張在鵬林鵬郭松林王藝磊張子平馮建軍

（1. 集美大學水產(chǎn)學院 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心 農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361021；2. 福建農林大學動物科學學院，福州 350002）

大黃魚酪氨酸激酶基因克隆及原核表達分析

張在鵬1林鵬1郭松林1王藝磊1張子平2馮建軍1

（1. 集美大學水產(chǎn)學院 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心 農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361021；2. 福建農林大學動物科學學院，福州 350002）

為了研究大黃魚（Larimichthys crocea）T淋巴細胞酪氨酸激酶（lymphocyte cell kinase，LCK）的基因結構和功能，通過RT-PCR和RACE技術克隆了大黃魚LCK（LcLCK）基因cDNA 全長序列，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對該基因在大黃魚各組織器官和胚胎發(fā)育各時期的表達情況進行了檢測與分析，同時構建了LcLCK基因的原核表達載體，在大腸桿菌中進行了高效表達。結果表明，獲得的LcLCK基因全長為2 334 bp，開放閱讀框為1 503 bp，編碼501個氨基酸。該蛋白具有非受體酪氨酸激酶Src家族典型的SH3、SH2和TyrKc三個結構域，其N端含有GCXCS和CXXC基序，C末端出現(xiàn)2個與人類LCK基因中的Tyr394和Tyr505相一致的保守酪氨酸位點。系統(tǒng)發(fā)育樹表明LcLCK與紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）LCK聚為一支；LcLCK基因在雌雄大黃魚各組織器官中均有表達，其中在主要免疫器官脾臟、頭腎和鰓有高豐度表達，雌性個體的表達量要高于雄性個體；胚胎發(fā)育過程中，LcLCK基因表達水平在多細胞期、囊胚期和原腸期較高，囊胚期達到峰值，卵黃栓形成期顯著降低，眼泡出現(xiàn)期至孵出期持續(xù)下降，而初孵仔魚期則有所回升；構建的原核表達載體pGEX-4T-2-LCK在大腸桿菌中成功表達，其新增LcLCK重組蛋白條帶在SDS-PAGE電泳檢測中約為84 kD，與預期表達的分子量相符。大黃魚LcLCK在雌雄成熟個體的細胞免疫應答以及胚胎發(fā)育過程中T淋巴細胞免疫器官的形成密切相關。

大黃魚；LCK基因；胚胎發(fā)育；原核表達

當機體受到外源物質侵染后，抗原通過主要組織相容性復合體（MHC）上的抗原呈遞細胞（APCs）與T淋巴細胞受體（TCR）結合，并以非共價形式與CD3形成復合物。在TCR/CD3復合物中，CD3分子由1條γ鏈、1條δ鏈、2條ε鏈及2條ζ鏈組成，其中γ、δ和ε鏈的胞質區(qū)分別含有1個免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM）位點，而ζ鏈則含有3個ITAMs［1］。作為非受體酪氨酸激酶Src家族中一員，T淋巴細胞酪氨酸激酶（lymphocyte cell kinase，LCK）具有典型的SH3結構域、SH2結構域以及酪氨酸激酶（TyrKc）結構域，并通過其N端的豆蓮?；∟-myristoylation）和棕櫚醜化（palmitoylation）位點與細胞膜相連接。在TCR與抗原肽/MHC復合物相互作用中，胞質的LCK通過非共價鍵與CD4或CD8輔助受體胞內區(qū)相結合而首先被激活［2］?；罨蟮腖CK可以催化CD3胞質區(qū)的ITAMs磷酸化。這些磷酸化的ITAMs提供含有SH2結構的多種激酶的高親和力的位點，其中ZAP-70與CD3ζ鏈的ITAMs結合后被激活，從而導致其他信號分子募集并激活，最終引起TCR信號傳導的級聯(lián)反應。因此，LCK對于介導TCR信號轉導過程及T細胞的發(fā)育、分化、增殖和激活具有十分重要的作用［3］。

硬骨魚LCK基因克隆與分析的研究已經(jīng)在紅鰭東方鲀（Fugu rubripes）［4］、斑馬魚（Danio rerio）［5］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［6］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［7］及大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus L.）［8］中有所報道。蛋白序列比對結果顯示魚類與哺乳動物的LCK結構域高度保守，在哺乳動物中決定LCK基因功能的半胱氨酸和酪氨酸殘基也存在于魚類中，表明其蛋白與蛋白的相互作用類似于哺乳動物［5］。目前，哺乳動物LCK基因功能的研究已經(jīng)相當深入，但在魚類的研究中還比較薄弱［3，9］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）重組LCK蛋白能夠與T細胞受體CD2、CD4-1以及CD4-2相結合，提示該蛋白具有類似哺乳動物LCK的TCR信號傳導功能［9］。另外，Motoko等［10］報道LCK基因可以作為分子標記對日本鰻鱺（Anguilla japonica）T細胞分化和胸腺發(fā)育進行研究。

大黃魚是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟魚類，隨著近年來養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，高密度養(yǎng)殖模式導致的病害也愈發(fā)嚴重，大大降低了養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益［11，12］。目前，大黃魚免疫器官的組織結構、發(fā)育以及免疫細胞基本類型的研究已有報道，但關于T細胞受體（TCR）信號傳導以及T細胞發(fā)育分子機制的研究還相當薄弱［13，14］，而LCK基因在雌雄大黃魚不同組織的表達差異以及胚胎發(fā)育過程中的表達變化研究尚未見報道。本研究首次克隆獲得了大黃魚LCK基因（命名為LcLCK）全長cDNA，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對該基因在大黃魚各組織器官和胚胎發(fā)育各時期的表達情況進行檢測與分析，并且構建LcLCK基因的原核表達載體，在大腸桿菌中進行高效表達，旨為深入研究大黃魚LcLCK的基因結構和功能，并為大黃魚T細胞活化的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大黃魚購自福建省寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司，雄魚和雌魚的體重分別在300-400 g和500-600 g之間。解剖獲得健康大黃魚各組織器官，分別放入標記好收集管中，液氮凍存后-80℃超低溫冰箱保存；分別收集不同發(fā)育時期的大黃魚胚胎，包括多細胞期、囊胚期、原腸期、卵黃栓形成期、眼泡出現(xiàn)期、胚孔關閉期、晶體出現(xiàn)期、肌肉效應期、心跳期、孵出期，同時也收集初孵仔魚期的大黃魚。收集標記后放入液氮凍存，之后-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取以及cDNA的合成 采用Trizol（Invitrogen）法提取大黃魚總RNA，步驟參照產(chǎn)品說明書。cDNA的合成方法參照姚志剛等［15］方法進行，引物見表1。

1.2.2 LcLCK基因cDNA全長的克隆 以cDNA為模板，通過PCR擴增LcLCK基因片段（引物LCK-F和LCK-R，見表1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后在T4 DNA連接酶的作用下與pMD19-T（TaKaRa）載體連接，隨后將重組載體轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，涂平板后挑選陽性單克隆菌落進行測序。測序結果經(jīng)BLAST比對分析為大黃魚LcLCK基因。Primer 5.0軟件設計的3'-RACE和5'-RACE引物（表1），通過PCR擴增基因的全長cDNA序列，開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列通過head to toe PCR進行驗證，引物見表1。

表1 實驗中使用的引物及其序列

1.2.3 LcLCK的生物信息學分析 測序結果通過NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast以及ORF Finder軟件進行基因的全長cDNA序列拼接與分析。氨基酸序列的多重比對通過BioEdit（http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/）軟件進行，蛋白的結構域由SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）軟件預測，ExPASy（http://cn. expasy.org/tools/pitool.html）用來預測蛋白序列的等電點及分子量，MEGA 6.0軟件（Neighbor-Joning法）用來構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 LcLCK基因在各組織及胚胎各發(fā)育時期的表達分析 LcLCK基因各組織及胚胎各發(fā)育時期cDNA模板的制備以及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）步驟參照姚志剛等［15］方法進行。LcLCK基因熒光定量特異性引物5'real-LCK和3'real-LCK以及內參基因5'-β-actin和3'-β-actin引物序列，見表1。不同組織以及不同胚胎發(fā)育階段均取4個平行樣品，每個樣品的RQ值（即2-ΔΔCT）由儀器分析得出，采用RQ x-±s表示相對表達水平，通過SPSS軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行樣本t-檢驗分析，顯著性差異表示為P＜ 0.05。

1.2.5 原核表達載體pGEX-4T-2-LCK的構建 以pMD19-T-LCK-ORF重組質粒為模板進行PCR，取1 μL加入到0.2 mL薄壁PCR反應管中，再依次加入以下PCR反應組分（表2），擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠（1.5%）檢測后進行膠純化，純化產(chǎn)物和pGEX-4T-2表達載體分別進行雙酶切，限制性內切酶分別為Xho I和Sam I。經(jīng)T4 DNA Ligase連接后，轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，從平板固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，經(jīng)擴大培養(yǎng)后進行質粒提取并送測序，將測序正確的重組質粒命名為pGEX-4T-2-LCK。

表2 PCR反應組分

1.2.6 原核重組表達載體的誘導表達 將重組質粒pGEX-4T-2-LCK轉化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，于搖床37℃過夜培養(yǎng)。按1∶100的接種量培養(yǎng)菌液100 mL，OD600達到0.6左右時進行IPTG誘導，濃度為1.0 mmol/L。37℃誘導6 h后，取1 mL菌液離心后用PBS重懸混勻，加入25 μL上樣緩沖液置于PCR儀中95℃ 5 min，溫度降至室溫后通過SDSPAGE電泳對重組蛋白的表達情況進行檢測。

2 結果

2.1 LcLCK基因全長克隆及序列分析

以大黃魚頭腎cDNA為模板，PCR擴增獲得LCK基因片段長度約為1 000 bp，5'RACE和3' RACE的擴增產(chǎn)物長度分別為430 bp和800 bp，大黃魚LCK基因開放閱讀框（ORF）的PCR擴增結果（圖1）為1 503 bp。LcLCK的全長cDNA序列為

2334bp（GenBank登錄號：JF837184），其中5'非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）為209 bp、3'UTR為594 bp、開放閱讀框（ORF）為1 503 bp。該基因編碼501個氨基酸，預測蛋白質分子量為57.3 kD，等電點為4.93。

圖1 LcLCK基因克隆的電泳圖譜

2.2 LcLCK與其他物種LCK的多重比對及進化分析

LcLCK氨基酸序列與其他物種LCK氨基酸序列結果（圖2）顯示，LcLCK分為SH3、SH2和TyrKc 3個結構域，在N端含有GCXCS和CXXC基序，與其他魚類和哺乳類動物LCK相似；LcLCK的C端含有2個保守的酪氨酸位點，這與人類LCK基因中的Tyr394和Tyr505相一致。

2.3 LcLCK和其他物種LCK氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

N-J系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）表明，LcLCK和紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）LCK同源性最高，并與其他魚類LCK聚為一支，另外哺乳類LCK聚為一支，而作為魚類和哺乳類之間過渡的兩棲類單獨聚為一支；短爪章魚（Amphioctopus fangsiao）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）LCK分別形成獨立分支，與LcLCK距離較遠。

2.4 LcLCK在大黃魚雌雄不同組織的表達

實時熒光定量分析（圖4）表明，LcLCK mRNA在雌性大黃魚和雄性大黃魚各組織器官中均有表達，各組織中相對表達量差異較大，脾臟中的表達量最高；雌性鰓、頭腎以及雄性鰓、腸中的LcLCK表達量較高；雄性性腺和腸中LcLCK表達量顯著高于雌性（P＜0.05），而雌性鰓、頭腎中LcLCK表達水平則顯著高于雄性（P＜0.05）。

2.5 LcLCK在胚胎各發(fā)育時期的表達情況

LcLCK基因在胚胎發(fā)育各時期的檢測結果（圖5）表明，當胚胎發(fā)育處于多細胞期、囊胚期和原腸期時，LcLCK基因有高豐度表達，在囊胚期達到峰值，與其他發(fā)育時期的表達量相比差異顯著（P＜0.05）。LcLCK基因表達水平從卵黃栓形成期開始出現(xiàn)明顯下降，隨后的眼泡出現(xiàn)期、胚孔關閉期、晶體出現(xiàn)期、尾牙期、心跳期，以及孵出期時LcLCK基因表達水平持續(xù)下降，而初孵仔魚期LcLCK表達水平則有所回升。

2.6 LcLCK基因在大腸桿菌中的表達和檢測

將構建成功的pGEX-4T-2-LCK重組表達質粒轉化至BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導4 h后采用12.5% SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行檢測。如圖6所示，當IPTG誘導4 h后，含有空質粒pGEX-4T-2（BL21）菌體蛋白沉淀在大約26 kD處出現(xiàn)明顯的一條新增蛋白帶，含有pGEX-4T-2-LCK（BL21）重組質粒的菌體蛋白沉淀則在大約84 kD處出現(xiàn)一條明顯的新增蛋白帶，而未經(jīng)IPTG誘導的pGEX-4T-2空質粒菌體蛋白沉淀和上清在26 kD和84 kD處均未見明顯的蛋白表達。以上結果表明，大黃魚LcLCK基因在大腸桿菌中以包涵體的形式進行表達。此外，為了進一步了解重組表達質粒在誘導不同時間后的表達量變化，對所挑選的陽性克隆菌株分別誘導3 h、4 h、5 h和6 h。結果（圖7）表明重組蛋白的表達量隨著誘導時間的延長而提高。

圖2 LcLCK和其他物種LCK氨基酸序列的多重比較

3 討論

LCK是Src家族中的一個重要成員，在T細胞活化信號轉導以及分化調節(jié)過程中起著重要的作用［3］。本研究獲得了大黃魚LcLCK全長cDNA，編碼501個氨基酸，蛋白序列分析顯示LcLCK含有Src家族保守結構域，推測該蛋白具有類似于哺乳動物LCK蛋白功能。人類LCK N端保守的CXXC基序能夠與T細胞CD4和CD8的胞漿區(qū)相互作用，促進LCK與TCR結合［16］。雖然大黃魚以及其他魚類也都存在這一基序，但比對結果發(fā)現(xiàn)基序CXXC后面還有兩個保守的NC位點，這一變化很可能是硬骨魚LCK區(qū)別于哺乳動物的特征序列［6，10，17］。此外，在LcLCK C端存在兩個保守的酪氨酸位點，與人類LCK序列中Try394和Try505一致。已有的研究表明這兩個保守的酪氨酸位點與LCK的活性調控有關［18］。哺乳動物蛋白酪氨酸激酶C-terminal Src kinase（Csk）可以催化Try505的磷酸化反應，以維持LCK的靜息狀態(tài)，而當酪氨酸磷酸酶CD45使Try505發(fā)生去磷酸化后，LCK酶活性被激活。相反，Try394磷酸化后會引起LCK結構變化，使其催化活性被激活，從而催化CD3ζ鏈上的ITAMs磷酸化反應［18，19］。以上分析表明LcLCK具備了T細胞活化功能的結構基礎。

圖3 LcLCK和其他物種LCK氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹（LcLCK用▲標出）

圖4 LcLCK在大黃魚雌雄各組織器官中表達圖

圖5 LcLCK基因在胚胎發(fā)育各時期表達

大黃魚LcLCK基因在雌雄個體的不同組織中均有表達，該組成型基因表達模式在紅鰭東方鲀中也有所報道［4］。但是，大菱鲆的研究發(fā)現(xiàn)LCK基因僅在脾臟中表達［7］，而其他組織器官未見表達。虹鱒胸腺LCK基因的表達水平最高，在脾臟、腎臟以及外周血淋巴細胞中也有一定表達［6］。以上結果表明LCK基因在魚類各組織中的表達分布與其種屬特異性密切相關。雌性和雄性大黃魚LcLCK基因在脾臟、鰓、頭腎及腸等免疫相關組織均有高豐度表達，這與日本鰻鱺LCK基因研究結果相符［10］。另外，脾臟中的LcLCK表達量在雌雄大黃魚所有檢測組織器官中均為最高，提示脾臟在大黃魚T淋巴細胞的發(fā)育、分化、增殖以及細胞免疫應答中發(fā)揮重要作用［20］。雌性大黃魚主要免疫器官脾臟、鰓和頭腎的LcLCK表達水平顯著高于雄性，提示雌性大黃魚的T細胞發(fā)育、增殖方面優(yōu)于雄性。鑒于T細胞的功能主要介導細胞免疫并在免疫應答中起調節(jié)作用［21］，也有研究表明大黃魚雌性個體在生長速度方面優(yōu)于雄性個體［22］，然而大黃魚主要免疫組織器官LcLCK基因表達水平在雌雄個體中的差異是否會導致其細胞免疫水平的不同還有待進一步研究。

圖6 LcLCK基因表達的SDS-PAGE電泳分析圖

圖7 LcLCK基因不同時間的誘導表達狀況

胸腺是大多數(shù)魚類最早發(fā)育的中樞淋巴器官，也是功能性T淋巴細胞產(chǎn)生的主要免疫器官［23，24］。Kawabe等［10］研究發(fā)現(xiàn)日本鰻鱺胚胎發(fā)育第3天和第7天以及柳葉狀幼體期均能檢測到LCK基因的表達，因此LCK基因可作為T細胞分化以及胸腺發(fā)育的分子標記。目前，雖然對大黃魚胚胎階段胸腺發(fā)育的研究還未見報道，但已有學者通過顯微技術研究了大黃魚仔魚期和幼魚期胸腺的發(fā)育情況，結果表明在胸腺原基在4日齡仔魚就已經(jīng)出現(xiàn)，7日齡仔魚期的胸腺進一步增大，胸腺細胞多數(shù)為典型淋巴細胞［25］。本實驗研究了大黃魚從多細胞期到仔魚期的整個胚胎發(fā)育不同階段LcLCK基因表達變化情況，結果表明在大黃魚胚胎多細胞期就檢測到LcLCK基因高水平表達，囊胚期達到峰值，原腸期也有較高的表達水平，提示胸腺在胚胎發(fā)育早期就已經(jīng)開始有了分化，特別在囊胚期最為活躍，到原腸期也有較高的發(fā)育水平。但從卵黃栓形成期到孵出期LcLCK基因表達水平持續(xù)降低，而到了初孵仔魚期又開始回升，提示胸腺的發(fā)育有著嚴格調控機制。

本研究所構建的原核表達載體pGEX-4T-2-LCK在大腸桿菌中的高效表達，說明pGEX-4T-2是一種高效的蛋白表達載體，這很可能與強啟動子tac密切相關［26］。

4 結論

本實驗從大黃魚克隆獲得LcLCK的cDNA全長，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達。

實時熒光定量PCR結果顯示在雌性和雄性大黃魚個體主要免疫器官中LcLCK基因均有較高的表達水平，且在胚胎發(fā)育過程中該基因的表達量發(fā)生了顯著變化。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression Analysis of Tyrosine Kinase Gene in Large Yellow Croaker

ZHANG Zai-peng1LIN Peng1GUO Song-lin1WANG Yi-lei1ZHANG Zi-ping2FENG Jian-jun1
（1. Fisheries College，Jimei University，Engineer Research Center of Eel Modern Industry Technology，Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，Xiamen 361021；2. College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002）

To identify the structure and function of the lymphocyte-specific protein tyrosine kinase（LCK）gene（LcLCK）in large yellow croaker（Larimichthys crocea），a full length cDNA of LcLCK was cloned from large yellow croaker by RT-PCR and RACE. The expressions of LcLCK in various tissues of adult male and female large yellow croaker as well as at different stages of the embryonic development were analyzed and examined via qRT-PCR. The recombinant prokaryotic vector was also constructed and transferred into Escherichia coli for efficient expression. The results were as following：Its full-length cDNA sequence was 2 334 bp，with a 1 503 bp open reading frame encoding a protein of 501 amino acids. The predicted protein contained the typical domains of SH3，SH2 and TyrKc in the Src kinase family of nonreceptor tyrosine. Two motifs of GCXCS and CXXC were found in the N-terminal region of LCK，while the two conserved Tyr sites in accordance with the Tyr394and Tyr505of LCK from human were present in C-terminal. Phylogenetic analysis showed that the deduced LCK clustered with Japanese pufferfish（Takifugu rubripes）. qRT-PCR revealed that the expressions of LcLCK were detected in all adult tissues examined，withhigher expression in the main immune tissues such as spleen，head kidney，and gills of both sexes；and the expression level of LcLCK gene in these tissues from female was higher than that of the male. Early in the embryonic development，the high levels of LcLCK were observed during the multiple cells，blastula，and gastrula stages with the expression peak in blastula stage. The significant decrease of LcLCK expression was found at formation of yolk plug stage，and remained at the low expression level from formation of eye lens stage to pre-hatching stage，whereas an increase of gene expression was observed at alevin stage. The constructed prokaryotic vector pGEX-4T-2-LCK was expressed successfully in E. coli. In SDS-PAGE analysis，the new recombinant LcLCK protein band was about 84 kD that was in accordance with the expected. In conclusion，LcLCK is closely related to the cellular immune responses of adult male and female large yellow croaker as well as the mature of immune organs producing T-cell during embryonic development.

Larimichthys crocea；LCK gene；embryonic development；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.021

2016-03-28

國家自然科學基金項目（31272685），福建省海洋與漁業(yè)廳項目（201212140006），福建省自然科學基金項目（2016J01164），集美大學創(chuàng)新團隊基金項目（2010A001），集美大學科研基金項目（C60819）

張在鵬，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動物免疫學；E-mail：wyzzp4331@163.com

馮建軍，男，副教授，研究方向：水產(chǎn)動物免疫學；E-mail：fengjj@jmu.edu.cn