藤茶泡水前后的抗菌活性和抗氧化活性比較

劉熠杭，馬玉杰，商艷君，尹健鐸

(1.河北省石家莊市第一中學(xué)，河北石家莊 050010；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050061)

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藤茶泡水前后的抗菌活性和抗氧化活性比較

劉熠杭1，馬玉杰2*，商艷君2，尹健鐸2

(1.河北省石家莊市第一中學(xué)，河北石家莊 050010；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050061)

[目的] 比較藤茶泡水前后乙醇提取物的抗菌活性和抗氧化活性。[方法] 采用福林酚法進(jìn)行酚含量的測定，抑菌圈法進(jìn)行抗細(xì)菌活性測定，菌餅法進(jìn)行抗真菌活性測定，并采用DPPH法進(jìn)行抗氧化活性測定。[結(jié)果] 藤茶泡水前后乙醇提取物的多酚含量分別為168和56 kg/g，藤茶泡水前乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、灰葡萄孢霉、膠孢炭疽菌和葡萄白腐病菌均有抑制作用，泡水后的乙醇提取物對枯草芽胞桿菌不再有抑制作用，對其他5種菌仍有抑制活性但活性均有不同程度的降低。藤茶泡水前乙醇提取物的DPPH清除活性IC50分別為5.09和36.01 μg/mL。[結(jié)論] 藤茶泡水后的殘渣仍具有一定的抗菌和抗氧化活性，可被繼續(xù)開發(fā)利用。

藤茶；抗細(xì)菌活性；抗真菌活性；抗氧化活性；總酚含量

藤茶又名長壽茶，是我國民間比較廣泛使用的代茶飲料，同時又是一味傳統(tǒng)中藥材，其原植物為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)[1-2]。作為藥用植物資源，藤茶是一種極具開發(fā)潛力的中草藥。藤茶中多酚含量高(在20%左右)，多酚類化合物具有廣泛的生理活性[3]。近代醫(yī)學(xué)研究表明，藤茶及其提取物具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫、降血脂、降血壓、降血糖、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、保肝、護(hù)肝以及減輕乙醇中毒等功效[4-5]。無論作為飲品、保健品還是藥用植物資源，藤茶均具有較高的開發(fā)利用價值。目前有大量關(guān)于藤茶抗菌活性和抗氧化活性的報道[6-9]，但關(guān)于藤茶泡水前后的抗菌活性和抗氧化活性比較的研究還鮮見報道。該試驗通過比較藤茶泡水前后乙醇提取物的抗菌活性和抗氧化活性差異，旨在為藤茶殘茶的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。藤茶購自市場。細(xì)菌：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(EscherichiaColi),均來自河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)微生物學(xué)實驗室。真菌：灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)，均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.1.2 試劑。水楊酸、硫酸鋰、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸溶液、濃鹽酸溶液、Na2CO3溶液、維生素C、95%酒精、福林酚試劑、沒食子酸、去離子水、DPPH等。

1.1.3 儀器。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴鍋、超凈工作臺、紫外分光光度計(7230G可見分光光度計)等。

1.2 方法

1.2.1 粗提取提取方法。泡水前后(應(yīng)用后茶葉為泡水3次后茶葉)干燥的藤茶，用95%乙醇浸提3次，每次1 d，合并減壓蒸干得乙醇粗提取物。

1.2.2 總酚含量測定。

圖1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of total phenolic

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取 5 mg的沒食子酸對照品，置50 mL容量瓶用蒸餾水溶解并定容，得0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL 棕色容量瓶中，加蒸餾水補至10 mL，搖勻，再加1 mL 的 Folin-Ciocalteu 試劑，充分搖勻。1 min后，加入7.5%(W/V)碳酸鈉溶液 2 mL，混勻，用蒸餾水定容，在50 ℃水浴加熱15 min，于765 nm處測定吸光度[10]。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得出回歸方程為：y=143.24x+ 0.037 8(R2= 0.998)。1.2.2.2 藤茶乙醇提取物多酚含量的測定。取1 mL樣品液加至10 mL比色管中，依次加入1 mL去離子水，后面同“1.2.2.1”方法，在765 nm下測定其吸光度。酚含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的方程進(jìn)行計算。

1.2.3 抗細(xì)菌活性。

1.2.3.1 抑菌圈的測定。采用打孔法進(jìn)行測定。每皿加入約25 mL冷卻至50～60 ℃滅菌后的牛肉膏蛋白培養(yǎng)基，凝固后，取0.1 mL(1×106～1×107CFU/mL)菌懸液加到平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻。用打孔器(直徑為0.8 cm)在涂布均勻的平板上打孔，無菌牙簽挑取上層培養(yǎng)基。每孔加入100 μL樣品(100 mg/mL)，每樣品3個平行板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈。測量抑菌圈的直徑時，十字交叉，分別測量后，取平均值。取3次測量的平均值。青霉素為陽性對照(5 mg/mL)。

1.2.3.2 最小抑菌濃度的測定。制備菌體濃度為107CFU/mL的菌懸液，放置4 ℃冰箱，備用。測定時，與適量的液體細(xì)菌培養(yǎng)基混勻至細(xì)菌終濃度約為105CFU/mL。將甲醇溶解的不同濃度的樣品100 μL和指示菌100 μL加入96孔細(xì)胞板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，無肉眼可見菌生長的最小的樣品濃度即為樣品對該菌的最小抑菌濃度(Mininum inhibitory concentration，MIC)。未加待測樣品只含指示菌的為陰性對照，只含培養(yǎng)基的為空白對照，陽性對照用青霉素。

1.2.4 抗真菌活性。將200 mg提取物溶解到1 mL甲醇中，在PDA培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃，將待測溶液加入至100 mL培養(yǎng)基中，充分搖勻，迅速倒入無菌培養(yǎng)皿中(每皿20 mL)，放置待其凝固。將供試病原真菌接到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d，在培養(yǎng)皿邊緣菌絲生長旺盛處用打孔器打取直徑為

0.8 cm的菌餅。待測樣品對真菌的抑制作用采用菌絲生長速率法[11]。用接種針將0.8 cm的菌餅接至帶藥培養(yǎng)基上，有菌絲的一面向下與培養(yǎng)基貼合，每個培養(yǎng)皿中中央接一個菌餅，28 ℃培養(yǎng)4 d后，用十字交叉法測菌落直徑，計算相對抑制率。試驗設(shè)空白對照、陽性對照(克霉唑，濃度為0.10 mg/mL)、加藥處理(泡水前后的藤茶乙醇提取物，濃度為1 mg/mL)，每個處理設(shè)3個重復(fù)。相對抑制率的計算公式為：

1.2.5 抗氧化活性研究。DPPH自由基清除活性的測定參照文獻(xiàn)[12-13]，用酶標(biāo)儀在517 nm 下測量吸光度(A)。水溶性抗氧化劑VC為陽性對照。DPPH自由基清除活性計算公式[14]如下：

式中，A對照為對照的吸光值，A樣品為加樣品反應(yīng)液的吸光值。每個樣品測3次，取平均值。IC50是清除率為50%時對應(yīng)的樣品濃度，值越大，表明清除活性越弱；反之，越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶泡水前后乙醇提取物的總酚含量 泡水前后藤茶乙醇提取物的多酚含量差異比較明顯，分別為168和56 kg/g，表明藤茶具有較高含量的多酚，且泡水后的殘茶仍有一定的多酚存在。

2.2 藤茶泡水前后乙醇提取物的抗細(xì)菌活性比較 從表1可看出，泡水前藤茶乙醇提取物在濃度為100 mg/mL時對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性大于濃度為5 mg/mL 的青霉素。藤茶泡水后乙醇提取物(100 mg/mL)抑菌活性小于青霉素(5 mg/mL)。藤茶泡水前后對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑制活性，且泡水前乙醇提取物的抑制活性大于泡水后乙醇提取物，泡水后乙醇提取物對枯草芽胞桿菌無抑制活性。

表1 藤茶泡水前后乙醇提取物抗細(xì)菌活性

2.3 藤茶泡水前后乙醇提取物的抗真菌活性比較 從表2可看出，藤茶泡水前后對3種葡萄植物病原菌均有一定的抑制活性。藤茶泡水前對葡萄白腐病菌和灰葡萄孢霉有較好的抑制活性，在濃度為1 mg/mL時抑制率分別為75.5%和82.8%，低于0.10 mg/mL的陽性對照制霉菌素。藤茶泡水后的乙醇提取物對葡萄白腐病菌和灰葡萄孢霉仍有很好的抑制活性，在濃度為1 mg/mL時抑制率分別為49.0%和55.5%。2.4 藤茶泡水前后乙醇提取物的抗氧化活性比較 由圖2可知，藤茶泡水前乙醇提取物具有很明顯的清除作用，其IC50值為5.09 μg/mL與VC差異不顯著(P>0.05，5.04 μg/mL)，且呈量效關(guān)系，藤茶泡水后其乙醇提取物仍具有一定的DPPH清除活性，其IC50為36.01 μg/mL。

表2 藤茶泡水前后乙醇提取物抗真菌活性

圖2 藤茶泡水前后乙醇提取物的DPPH自由基清除活性Fig.2 DPPH radical scavenging ability of the ethanol extract of Ampelopsis grossedentata before and after soaking in water

3 結(jié)論

比較藤茶泡水前后乙醇提取物的抗菌活性和抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，藤茶泡水前后乙醇提取物的多酚含量分別為168和56 kg/g；藤茶泡水前乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、灰葡萄孢霉、膠孢炭疽菌和葡萄白腐病菌均有抑制作用，泡水后的乙醇提取物對枯草芽胞桿菌不再有抑制作用，對其他5種菌仍有抑制活性但活性均有不同程度的降低；藤茶泡水前乙醇提取物的DPPH清除活性IC50分別為5.09和36.01 μg/mL。表明藤茶泡水后的乙醇提取物仍

具有一定的抗菌和抗氧化活性。參考文獻(xiàn)

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Antimicrobial Activity and Antioxidant Activity Comparison ofAmpelopsisgrossedentatabefore and after Soaking in Water

LIU Yi-hang1, MA Yu-jie2*, SHANG Yan-jun2et al

(1.Shijiazhuang No.1 High School, Shijiazhuang, Hebei 050010;2.College of Biology Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang, Hebei 050061)

[Objective] To compare antibacterial activity and antioxidant activity of ethanol extracts fromAmpelopsisgrossedentatabefore and after soaking in water.[Method]The folin-ciocalteu method was used to make the total phenolic content, antibacterial and antifungal activities were done by the inhibition zone method and the fungus cake method respectively, and antioxidant activity was done by DPPH method.[Result]The total phenolic contents of ethanol extract ofAmpelopsisgrossedentata(EEAG) before and after soaking in water were 168 and 56 kg/g. EEAG before soaking in water showed antimicrobial activity againstEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis,Botrytiscinerea,ColletotrichumgloeosporioidesandConiothyriumdiplodiella. EEAG after soaking in water exhibited no antimicrobial activity against Bacillus subtilis and lower antimicrobial activities against the other five microbes. TheIC50values of DPPH radical scavenging ability of EEAG before and after soaking in waer were 5.09 and 36.01 μg/mL respectively.[Conclution]There are certain antimicrobial and antioxidant activities of the residue ofAmpelopsisgrossedentataafter soaking in water, so it should still be exploited.

Ampelopsisgrossedentata; Antibacterial activity;Antifungal activity;Antioxidant activity;Total phenolic content

2016年博士科研啟動經(jīng)費(0112160225)；2014省教育廳項目(2311002027)。

劉熠杭(2000-)，女，河北石家莊人，高中生。*通訊作者，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的分離與提取。

2016-09-30

S 567.9;R 284.1

A

0517-6611(2016)33-0113-03