脂環(huán)酸芽孢桿菌A1的分離鑒定及其對中低品位磷礦的溶磷研究

李凌凌 呂早生 楊忠華 左振宇 李堯益

（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，武漢 430081）

脂環(huán)酸芽孢桿菌A1的分離鑒定及其對中低品位磷礦的溶磷研究

李凌凌 呂早生 楊忠華 左振宇 李堯益

（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，武漢 430081）

微生物溶磷技術(shù)為充分利用我國豐富但難選的中低品位磷礦開辟了一條新的途徑。旨在篩選出針對中低品位磷礦的高效溶磷菌，從湖北宜昌磷礦的酸性礦坑水中分離出一株兼性嗜酸異養(yǎng)菌A1。經(jīng)菌株形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)和16S rDNA序列分析，鑒定屬于Alicyclobacillus aeris。分析A1菌在4 種不同培養(yǎng)基的生長及浸磷情況，結(jié)果顯示，菌株A1在YSG培養(yǎng)基中生長及溶解中低品位磷礦的情況最佳，其中磷的浸出率高達(dá)77.22%，與無菌對照的化學(xué)浸出相比約提高了62%。根據(jù)原始磷礦和A1菌在YSG培養(yǎng)基中溶解的磷礦礦渣的物相分析及相應(yīng)浸礦液的高效液相色譜檢測，結(jié)果表明，A1菌發(fā)酵有機(jī)碳源代謝產(chǎn)生以草酸和檸檬酸為主的混合有機(jī)酸，磷礦石中的氟磷灰石、碳氟磷灰石經(jīng)過這些有機(jī)酸的溶解，析出可溶性磷酸鹽并同時生成石膏。

銅礦脂環(huán)酸芽孢桿菌；分離；鑒定；中低品位磷礦；生物浸出

我國的磷礦資源豐富，但是絕大部分都是中低品位磷礦。面臨磷礦資源逐漸貧化和短缺的危機(jī)，要實現(xiàn)磷化工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，積極開展環(huán)境友好的中低品位磷礦資源利用無疑是必由之路［1］。然而，使用傳統(tǒng)的礦物加工或化學(xué)方法來處理中低品位磷礦非常困難而且會造成環(huán)境污染。微生物溶磷技術(shù)由于具有反應(yīng)溫和、環(huán)境友好、能耗低、成本廉、流程短、操作簡單等優(yōu)點［2］，為充分利用我國優(yōu)質(zhì)而廉價的磷礦資源開辟了一條新的途徑。

高效的溶磷菌是決定中低品位磷礦的生物溶磷效果的關(guān)鍵。脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus）又稱嗜酸耐熱菌，營養(yǎng)類型為異養(yǎng)型或兼性異養(yǎng)型，廣泛分布于熱泉、火山口附近土壤等地?zé)岘h(huán)境和礦山的酸性礦坑水、果園土壤、酸性果汁飲料等酸性環(huán)境中［3］。現(xiàn)在，對于Alicyclobacillus屬細(xì)菌的研究工作主要圍繞在食品科學(xué)領(lǐng)域。隨著發(fā)現(xiàn)該屬細(xì)菌不僅可以輔助其他浸礦菌浸出硫化礦，而且可作為主要的浸礦菌進(jìn)行硫化礦和非硫化礦的浸出［3-5］，Alicyclobacillus屬細(xì)菌在生物冶金領(lǐng)域中的作用逐漸凸顯出來，尤其是該屬細(xì)菌嗜酸耐熱且可利用多種有機(jī)碳源底物生成有機(jī)酸，因此，在非硫化礦的浸出方面的應(yīng)用潛力不容小覷。但是，目前這方面的研究工作仍只處于起步階段，相關(guān)的研究報道很少。

本研究從酸性礦坑水中分離鑒定一株兼性異養(yǎng)型脂環(huán)酸芽孢桿菌A1，首次將此菌株應(yīng)用于中低品位磷礦的溶解，探尋適合此菌株溶解磷礦的培養(yǎng)基，初步分析此菌株溶解磷礦的機(jī)理，旨在篩選出針對中低品位磷礦的高效溶磷菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶和化學(xué)試劑 TaKaRa LA TaqTMpolymerase、pMD18-T載體連接試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA Marker、loading buffer、dNTP mixture、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA純化試劑盒及質(zhì)粒小提中量試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；引物合成和測序工作由武漢鼎國生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.2 礦樣 實驗用磷礦和黃鐵礦均由西部礦業(yè)集團(tuán)湖北宜昌磷礦提供。礦石經(jīng)過粗破碎、細(xì)磨過篩后，取200目的粒度。磷礦石和黃鐵礦的礦物組成分別見表1和表2。

1.1.3 培養(yǎng)基 用于培養(yǎng)A1菌的9K培養(yǎng)基［6］、K氏培養(yǎng)基［3，7，8］、YSG培養(yǎng)基［3，7，8］、402培養(yǎng)基［7］及AAM培養(yǎng)基［9］成分見表3。用于A1菌溶解磷礦的培養(yǎng)基為加入10.0 g/L的磷礦粉的YSG培養(yǎng)基、K氏培養(yǎng)基、AAM培養(yǎng)基或無KH2PO4的402培養(yǎng)基。

表1 實驗用磷礦樣品的主要化學(xué)組成（wt.%）

表2 實驗用黃鐵礦樣品的主要化學(xué)組成（wt.%）

表3 用于培養(yǎng)脂環(huán)酸芽孢桿菌A1菌的培養(yǎng)基及其成分

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集分離及純化 取湖北省宜昌磷礦的酸性礦坑水1.0 mL接種到含10.0 g/L黃鐵礦和10.0 g/L磷礦的100 mL無磷無鐵9K液體培養(yǎng)基中（即不加入K2HPO4及FeSO4·7H2O的9K培養(yǎng)基），30℃培養(yǎng)，接著每隔2周按10%的接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)液到黃鐵礦和磷礦的量逐漸加大的（依次為15.0、20.0、25.0、30.0和35.0 g/L）無磷無鐵9K液體培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化。取最后馴化的菌液1.0 mL接種于100 mL異養(yǎng)型9K液體培養(yǎng)基（即添加0.02%酵母抽提物的9K培養(yǎng)基）［10］，反復(fù)培養(yǎng)幾代后，涂布于異養(yǎng)型9K固體培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)2-3 d后劃線純化，直至在顯微鏡下看到的細(xì)菌形態(tài)大小基本一致，最終得到純菌株，命名為A1。

1.2.2 菌種鑒定 菌株的個體形態(tài)觀察：革蘭氏染色及芽孢染色參照袁亞宏［11］等方法。菌株的生理生化特征：各項生理生化指標(biāo)的測定參考Guo等［12］進(jìn)行操作。菌株的生長條件分析：為了研究溫度和培養(yǎng)基的pH對菌株生長的影響，培養(yǎng)在AAM培養(yǎng)基中的對數(shù)期菌株A1以10%的接種量接種到一組液體AAM培養(yǎng)基（pH3.5）中，分別置于20、25、30、35、40和45℃下培養(yǎng)24 h，檢測培養(yǎng)液的OD600值。另外，分別配制一組液體AAM培養(yǎng)基，其中pH值分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0和8.0，再以10%的接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)在AAM培養(yǎng)基中的對數(shù)期菌株A1于上述培養(yǎng)基中，置于30℃下培養(yǎng)24 h，觀測培養(yǎng)液的OD600值。16S rDNA的擴(kuò)增測序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：菌株A1的基因組DNA提取參照李凌凌等［13］方法。以菌株A1的基因組DNA為模板，利用正向引物Pf：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和反向引物Pr：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'（這兩個引物分別對應(yīng)于大腸桿菌的16S rDNA的7-27位和1525-1542位堿基），來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：菌體A1的基因組DNA 2 μL，10×Taq DNA聚合酶緩沖液5 μL，引物Pf（2.5 μmmol/L）10 μL，引物Pr（2.5 μmmol/L）10 μL，4×dNTP混合物（2.5 mmol/L）5 μL，Taq聚合酶（2 U/μL）0.5 μL，無菌水補(bǔ)至50 μL。A1菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min［14］。根據(jù)pMD18-T載體連接試劑盒說明書，將A1菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，構(gòu)建重組載體pMD18-A1，由武漢鼎國生物技術(shù)有限公司完成該質(zhì)粒上的16S rDNA的測序。根據(jù)A1菌及其相近種屬的16S rDNA基因序列，采用Mega 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析［14］。

1.2.3 中低品位磷礦的微生物浸出 以10%的接種量接種對數(shù)期的菌株A1到100 mL的4種浸礦培養(yǎng)基（250 mL錐形瓶）中，置于30℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩。空白對照為接種10%的無菌水的浸礦培養(yǎng)基，以分析浸礦培養(yǎng)基的化學(xué)浸出作用。每4 d取1 mL浸出液，采用磷鉬黃比色法測定其中可溶性磷的含量，由此計算磷的浸出率［14］，取樣損失的浸出液用相同體積的浸礦培養(yǎng)基補(bǔ)充，并采用稱重法定期補(bǔ)充揮發(fā)水分，實驗重復(fù)3次，取平均值。浸礦實驗完成后，過濾浸出液，從中收集磷礦礦渣，用無菌水洗滌礦渣2-3次并烘干，再分別利用X射線衍射儀（Philips X' Pert Pro MPD）、元素分析儀（Elementar Vario EL III）、掃描式電子顯微鏡（Philips Nova400NanoSEM）及能譜儀（Bruker Nano xFlash Detector 410-M）分析礦渣的物相、化學(xué)組成和表面形貌。另外，上述浸出液經(jīng)離心收集的上清液（10 000 r/min，離心15 min），利用高效液相色譜儀（安捷倫1100）分析其中的有機(jī)酸成分，采用的色譜柱是SB-C18反相柱（4.6×150 mm，填料為粒徑5 μm的烷基化硅膠）。操作條件為：柱溫30℃，檢測波長215 nm，進(jìn)樣體積5 μL，流速0.5 mL/min，流動相為3%甲醇-0.01 moL/L K2HPO4（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.86）。

2 結(jié)果

2.1 菌株A1的鑒定

2.1.1 菌株A1的個體形態(tài)特征 在光學(xué)顯微鏡下，菌株A1呈桿狀，可游動、旋轉(zhuǎn)，革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色為綠色，呈陽性。在掃描電鏡下，菌體呈長桿狀，大小約為（2.0-6.0）μm×（0.8-1.0）μm，如圖1所示。

2.1.2 菌株A1的菌落形態(tài) A1菌在K氏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，形成直徑為0.5-1.0 mm的圓形的黃褐色菌落，中心凸起，邊緣規(guī)則，光滑，濕潤且與培養(yǎng)基結(jié)合較為緊密。而A1菌在AAM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后形成的菌落為：直徑為1.0-2.0 mm的圓形、不透明、乳白色、扁平、邊緣呈規(guī)則圓形、光滑、濕潤且易于挑取。A1菌在AAM半固體培養(yǎng)基的穿刺試驗結(jié)果顯示，菌體僅在培養(yǎng)基表面生長，且在穿刺部位的四周呈云霧狀生長，由此可知A1菌專性好氧，可運(yùn)動。

圖1 菌株A1的電鏡照片（10 000×）

2.1.3 菌株A1的生理生化特征 如表4所示，菌株A1的接觸酶為陰性。菌株A1能產(chǎn)生胞外的脂肪酶、明膠酶，但不能產(chǎn)生胞外的淀粉酶及尿素酶，不能水解酪素。A1菌可以還原硝酸鹽生成亞硝酸鹽，可以水解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（胱氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸）生成H2S，但是不能發(fā)酵葡萄糖生成乙酰甲基甲醇，也不能產(chǎn)生色氨酸酶分解色氨酸為吲哚。除了不能利用肌醇外，菌株A1能夠利用葡萄糖、甘油、甘露醇、蔗糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D/L-阿拉伯糖、D-木糖等有機(jī)物作為唯一碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長，而且除D-阿拉伯糖、肌醇之外，菌株A1還可以發(fā)酵葡萄糖、甘油、甘露醇、蔗糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、L-阿拉伯糖及D-木糖產(chǎn)酸。另外，A1菌還可以氧化亞鐵、硫粉或黃鐵礦進(jìn)行自養(yǎng)生長，說明A1菌是一種兼性異養(yǎng)菌。在添加了5% NaCl的AAM培養(yǎng)基上，可觀察到A1菌的生長明顯受到了抑制。

當(dāng)菌株A1培養(yǎng)在AAM液體培養(yǎng)基中時，在25-40℃的溫度范圍內(nèi)都可以較好地生長，其中在30℃下生長得最好（圖2），在低于25℃，高于40℃的條件下，光學(xué)顯微鏡下未觀察到菌體A1生長的跡象。菌體A1在pH值為2.0-6.0的AAM液體培養(yǎng)基中均可生長，最適生長的pH值為3.5（圖3），當(dāng)pH＜2.0和pH＞6.0時，菌體A1未見生長。

2.1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以菌株A1提取出的基因組DNA為模板，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖4）顯示，PCR產(chǎn)物位于1 200-2 000 bp之間，此點與目標(biāo)序列長度約1 500 bp相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后，連接到pMD18-T質(zhì)粒上，構(gòu)建重組載體pMD18-A1。將重組載體送交武漢鼎國生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，獲得一段長1 622 bp的核苷酸序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的VecScreen功能去除測序結(jié)果中的載體序列后，得到長度為1 522 bp的菌株A1的16S rDNA序列，將此序列提交到EMBL bank中，獲登錄號為LT158297。利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的BlastN功能進(jìn)行核苷酸比對，結(jié)果（圖5）顯示菌株A1與銅礦脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus aeris）的親緣關(guān)系最接近，菌株A1的16S rDNA基因與A. aeris ZJ-6和NBRC104953的一致性都達(dá)到99%。根據(jù)16S rDNA序列的相似性，利用Clustal Omega和Mega 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可見菌株A1在系統(tǒng)發(fā)育上也最接近于A. aeris，相似性為99%。

表4 菌株A1的生理生化特征

2.1.5 鑒定結(jié)論 綜合上述的形態(tài)學(xué)特性、生理生化特征和分子遺傳學(xué)結(jié)果，得出：從湖北宜昌磷礦的酸性礦坑水中分離得到的A1菌為可以產(chǎn)生芽孢的可游動的專性好氧的長桿狀革蘭氏陽性菌，能夠利用多種有機(jī)碳源并產(chǎn)酸，也可以氧化無機(jī)物Fe2+、S0、FeS2生長，營養(yǎng)類型為兼性異養(yǎng)型。該菌適宜生長的溫度為25-40℃，最適溫度為30℃，適于生長的pH值范圍為2.0-6.0，最適pH值為3.5。16S rDNA序列的分子遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示A1菌與銅礦脂環(huán)酸芽孢桿菌（A. aeris）的相似性達(dá)到99%。根據(jù)菌株A1的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，推斷菌株A1屬于A. aeris，命名為A. aeris A1。

圖2 溫度對菌株A1生長的影響

圖3 pH對菌株A1生長的影響

圖4 A1菌16S rDNA基因的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 A1菌在不同培養(yǎng)基中的生長及溶磷情況

將生長在AAM液體培養(yǎng)基中處于對數(shù)期的菌株A1接種至4種pH為3.5的培養(yǎng)基（YSG、K氏、AAM及402培養(yǎng)基），在30℃下培養(yǎng)，每隔一段時間檢測培養(yǎng)液的OD600。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制菌株A1在這4種培養(yǎng)基中的生長曲線，如圖6-A所示，菌株A1在這4種培養(yǎng)基中，都經(jīng)過12 h的延滯期后進(jìn)入到對數(shù)期，在48 h進(jìn)入到穩(wěn)定期，大約到72 h，生長達(dá)到最高峰。另外，比較A1菌在4種培養(yǎng)基中可以達(dá)到的最大菌體濃度的大小，排序結(jié)果為：YSG培養(yǎng)基＞AAM培養(yǎng)基＞K氏培養(yǎng)基＞402培養(yǎng)基。

圖6-B顯示了菌株A1在4種pH為3.5的培養(yǎng)基（YSG、K氏、AAM及402培養(yǎng)基）中溶解中低品位磷礦時磷的浸出率的變化趨勢。從圖中可見，菌株A1在4種培養(yǎng)基中可以達(dá)到最高的磷的浸出率有排序為：YSG培養(yǎng)基＞AAM培養(yǎng)基＞K氏培養(yǎng)基＞402培養(yǎng)基。其中，菌株A1在YSG培養(yǎng)基中溶解中低品位磷礦12 d后，磷的浸出率可以高達(dá)77.22%。然而，A1菌在402培養(yǎng)基中的浸磷率卻很低，浸出12 d的浸出率僅為23.27%。另外，對比生物浸出和化學(xué)浸出的浸磷率，可見無菌對照的浸出率很低，經(jīng)過12 d的浸出僅僅約為15%，生物浸出的浸磷率要比無菌對照高得多，說明中低品位磷礦的溶解絕不僅僅是一個化學(xué)過程，其中菌體的活動在整個溶解過程中起到了決定性的作用。

從浸礦液的pH值隨著溶解過程的變化趨勢（圖6-C）可以看出，A1 菌在不同培養(yǎng)基中溶解磷礦形成的浸礦液pH值的排序為：YSG培養(yǎng)基＜AAM培養(yǎng)基＜K氏培養(yǎng)基＜402培養(yǎng)基。結(jié)合圖6-B分析可知，磷的浸出率與浸礦液的pH值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。例如，磷的浸出率較高的YSG培養(yǎng)基和AAM培養(yǎng)基，其pH值較低；磷的浸出率較低的402培養(yǎng)基，其pH值相對較高，說明pH值越低的培養(yǎng)基的溶磷效果越好，也就是說磷礦的溶解依賴于浸出體系中的質(zhì)子濃度，是一個耗酸的過程。

圖5 根據(jù)16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

另外，通過血細(xì)胞計數(shù)板測量A1菌在不同培養(yǎng)基中溶解4 d的浸礦液中的細(xì)胞濃度并比較大小，結(jié)果如下：YSG培養(yǎng)基（5.67×108個/mL）＞ AAM培養(yǎng)基（1.14×108個/mL）＞K氏培養(yǎng)基（7.52×107個/mL）＞402培養(yǎng)基（3.09×106個/mL），由此可知：磷的浸出率與A1菌在培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度呈正相關(guān)性，這是因為在菌體生長較好的培養(yǎng)基中，菌體發(fā)酵有機(jī)物產(chǎn)生的有機(jī)酸濃度相應(yīng)較高，觀測到的pH值較低，由于磷礦的溶解是一個消耗質(zhì)子的過程，浸出液的pH決定了磷礦中磷的浸出率，因此，

菌體濃度越大的培養(yǎng)基中浸磷率較高。

2.3 A1菌溶解中低品位磷礦的機(jī)理

2.3.1 A1菌溶解磷礦的殘渣分析 通過比較標(biāo)準(zhǔn)（International Center for Diffraction Data Powder Diffraction files，簡稱ICDD）文件15-0876［氟磷灰石，Ca5（PO4）3F］、21-0141［碳氟磷灰石，Ca10（PO4）5CO3F1.5（OH0.5）］、11-0078［白云石，CaMg（CO3）5］、01-0649（石英，SiO2）、24-0076（黃鐵礦，F(xiàn)eS2）和磷礦的XRD 圖譜（圖7-A）發(fā)現(xiàn)，原始的磷礦主要由氟磷灰石和碳氟磷灰石組成，其中還含有白云石、石英和黃鐵礦等礦物。這點與王樹林等［15］所述“宜昌磷礦的主要工業(yè)礦物為隱晶質(zhì)膠磷礦、脈石礦物主要為碳酸鹽類礦物、石英、粘土類礦物和鐵-碳質(zhì)礦礦物等”相一致。觀察在YSG培養(yǎng)基和402培養(yǎng)基中菌株A1溶解的磷礦濾渣樣品的XRD檢測圖（圖7-B和C）發(fā)現(xiàn)，與原始磷礦的XRD分析圖不同，生物浸出的礦渣的XRD圖中出現(xiàn)了一些新的衍射峰，其既不同于氟磷灰石、碳氟磷灰石，也不同于白云石、石英和黃鐵礦。根據(jù)ICDD文件06-0047，這些衍射峰是石膏（CaSO4·2H2O），也就是說在菌株A1溶解磷礦的過程中有石膏晶體生成，這點也被SEM-EDS分析證實：A1菌在YSG培養(yǎng)基中溶解磷礦的殘渣中存在一些交聯(lián)度很低的棱鏡狀的晶體，該晶體的主要組成元素為Ca、S和O，其中Ca/S比約為1.0（圖8-B3和B4）。經(jīng)過掃描電鏡下的觀察，發(fā)現(xiàn)A1菌在402培養(yǎng)基溶解的礦渣中，沒有明顯針狀或棱鏡狀的石膏晶體。此礦渣的XRD分析圖中石膏晶體的峰也相對較弱。利用這些礦渣的XRD分析圖譜中石膏與氟磷灰石的比峰高來表示礦渣中的石膏的相對豐度［16］，如表5所示，可見菌體A1 在YSG培養(yǎng)基中溶解磷礦時形成的石膏的比峰高要遠(yuǎn)高于402培養(yǎng)基。

圖6 A1菌在不同培養(yǎng)基中的生長及溶磷情況

另外，EDS分析原始磷礦和經(jīng)A1菌溶解的磷礦礦渣中的磷灰石成分的結(jié)果顯示：生物浸出后的磷礦渣中的Ca/P比原始磷礦提高了，而且YSG培養(yǎng)基中生物浸出的殘渣的Ca/P要比402培養(yǎng)基中的要高（圖8-A2、B2和C2）。根據(jù)礦渣的元素分析結(jié)果，磷礦經(jīng)A1菌的溶解后，P元素含量（9.6%）有所下降，其中YSG培養(yǎng)基中生物浸出的殘渣中的P元素含量（2.765%）比402培養(yǎng)基中（7.134%）低得多，也進(jìn)一步說明：與YSG培養(yǎng)基相比，菌體A1在402培養(yǎng)基中溶解中低品位磷礦的效果要差。

2.3.2 A1菌浸礦液的有機(jī)酸組成分析 微生物的溶磷作用被普遍認(rèn)為主要是由于微生物的生長過程中分泌的有機(jī)酸不僅能夠?qū)⒘姿崛}、磷酸鋁、磷酸鐵等難溶性磷酸鹽溶解，而且有機(jī)酸中的羥基、羧基能夠?qū)﹄y溶性磷酸鹽中的金屬離子進(jìn)行螯合而釋放出磷酸根離子［17］。因此，分析A1菌的浸出液中的有機(jī)酸成分，有利于理解該菌溶解磷礦的機(jī)理。圖9顯示，A1菌在YSG培養(yǎng)基中溶解磷礦的浸出液中含有5種有機(jī)酸，分別為草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸和檸檬酸。然而，A1菌在402培養(yǎng)基中浸礦形成的浸出液僅有4種有機(jī)酸，未檢出檸檬酸。將系列濃度梯度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣后，繪制出液相色譜峰面積與各種有機(jī)酸濃度的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此計算出兩種浸礦液中各種有機(jī)酸的濃度（表6），可知YSG培養(yǎng)基浸出液中的有機(jī)酸以草酸和檸檬酸為主，其中濃度最高的為檸檬酸（122.68 mg/L）。對比YSG和402培養(yǎng)基的浸出液中的有機(jī)酸含量，YSG培養(yǎng)基的浸出液中所有的有機(jī)酸濃度都遠(yuǎn)高于402培養(yǎng)基的浸出液，這點解釋了A1菌在這兩種培養(yǎng)基中磷的浸出率存在較大的差異的原因，說明中低品位磷礦的生物浸出是一個依賴于酸的溶解過程。

圖7 原始磷礦和生物浸出的磷礦殘渣的XRD檢測圖

表5 原始磷礦和生物浸出的磷礦殘渣的XRD峰的比峰高

綜合A1菌在YSG培養(yǎng)基中溶解的礦渣的物相分析和相應(yīng)浸礦液的高效液相色譜檢測結(jié)果，推測菌株A1溶解中低品位磷礦生成石膏的過程為［18-20］：

（1）菌株A1發(fā)酵有機(jī)物（如葡萄糖、酵母抽提物或可溶性淀粉等），代謝產(chǎn)酸，其中以草酸和檸檬酸為主。

（2）磷礦石中的磷酸鹽礦物（氟磷灰石和碳氟磷灰石）被酸溶解生成可溶性磷H2PO4-和Ca2+（公式1和2），另外，磷礦中的脈石礦物白云石也被酸溶解產(chǎn)生Ca2+（公式3）。

（3）溶出的Ca2+與浸出液中的硫酸鹽反應(yīng)生成石膏，如公式4所示。

3 討論

脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus）又稱嗜酸耐熱菌，具有廣泛的底物利用特性，營養(yǎng)類型為異養(yǎng)型或兼性異養(yǎng)型，廣泛分布于熱泉、火山口附近土壤等地?zé)岘h(huán)境和礦山的酸性礦坑水、果園土壤、酸性果汁飲料等酸性環(huán)境中。由于Alicyclobacillus屬中的一些細(xì)菌（如酸土芽孢桿菌）會引起果汁的腐敗，且采用傳統(tǒng)的巴氏殺菌難以將其徹底去除。因此，目前對于該菌的研究主要集中于食品科學(xué)領(lǐng)域。但是，近年來，隨著很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)該菌可以氧化Fe2+、元素硫以及硫化礦，它在生物冶金中的潛力被不斷挖掘出來：（1）Alicyclobacillus屬細(xì)菌可以用于硫化礦的浸出，如：2008年，Yahya等［5］發(fā)現(xiàn)Alicyclobacillus GSM菌處理2%的黃鐵礦24 d后，浸出的鐵濃度可以達(dá)到5 g/L。（2）Alicyclobacillus屬細(xì)菌還可以協(xié)同其他浸礦菌浸出硫化礦，如：2008年，吳學(xué)玲等［4］報道從云南騰沖酸性熱泉中分離獲得的Alicyclobacillus TC-2菌本身對黃銅礦沒有浸礦能力，但是能夠?qū)cidianus manzaensis、Sulfolobus metallicus和Metallosphaera sedula等高溫浸礦菌浸出黃銅礦有顯著的促進(jìn)作用。（3）Alicyclobacillus屬細(xì)菌還可以作為主要的浸礦菌進(jìn)行非硫化礦的浸出。如：張小霞等［3］利用Alicyclobacillus BM菌以黃鐵礦為能源物質(zhì)浸出軟錳礦1 d后，錳和鎳的浸出率可以分別達(dá)到97.7%和95.8%。盡管很多學(xué)者意識到Alicyclobacillus屬細(xì)菌的研究工作對于構(gòu)建高效協(xié)同的浸礦菌群、提高浸礦效率等有著極其深遠(yuǎn)的意義，但是該菌在硫化礦及非硫化礦上的浸出研究現(xiàn)在仍處于初步階段，尤其是目前國內(nèi)外未見脂環(huán)酸芽孢桿菌溶解磷礦的研究報道。Alicyclobacillus屬細(xì)菌具有嗜酸耐熱的特性，能夠利用多種有機(jī)碳源底物生成有機(jī)酸，利用Alicyclobacillus屬細(xì)菌進(jìn)行中低品位磷礦的浸出具有不容忽視的應(yīng)用潛力。

圖8 原始磷礦和生物浸出的磷礦殘渣的SEM-EDS分析圖

圖9 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品和A1菌的浸礦液的高效液相色譜圖

表6 A1菌的浸礦液中的有機(jī)酸濃度

本研究從湖北宜昌磷礦的酸性礦坑水中分離獲得了一株銅礦脂環(huán)酸芽孢桿菌A1（Alicyclobacillus aeris）。脂環(huán)酸芽孢桿菌屬（Alicyclobacillus）于1922年建立，至今共有21種［21］。A. aeris這一種脂環(huán)酸芽孢桿菌在2009年由Guo等［12］首次分離獲得，目前，還未見其他關(guān)于這類細(xì)菌的分離鑒定的報道。A1菌與Guo等獲得的ZJ-6菌在最適生長溫度、最適pH、接觸酶、Vp反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生、明膠液化、淀粉水解、硝酸鹽還原、糖酵解、碳源利用、以硫粉與亞鐵為能源自養(yǎng)生長等生理生化特征上是基本一致的，但是A1菌也有自己獨特的生理生化特征，例如，能夠以黃鐵礦為能源進(jìn)行自養(yǎng)生長等，這種特質(zhì)顯示了該菌具有以黃鐵礦為能源進(jìn)行非硫化礦浸出的應(yīng)用潛質(zhì)。

本研究將A. aeris A1菌首次應(yīng)用于中低品位磷礦的溶解，并對比了4種培養(yǎng)基中菌體的生長及浸礦情況，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH和浸磷率有著顯著的負(fù)相關(guān)性，另外，菌體數(shù)量與浸磷率之間存在正相關(guān)性。銀婷婷［17］、趙小蓉［22］、Chen［23］的研究也證明pH和菌數(shù)在溶磷過程中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)磷礦溶解的殘渣及浸礦液的組成分析，本研究提出了A1菌溶解磷礦的過程為：A1菌能夠代謝培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源（如葡萄糖、酵母抽提物或可溶性淀粉等）產(chǎn)生有機(jī)酸（以草酸和檸檬酸為主）。接著，磷礦石中的磷酸鹽礦物（氟磷灰石和碳氟磷灰石）被有機(jī)酸溶解生成可溶性磷H2PO4-和Ca2+，另外，磷礦中的脈石礦物白云石也能被有機(jī)酸溶解產(chǎn)生Ca2+，最后，溶出的Ca2+會與浸出液中的硫酸鹽反應(yīng)生成石膏［18］，說明磷礦的溶解是一個依賴于浸出體系中的質(zhì)子濃度的耗酸過程，而質(zhì)子濃度與菌體的代謝活動密切相關(guān)，這點解釋了浸礦體系的酸度和菌體數(shù)量在磷礦的生物浸出過程中發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié)論

本研究從湖北宜昌磷礦的酸性礦坑水中分離出一株兼性嗜酸異養(yǎng)菌A1。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析結(jié)果顯示A1菌歸屬于銅礦脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus aeris）。本研究首次將分離獲得的A. aeris A1菌應(yīng)用于中低品位磷礦的浸出，從4種培養(yǎng)基中選擇出最適合菌體生長及浸礦的YSG培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在YSG培養(yǎng)基中，該菌對中低品位磷礦有著較強(qiáng)的溶解能力，浸磷率最高達(dá)到了77.22%，比起無菌對照的化學(xué)浸出，提高了約62%。初步探索了此菌浸出磷礦的機(jī)理，根據(jù)浸出磷礦后的殘渣及浸礦液的組成分析，提出了A1菌溶解磷礦生成石膏的化學(xué)過程。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation and Identification of Alicyclobacillus A1 and Its Bio-solubilization of Middle- and Low-grade Rock Phosphates

LI Ling-ling Lü Zao-sheng YANG Zhong-hua ZUO Zhen-yu LI Yao-yi
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081）

Bio-solubilization of phosphorous has pioneered a novel approach to make full use of rich but refractory middle- and low-grade phosphate ores in China，and this work aims to screen high-efficiency phosphorous-solubilizing bacteria for utilization of middle- and low-grade phosphate ores. A facultative heterotrophic strain A1 was isolated from the acid mine drainage of Yichang phosphate mines of Hubei province，and was identified as Alicyclobacillus aeris according to its morphological，physiological and biochemical characteristics，and 16S rDNA sequence. For strain A1，YSG medium was optimal among four media regarding bacterial growth and its bio-solubilization of phosphorous from phosphate ores；the fraction of phosphorous leached by strain A1 reached 77.22%，which increased about 62% compared to chemical leaching of abiotic control. According to X-ray diffraction（XRD）analyses of raw phosphate ores and bioleached residues in YSG medium as well as high performance liquid chromatography of the leachate，soluble phosphates were released by dissolving fluorapatite and carbonate-fluorapatite in phosphate ores via organic acid mixture（mainly oxilic acid and citric acid）generated during the fermentation of strain A1 with organic carbon sources，and simultaneously gypsum was formed.

Alicyclobacillus aeris；isolation；identification；middle- and low-grade rock phosphates；bioleaching

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.026

2016-03-13

國家自然科學(xué)基金資助項目（21376184），國家級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410488011），湖北省自然科學(xué)基金項目（2014CFB802），湖北省科技廳基金項目（2009CDA006），武漢科技大學(xué)青年科技骨干項目（2016xz014）

李凌凌，女，博士，副教授，研究方向：微生物浸礦技術(shù)；E-mail：moonletsmile@163.com