極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis膜蛋白提取方法的建立及應(yīng)用

楊云劉紅昌夏金蘭，2馬亞龍聶珍媛，2

（1. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083；2. 中南大學(xué)教育部生物冶金重點實驗室，長沙 410083）

極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis膜蛋白提取方法的建立及應(yīng)用

楊云1劉紅昌1夏金蘭1，2馬亞龍1聶珍媛1，2

（1. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083；2. 中南大學(xué)教育部生物冶金重點實驗室，長沙 410083）

以萬座嗜酸兩面菌（Acidianus manzaensis）為研究對象，探索并優(yōu)化其膜蛋白提取方法，以優(yōu)化后的方法提取該菌分別以單質(zhì)硫（S0）和亞鐵（Fe2+）為能源底物進行生長時的膜蛋白質(zhì)，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）研究膜蛋白在兩種能源底物培養(yǎng)下的表達差異。首先通過80℃水浴60-70 min對A. manzaensis胞外黏附蛋白進行初步分離。其次比較了不同提取劑（Triton X-110，SDS和Triton X-114）對膜蛋白的提取效果，結(jié)果表明Triton X-114的提取效果較好，其最佳濃度為10%（w/v）；比較了不同沉淀劑（三氯乙酸（TCA），丙酮，三氯乙酸/丙酮，甲醇和乙醇）對膜蛋白質(zhì)沉淀的效果，結(jié)果表明TCA/丙酮的沉淀效果最不理想，會導(dǎo)致沉淀后低分子量蛋白發(fā)生缺失，而其他幾種沒有明顯差別，綜合比較選擇較常用的丙酮作為膜蛋白提取的沉淀劑。最后基于優(yōu)化后膜蛋白提取方法，分別對S0和Fe2+培養(yǎng)的A. manzaensis膜蛋白質(zhì)進行提取及SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子量為35.6 kD 和16.9 kD的蛋白只在A. manzaensis以S0生長時出現(xiàn)，表明這些蛋白質(zhì)很可能在A. manzaensis硫氧化中發(fā)揮了重要作用；分子量為72 kD 和26 kD的蛋白質(zhì)在A. manzaensis以Fe2+生長時比其以S0生長時顯著表達上調(diào)，表明此蛋白可能與A. manzaensis鐵氧化相關(guān)。

Acidianus manzaensis；膜蛋白提??；SDS-PAGE；鐵氧化；硫氧化

在我國，銅礦資源多數(shù)是以低品位硫化礦的形式存在，這些礦物用傳統(tǒng)冶煉工藝提取率低，對環(huán)境損害大，而且耗能嚴重。由于生物冶金技術(shù)特別適于貧礦、廢礦、外表礦及難采、難選、難冶礦的堆浸和就地浸出，并具有過程簡單、成本低、能耗低、對環(huán)境污染小等突出優(yōu)點，已在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用［1］。常見的冶金微生物可根據(jù)其最適生長溫度劃分為常溫微生物（30-40℃）、中度嗜熱微生物（40-60℃）和極端嗜熱微生物（80℃以上）［2］。目前常溫菌和中度嗜熱菌在工業(yè)上也有一定應(yīng)用，而極端嗜熱微生物應(yīng)用還較少［3，4］，由于嗜熱菌與嗜中溫菌相比具有耐高溫、提取速率快和浸出率高等特點，在工業(yè)應(yīng)用上有著較大的潛力［5，6］，因此對于嗜熱浸礦微生物的相關(guān)研究成為目前的熱點。

鐵和硫氧化活性對微生物的浸礦行為起著決定作用［7］，而膜蛋白也與微生物應(yīng)對環(huán)境、適應(yīng)環(huán)境、傳遞信息等方面密切相關(guān)［8］。已有研究表明，胞外親水蛋白以及膜疏水蛋白分別在微生物對硫的活化以及轉(zhuǎn)運和氧化過程中起到重要作用［9，10］。胞外硫活化相關(guān)蛋白質(zhì)因易分離，研究相對較多。我們之前基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)和基于同步輻射的原位巰基表征，驗證巰基（-SH）在硫活化中的重要作用［11］。但是膜蛋白相關(guān)的研究有限，而且這些研究主要集中在嗜中溫菌，對于嗜熱菌尤其是極端嗜熱菌的研究相對較少［12］。為了進一步開展極端嗜熱菌硫的轉(zhuǎn)運和氧化相關(guān)機理的研究，有必要對極端嗜酸熱古菌膜蛋白提取條件進行探索和優(yōu)化。

本文選擇研究較多的典型極端嗜酸熱古菌Acidianus manzaensis開展實驗探索并建立其膜蛋白提取方法。首先比較不同提取劑對膜蛋白的提取效果，接著比較常用沉淀劑對膜蛋白質(zhì)沉淀的效果，根據(jù)提取蛋白的SDS-PAGE結(jié)果選擇合適的提取劑和沉淀劑；并利用優(yōu)化的提取方法進一步開展S0， Fe2+能源底物培養(yǎng)下膜蛋白質(zhì)表達差異的研究，旨在為后續(xù)對膜蛋白的雙向電泳及膜蛋白相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑有苯甲基磺酰氟（PMSF），十二烷基肌氨酸鈉，Triton X-110，十二烷基硫酸鈉，SDS和Triton X-114，均購自于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。主要儀器，Mini-PROTEAN? Tetra Cell 系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories）。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培養(yǎng)基 實驗所用菌株A. manzaensis YN-25 由中南大學(xué)教育部生物冶金重點實驗室提供［13］，A. manzaensis YN-25的培養(yǎng)使用9K基礎(chǔ)培養(yǎng)基［14］［0.5 g/L，MgSO4·7H2O；0.5 g/L，K2HPO4；3.0 g/L，（NH4）2SO4；0.1 g/L，KCl；0.01 g/L，Ca（NO3）2］，添加0.02%（W/V）酵母浸出液作為碳源，分別加入10 g/L的S0、22 g/L的FeSO4·7H2O作為能源底物。菌在S0或Fe2+培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至2.0或1.6。在500 mL三角瓶中添加上述已接種培養(yǎng)基200 mL，置于空氣浴搖床中在65℃和170 r/min下培養(yǎng)，待菌生長至對數(shù)后期時，8 000×g離心15 min收集細胞，稀硫酸（pH2）洗滌除去雜質(zhì)，并懸浮菌體，制成在600 nm波長下的吸光值為1的懸液（1 cm比色皿），每份20 mL 分裝，8 000×g下離心10 min收集菌體備用。

1.2.2 胞外黏附蛋白粗略去除 A. manzaensis與S0和Fe2+的作用過程中胞外會黏附分泌蛋白，形成富含蛋白的莢膜層，對其進行粗略的去除有助于減少膜蛋白分離時的干擾，提高分離的效率。去除胞外黏附蛋白采取80℃水浴加熱，棄上清，8 000×g下離心10 min收集細胞，記錄處理時間和上清液中蛋白質(zhì)含量的對應(yīng)關(guān)系，根據(jù)上清液中蛋白質(zhì)的含量確定胞外黏附蛋白的最佳水浴時間。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度測定 使用碧云天生物技術(shù)研究所（http://www.beyotime.com）生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進行檢測。

1.2.4 SDS-PAGE上樣濃度的確定 為得到清晰可分辨的蛋白質(zhì)條帶，對以單質(zhì)硫為能源培養(yǎng)的A. manzaensis菌膜蛋白質(zhì)提取液梯度稀釋，稀釋后蛋白質(zhì)濃度分別為0.23、1.09、2.19、3.29和4.38 mg/mL，進行SDS-PAGE，根據(jù)蛋白質(zhì)條帶的清晰度確定最佳蛋白質(zhì)上樣濃度。

1.2.5 膜蛋白的不同提取方法 考慮到實驗設(shè)備的要求和操作可行性，參考Andreas Veith等［15］和夏金蘭等［16］膜蛋白的提取方法進行設(shè)計實驗。

1.2.5.1 Triton X-110和SDS提取法 （1）收集A. manzaensis 細胞，稀硫酸（pH2）洗滌，去除培養(yǎng)基成分。（2）加入1 mL緩沖液A（1 mmol/L PMSF，20 mmol/L PBS（pH7.4），0.5%（W/V）十二烷基肌氨酸鈉）懸浮細胞，使細胞裂解。（3）加入1 μL的DNase I 溶液至步驟 2）中所得懸浮液中。在 45℃下恒溫水浴 20 min后，13 000×g下離心10 min。倒掉上清后重復(fù)離心一次。（4）把下層沉淀重新懸浮于緩沖液 B［1 mmol/L PMSF，20 mmol/L PBS（pH7.4），0.5%（W/V）SDS］中。并于 45℃下恒溫水浴 20 min。離心去掉上層清液。（5）重復(fù)步驟（4），直至離心后的上層清液變得澄清。（6）棄上清，在沉淀中加入100 μL去離子水懸浮。

緩沖液B中的SDS更換為Triton X-100，即為SDS提取法。

1.2.5.2 Triton X-114膜蛋白提取法 （1）收集A. manzaensis 細胞，稀硫酸（pH2）洗滌，去除培養(yǎng)基成分。（2）將收集并洗滌過的菌體懸浮于 1 mL提取劑［1 mmol/L PMSF，20 mmol/L PBS（pH7.4），1% Triton X-114。］。（3）4℃恒溫2 h并搖動。4℃下8 000×g 離心5 min 去除不溶性的菌體，重復(fù)數(shù)次直至離心后無沉淀產(chǎn)生。（4）上清在37℃水浴恒溫30 min，3 000 r/min低速離心10 min 誘導(dǎo)有機相和水相分層。（5）下層有機相添加PBS緩沖液重復(fù)步驟（4）分離操作3次。最后收集分離到的有機相，加入9倍體積的丙酮，-20℃過夜沉淀蛋白質(zhì)。（6）將（5）中的液體在 13 000×g下離心10 min，棄上清，將沉淀溶于100 μL 去離子水中。

1.2.6 膜蛋白的SDS-PAGE［17］提取的蛋白質(zhì)樣品，透析24 h，真空冷凍干燥，-20℃保存。上樣前，用蒸餾水溶解適當(dāng)?shù)鞍讟悠凡y定濃度，蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合后煮沸 10 min 點樣。電泳采用12% 的分離膠（1.0 mL 去離子水，2.0 mL 30% Acr-Bis（29∶1），1.9 mL 1 mol/L Tris（pH8.8），0.05 mL 10% SDS，0.05 mL 10% 過硫酸銨，0.002 mL TEMED），5%的濃縮膠（1.2 mL 去離子水，0.33 mL 30% Acr-Bis（29∶1），0.25 mL 1 mol/L Tris（pH 6.8），0.02 mL 10% SDS，0.02 mL 10% 過硫酸銨，0.002 mL TEMED）。濃縮膠15 mA，分離膠25 mA至電泳結(jié)束，用加熱后的考馬斯亮藍（約60℃）染色1 h，脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰。

1.2.7 Triton X-114 最佳濃度的確定 配制含1%、5%、10% 及15% Triton X-114的提取劑，對單質(zhì)硫培養(yǎng)的A. manzaensis進行膜蛋白提取，探究不同濃度Triton X-114 對膜蛋白提取效果的影響，并對其蛋白提取物進行SDS-PAGE比較。

1.2.8 蛋白質(zhì)沉淀試劑的比較 提取的膜蛋白溶于Triton X-114的提取劑中，需要合適的試劑沉淀蛋白質(zhì)并且除去Triton X-114。實驗分別對常用的蛋白質(zhì)沉淀有機試劑做了比較，即三氯乙酸（TCA）、三氯乙酸丙酮、丙酮、甲醇、乙醇。

1.2.9 S0/Fe2+培養(yǎng)下A. manzaensis 膜蛋白表達差異研究 根據(jù)探索的提取條件分別對S0和Fe2+培養(yǎng)的A. manzaensis 細胞進行膜蛋白提取。比較兩種能源培養(yǎng)下A. manzaensis膜蛋白的表達差異。

2 結(jié)果

2.1 粗略除去干擾蛋白時間的確定

采用水浴加熱對A. manzaensis分泌蛋白進行粗略的去除以減少干擾，對處理時間和去除的上清液中蛋白質(zhì)含量作圖，尋找最佳時間。圖1顯示，在一定量細胞條件下，上清液中蛋白質(zhì)含量隨著水浴時間的增加而增加，水浴時間60 min后上清液中蛋白質(zhì)含量增幅明顯下降。為保證膜蛋白不被破壞同時又能對胞外蛋白初步去除，80℃水浴時間應(yīng)控制在60-70 min。

圖1 80℃水浴時間和上清液蛋白質(zhì)含量圖

2.2 SDS-PAGE上樣濃度確定

為得到清晰可分辨的蛋白質(zhì)條帶，對SDSPAGE上樣濃度進行了探索，結(jié)果（圖2）表明隨著樣品濃度的增加，各泳道的蛋白質(zhì)條帶在染色后顏色依次增加。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時（0.23 mg/mL），蛋白質(zhì)條帶顏色較淺，有的條帶不能顯現(xiàn)出來；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較高時（3.29和4.38 mg/mL），蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，分子量相近的蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)重疊，難以區(qū)分。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1.09和2.19 mg/mL時電泳結(jié)果相對較好。

綜上所述，在進行SDS-PAGE時，上樣蛋白質(zhì)濃度應(yīng)該控制在1-2 mg/mL，即每個上樣孔10-20 μg 蛋白質(zhì)以保證電泳結(jié)果的清晰程度和分辨能力。

圖2 不同蛋白質(zhì)濃度SDS-PAGE結(jié)果

2.3 提取劑的選擇

根據(jù)3種提取劑（表1），兩種操作方法提取的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示。SDS和Triton X-100 提取的膜蛋白含量極低，電泳后沒有任何的蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)，Triton X-114 提取的膜蛋白在SDSPAGE上有很好的反應(yīng)，不僅蛋白含量高，蛋白質(zhì)條帶也相對清晰。所以，選定方法Triton X-114為本研究的膜蛋白提取方法。

表1 不同提取劑的膜蛋白提取效果比較

圖3 不同方法提取膜蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

2.4 Triton X-114最佳濃度的確定

分別配制含1%、5%、10%和15% Triton X-114的提取劑，并對S0培養(yǎng)的A. manzaensis進行膜蛋白提取。在4個濃度下，隨著Triton X-114的濃度增加，提取到的膜蛋白含量也隨之增加，從圖4-A可以看出，實驗所用的細胞量是過量的。由SDS-PAGE結(jié)果（圖4-B）可以看出，隨著緩沖液中Triton X-114濃度的不同，其提取的膜蛋白種類也有所不同。當(dāng)Triton X-114濃度較低（1% 和 5%）時，提取的膜蛋白電泳條帶較少，應(yīng)為只提取了膜蛋白中豐度較高的蛋白；當(dāng)Triton X-114濃度為10%和15%時，兩者提取的膜蛋白種類相同。綜上所述，含 Triton X-114濃度為10%和15%的緩沖液能提取到較多的膜蛋白，且提取的膜蛋白種類相同。但是在實驗時，含15% Triton X-114的提取劑十分黏稠，在懸浮細胞和分離不溶性菌體步驟中不易操作，所以最終選擇合適的Triton X-114濃度為10%。

圖4 不同濃度Triton X-114對膜蛋白質(zhì)的提取效率的影響（A）及SDS-PAGE結(jié)果（B）

2.5 蛋白質(zhì)沉淀試劑的比較

不同蛋白沉淀劑［三氯乙酸（TCA）、丙酮、三氯乙酸/丙酮、甲醇和乙醇］對膜蛋白質(zhì)沉淀的效果如圖5所示。這5種沉淀劑都能有效沉淀蛋白質(zhì)并除去Triton X-114，對雙向電泳有較好應(yīng)用的三氯乙酸和三氯乙酸丙酮沉淀的蛋白質(zhì)在25 kD以下發(fā)生缺失，而丙酮、甲醇和乙醇差別不明顯，實驗選擇了丙酮作為蛋白質(zhì)沉淀劑。

2.6 A. manzaensis分別在S0和Fe2+培養(yǎng)下膜蛋白表達差異研究

使用優(yōu)化后的提取方法對分別在S0和Fe2+培養(yǎng)的A. manzaensis細胞膜蛋白進行提取并進行SDSPAGE，結(jié)果（圖6）顯示，不同能源底物下培養(yǎng)的A. manzaensis膜蛋白表達種類不完全相同。S0培養(yǎng)的A. manzaensis膜蛋白明顯比Fe2+中培養(yǎng)的A. manzaensis膜蛋白多了分子量約35.6 kD的條帶，即該蛋白只在S0培養(yǎng)的A. manzaensis中表達；原本在Fe2+中相對表達較高分子量約為72 kD 和26 kD的蛋白在S0中表達明顯下調(diào)（條帶相對于同泳道其他條帶變淺）；分子量約為16.85 kD的蛋白條帶也只出現(xiàn)在S0培養(yǎng)的細胞中。據(jù)此可推測在35.6 kD和16.85 kD出現(xiàn)的蛋白很可能為A. manzaensis硫代謝相關(guān)的特異性蛋白；而分子量在72 kD 和26 kD的蛋白質(zhì)可能為鐵代謝相關(guān)的蛋白。

圖5 單質(zhì)硫（A）和硫酸亞鐵（B）培養(yǎng)的A. manzaensis膜蛋白在不同沉淀試劑處理下的SDS-PAGE結(jié)果

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)A. manzaensis 硫代謝相關(guān)的蛋白分子量分別是35.6 kD和16.85 kD；而與A. manzaensis鐵代謝相關(guān)蛋白質(zhì)分子量為26 kD和72 kD。目前針對極端嗜熱古菌的膜蛋白分離研究較少，研究大多集中于嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（A. ferrooxidans），張成桂［18］在研究A. ferrooxidans適應(yīng)與活化元素硫的分子機制時，分離出與元素硫活化相關(guān)的差異蛋白質(zhì)點均在40 kD以下。Ramirez等［19］在元素硫和Fe2+基質(zhì)中生長的A. ferrooxidans ATCC 19859時，發(fā)現(xiàn)以亞鐵為能源生長的細菌轉(zhuǎn)接到單質(zhì)硫中培養(yǎng)時，細胞外膜有一分子量為44 kD的蛋白質(zhì)明顯表達上調(diào)。Buonfiglio等［20］的研究則發(fā)現(xiàn)分子量為55 kD和47 kD的兩種外膜蛋白可能與A. ferrooxidans和還原型硫底物的氧化相關(guān)，他們的另一項研究則通過單向電泳發(fā)現(xiàn)A. ferrooxidans MSR外膜蛋白中有一分子量為50 kD的外膜蛋白質(zhì)在以S0為能源生長的細菌細胞中高度表達，以Fe2+為能源生長的細菌細胞中不表達。本實驗結(jié)果和普遍的TCA/ 丙酮沉淀效果相反，例如，龍峰［21］在研究TCA/ 丙酮沉淀對腦脊液標(biāo)本中蛋白質(zhì)雙向電泳的影響時，TCA/ 丙酮沉淀效果比丙酮要好，TCA/ 丙酮沉淀后的腦脊液標(biāo)本蛋白點數(shù)高于單純丙酮沉淀。原因是一般比較TCA/丙酮和丙酮沉淀蛋白質(zhì)效果，蛋白質(zhì)都溶解于水相，本實驗中的蛋白質(zhì)溶解于表面活性劑的有機相中，有機相對沉淀試劑有一定干擾，而本實驗差異蛋白質(zhì)在凝膠上灰度較淺，屬于豐度比較低的蛋白，有機試劑沉淀蛋白質(zhì)必然會對造成一定損失，最終導(dǎo)致了TCA/ 丙酮效果不如丙酮。本實驗發(fā)現(xiàn)的A. manzaensis 硫代謝相關(guān)的蛋白分子量都相對較小，與生物冶金模式菌A. ferrooxidans相比較，雖然浸礦行為相似，但在相關(guān)蛋白的表達缺存在明顯差異，這也表明A. manzaensis的硫活化氧化機理可能和常溫冶金微生物不盡相同。

圖6 兩種能源培養(yǎng)A. manzaensis膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果

通過檢索KEGG數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布硫代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，查到泉古菌（crenarchaeotes）大類下硫代謝相關(guān)蛋白共24個，并計算其分子量，由于嗜酸兩面菌屬（Acidianus）硫代謝缺乏研究，未找到同屬的硫代謝相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)（表2）。考慮到在電泳時蛋白質(zhì)條帶的遷移有一定誤差，選取了3個分子量和實驗數(shù)據(jù)相近的蛋白作分析，分別為35.6 kD附近的 cysteine synthase、putative dehydrogenase、thiosulfate sulfurtransferase還 有16.85 kD 附 近 的erminal quinol oxidase，subunit II，putative（doxA-like）、Terminal quinol oxidase，subunit II（doxA）、Toluene-4-monooxygenase system protein C（tmoC）。有 趣的是，分子量在35.6 kD 附近的的3個蛋白在泉古菌大類中較為普遍，而分子量16.85 kD 附近的3個蛋白僅在硫化葉菌屬（Sulfolobus）中出現(xiàn)，這表明A. manzaensis與硫化葉菌屬在硫代謝上可能存在相似性，但由于分子量的對應(yīng)關(guān)系并未完全符合實驗數(shù)據(jù)，A. manzaensis亦可能存在未知的硫代謝相關(guān)蛋白，這方面還有待進一步的實驗深入研究。

表 2 泉古菌門硫代謝相關(guān)蛋白

需要特別指出的是，由于SDS-PAGE分辨率較差，因此很可能同一條帶下存在多種蛋白。

4 結(jié)論

本實驗通過比較不同膜蛋白提取劑的提取效果以及不同蛋白沉淀劑的沉淀效果，優(yōu)化了A. manzaensis 膜蛋白的提取方法。通過優(yōu)化后的方法，對S0和Fe2+培養(yǎng)的A. manzaensis膜蛋白進行提取和SDS-PAGE比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同能源下培養(yǎng)時A. manzaensis膜蛋白的表達種類有明顯差異，表明A. manzaensis對不同能源利用的差異性，這些差異表達的蛋白條帶很可能與A. manzaensis的硫代謝或者鐵代謝相關(guān)。

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［21］龍峰. TCA/丙酮沉淀對腦脊液標(biāo)本中蛋白質(zhì)雙向電泳的影響分析［J］. 四川醫(yī)學(xué), 2010, 31（4）：532-533.

（責(zé)任編輯 李楠）

Establishment of Extraction Methods of Membrane Proteins from Extremely Thermoacidophilic Acidianus manzaensis and Its Preliminary Application

YANG Yun1LIU Hong-chang1XIA Jin-lan1，2MA Ya-long1NIE Zhen-yuan1，2
（1. School of Minerals Processing and Bioengineering，Central South University，Changsha 410083；2. Key Laboratory of Biometallurgy of Ministry of Education，Central South University，Changsha 410083）

Using Acidianus manzaensis as research object，the methods of extracting the membrane proteins were explored and optimized，then the optimized methods were used to exact the membrane proteins of the bacterium cultured on elemental sulfur（S0）or ferrous iron（Fe2+）as energy substrates，and the differentiated expressions of the extracted membrane proteins from 2 substrates were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）. The uncorrelated extracellular proteins were firstly removed by incubating the cells in 80℃ for 60-70 min. Then the extraction effects of different extraction reagents（Triton X-110，SDS and Triton X-114）on the membrane proteins were comparatively studied，and the results indicated that Triton X-114 was better than others and the optimal concentration of Triton X-114 was 10%（w/v）. Similarly，the precipitation effects of different protein precipitation reagents（trichloroacetic acid（TCA），acetone，TCA/acetone，methyl alcohol and ethyl alcohol）on the proteins were comparatively studied，and the results indicated that the precipitation by TCA/acetone was the worst，as TCA/acetone caused the loss of low-molecular weight proteins；while there were no significant differencesby others. Compared comprehensively，the most commonly used acetone was chosen as the precipitation reagent in the extraction of membrane. Finally，the membrane proteins of A. manzaensis cultured on S0and Fe2+were extracted via the optimized traction method and comparatively analyzed by SDS-PAGE. The results showed that the protein bands with 35.6 kD and 16.8 kD only appeared in A. manzaensis cultured on S0，which was probably related to sulfur oxidation of this strain. The protein bands with 72 kD and 26 kD were significantly up-regulated in A. manzaensis cultured on Fe2+compared with on S0，indicating that the protein may be related to iron oxidation of this strain.

Acidianus manzaensis；membrane proteins extraction；SDS-PAGE；iron oxidation；surfur oxidation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.015

2016-03-07

國家自然科學(xué)基金項目（51274257，U1232103）

楊云，男，研究方向：生物冶金；E- mail：yysgamesemail@163.com

夏金蘭，男，博士，教授，研究方向：生物冶金及能源環(huán)境生物技術(shù)；E-mail：jlxia@csu.edu.cn