可能成為以后藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。

4 結(jié)論

相對(duì)于硒酸鹽，CS-SeNPs具有顯著的高效低毒特點(diǎn)，初步解決了毒性問題，并且能通過激活TrxR降低胞內(nèi)ROS抑制凋亡蛋白的激活，有效降低胰島β細(xì)胞凋亡，具有成為二型糖尿病治療藥物的潛力。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effect and Mechanism of Selenium Nanoparticle Against Islet β Cell Apoptosis

RAO Lei1RAO Min2QIU Hong-hong1LI Hong-hui1LIU Jing1ZHUANG Man-jiao3
（1. Biomedical Science，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；2. Bengbu 94565 Troops Medical Corp，Bengbu 233000；3. College of Life Science，Guangzhou University，Guangzhou 510006）

The purpose of this research was to study the effect and molecular mechanism of selenium nanoparticles（SeNPs）in the treatment of islet β cell apoptosis in type 2 diabetes mellitus. Electron microscope and nanoparticle size analyzer were used to identify SeNPs surface morphology，and relevant molecular biological techniques were used to validate the protection effect and mechanism of SeNPs on islet β cells apoptotic model. Results showed that the surface charge of selenium nanoparticle decorated by chitosan（CS）increased to 24.8 mv，and its storage time was extended to over 100 days. Cytology results showed that SeNPs under 2 μmol/L had no toxicity. Meanwhile，SeNPs in 38.1 nmol/L activated TrxR activity and reduced intracellular ROS level，which led to apoptotic model cells survival rate significantly increased 31.75%. Furthermore，the animal experiments also verified that SeNPs could resist the apoptosis of islet cell β. In conclusion，SeNPs may eliminate the apoptosis of islet cell β in type 2 diabetes mellitus，which shows a potential therapeutic activity in the treatment of type 2 diabetes.

selenium nanoparticle；type 2 diabetes mellitus；oxidative stress；molecular mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.035

2016-07-04

四川養(yǎng)老中心項(xiàng)目（YLZBZ1517）

饒磊，男，博士研究生，講師，研究方向：納米藥物；E-mail：591617735@qq.com

莊滿嬌，女，博士研究生，研究方向：藥理；E-mail：519797252@qq.com