孫 偉,張林寶,胡 瑩,蔡文貴,賈曉平 (中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室,廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室,廣東 廣州 510300)

三唑磷作用下翡翠貽貝抑制性消減雜交文庫構(gòu)建與分析

孫 偉,張林寶*,胡 瑩,蔡文貴,賈曉平 (中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室,廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室,廣東 廣州 510300)

采用抑制性差減雜交技術(shù),構(gòu)建了三唑磷農(nóng)藥急性脅迫下翡翠貽貝雌貝性腺正反向消減雜交cDNA文庫.正反向文庫共有117個表達序列標簽(expressed sequence tags, ESTs)與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知功能蛋白具較高同源性,假定蛋白12種,另有195個ESTs未檢索到同源序列.正向文庫中含有細胞周期蛋白、性激素合成蛋白、DNA修復(fù)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白等一系列與生殖、應(yīng)激適應(yīng)和代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本信息,而反向文庫中的差異ESTs主要涉及DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控基因以及骨架蛋白.結(jié)果表明三唑磷對翡翠貽貝的毒性涉及到生殖調(diào)控、能量代謝、應(yīng)激適應(yīng)、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控等生理代謝的多個方面,正向文庫中發(fā)現(xiàn)的幾種生殖調(diào)控基因(細胞周期蛋白、周期蛋白依賴性蛋白激酶、合子DNA復(fù)制許可因子、精子特異性蛋白、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶和卵黃膜卵透明帶域蛋白)可能是三唑磷生殖干擾毒性作用過程中的關(guān)鍵基因,這為有機磷農(nóng)藥的生殖毒性探索提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

翡翠貽貝；性腺；三唑磷；抑制性消減雜交文庫；表達序列標簽

三唑磷(O,O-二乙基-O-1-苯基-1,2,4-三唑基-3-硫代磷酸酯, triazophos)做為高毒高殘留有機磷農(nóng)藥的理想替代品種,其需求量呈不斷上升趨勢,2012年我國三唑磷農(nóng)藥原藥和制劑年產(chǎn)量達萬 t以上[1].三唑磷半衰期較長,農(nóng)藥殘留問題嚴重[2]. 20世紀80年代后期以來,浙江和福建沿海地區(qū)廣泛使用三唑磷作為清涂、清塘藥劑,大大提高了貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量.然而,由于三唑磷農(nóng)藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用范圍和強度不斷增大,再加上農(nóng)藥施用不規(guī)范,對海洋生物資源和養(yǎng)殖生物所造成的損害已不容忽視[3].國內(nèi)關(guān)于三唑磷農(nóng)藥對河口、海灣以及水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的污染日益引起關(guān)注[4-5].然而,目前國際上和我國水質(zhì)標準中并未有各類水體中三唑磷的濃度限值.因此,開展三唑磷農(nóng)藥生態(tài)風險評估迫在眉睫.

三唑磷農(nóng)藥毒理效應(yīng)和生物體對三唑磷的響應(yīng)研究是進行生態(tài)風險評估的重要前提和科學依據(jù).目前對三唑磷農(nóng)藥毒性研究主要集中在急性毒性、積累與消除規(guī)律、神經(jīng)毒性、組織損傷和氧化損傷等方面[5-12].有機磷農(nóng)藥作為環(huán)境激素嚴重影響人類健康和水生生物的胚胎發(fā)育和繁殖等生命活動[13],有研究報道三唑磷對稻褐飛虱(Nilaparvata lugens)和灰飛虱(Laodelphax striatellus)的產(chǎn)卵具有明顯的刺激作用[14-15],成蟲體內(nèi)保幼激素滴度以及卵黃蛋白基因的表達隨著三唑磷暴露濃度的增加而增加[16],表明三唑磷農(nóng)藥具有一定的環(huán)境雌激素效應(yīng).目前,有關(guān)三唑磷對海洋貝類的生殖毒性研究尚未見報道.

翡翠貽貝(Perna viridis)廣泛分布于我國東海南部和南海沿岸,對多種污染物均具有較高的蓄積能力,是我國近岸海洋環(huán)境污染定點監(jiān)測的良好指示生物[17].翡翠貽貝多為雌雄異體,在繁殖季節(jié)其性腺肥碩豐滿顏色明顯可見,雄性多呈乳白色,雌性則為橙黃色或橘紅色[18],因此是研究三唑磷生殖毒性的理想實驗材料.最近研究表明,苯并芘(BaP)作用會影響翡翠貽貝精巢的精子發(fā)生過程,干擾貽貝生殖相關(guān)基因表達[19-20].本研究采用抑制性消減雜交技術(shù)(suppressive subtractive hybridization, SSH)構(gòu)建三唑磷農(nóng)藥脅迫下翡翠貽貝性腺消減cDNA文庫,旨在獲取三唑磷作用下翡翠貽貝性腺組織中差異表達的ESTs,從而為分離和克隆三唑磷作用下翡翠貽貝生殖相關(guān)基因提供重要的轉(zhuǎn)錄本信息,并為闡明三唑磷農(nóng)藥作用下翡翠貽貝生殖毒性效應(yīng)和分子機制提供科學依據(jù)和理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 三唑磷農(nóng)藥對翡翠貽貝的急性毒性實驗

實驗于2015年6～7月在中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地進行.實驗所用翡翠貽貝購自深圳東山碼頭,殼長7～8cm.實驗開始前貽貝馴養(yǎng)于 28～30℃的充氣過濾海水中(海水鹽度 32‰,pH 8.1),每日換水,并投喂螺旋藻粉(貽貝組織干重的 2%),馴養(yǎng)一周以適應(yīng)實驗條件.20%三唑磷乳油農(nóng)藥購自浙江新農(nóng)化工有限公司,三唑磷濃度按乳油中三唑磷的實際含量計算.采用半靜態(tài)急性毒性實驗法,根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置三唑磷濃度分別為 0,0.2,0.6,1.8,5.4和16.2mg/L 6個實驗組,每組設(shè)3個平行,每個平行各放入10只翡翠貽貝.實驗持續(xù)96h,暴露期間每24h定時更換含有相應(yīng)濃度三唑磷的新鮮海水.以閉殼肌無力、 張口、用玻璃棒輕敲其外殼許久不作出反應(yīng)者定為死亡.用 Bliss 法計算獲得三唑磷對翡翠貽貝的96h LC50數(shù)值.

1.2 三唑磷農(nóng)藥作用下翡翠貽貝性腺消減cDNA文庫構(gòu)建

1.2.1 實驗設(shè)計 根據(jù)急性毒性實驗計算出三唑磷農(nóng)藥對翡翠貽貝的96h LC5數(shù)值.實驗共兩個處理組,以正常海水組為驅(qū)動子組,以三唑磷脅迫組(96h LC5)為檢測子組,每個處理3個重復(fù),每個重復(fù)20只貽貝,置于含有20L海水的玻璃鋼中.實驗期間不投喂螺旋藻粉,保持充氣,水溫28～30℃,每24h定時更換含有相應(yīng)濃度三唑磷的新鮮海水.曝毒實驗過程中各組翡翠貽貝無死亡現(xiàn)象,48h后取各處理組雌性貽貝,解剖分離獲得卵巢組織迅速置于液氮中冷凍.

1.2.2 抑制性消減雜交cDNA文庫的構(gòu)建 按照 Trizol操作手冊(Invitrogen公司)提取翡翠貽貝雌貝性腺總 RNA,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性并利用NanoDrop2000超微量紫外分光光度計檢測總 RNA濃度.按照 PCRSelectTMcDNA Subtraction kit操作手冊(Clontech公司)構(gòu)建三唑磷脅迫下翡翠貽貝雌貝性腺正反向SSH cDNA文庫,主要步驟如下:(1)cDNA反轉(zhuǎn)錄,分別將處理組和對照組的總RNA合成cDNA第一鏈,進而摸索最佳循環(huán)數(shù)合成 cDNA第二鏈.(2)cDNA文庫差減雜交,以三唑磷處理組cDNA為Tester組,對照組cDNA為Driver組,將Rsa I酶切后并接上接頭的Tester cDNA與Driver cDNA進行兩次差減雜交.(3)二輪差減套式PCR鑒定,以雜交后的cDNA為模板,未進行差減雜交的Tester cDNA為對照模板,分別進行兩次抑制性 PCR,產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析.(4)PCR產(chǎn)物載體連接轉(zhuǎn)化和克隆,將差減組的PCR產(chǎn)物純化后與pMD19-T克隆載體連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞中,涂布于氨芐青霉素抗性的LB平板,37℃培養(yǎng)過夜.

1.2.3 SSH文庫的初步鑒定和分析 隨機挑取200個陽性菌落,接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 培養(yǎng)過 8h,對挑取的菌落進行重組PCR鑒定,產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,計算文庫中插入片段大小分布及重組率.將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序.測序結(jié)果使用 DNAstar 5.0除去載體和接頭序列.預(yù)測開放閱讀框、翻譯編碼的氨基酸序列.利用 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=We b&PAGE_TYPE=BlastHome)網(wǎng)站上同源序列相似性搜索比對工具 BLASTn、BLASTx和BLASTp在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列相似性搜索比對分析.用 Blast2GO 程序?qū)?EST 序列進行基因注釋和功能分類,分析基因在細胞中的代謝途徑(https://www.blast2go.com/).

2 結(jié)果

2.1 三唑磷農(nóng)藥對翡翠貽貝的急性毒性

采用半靜態(tài)急性毒性實驗法,設(shè)置5個三唑磷濃度組和丙酮陰性對照組,每組設(shè)2個平行,每個平行各放入10只貽貝,每24h觀察和記錄貽貝的存活狀態(tài)及死亡個數(shù),實驗持續(xù)96h后,翡翠貽貝在0.2, 0.6, 1.8, 5.4, 16.2mg/L的三唑磷濃度組中的死亡率分別為0、0、0、20%、70%、和100%,用 Bliss 法計算得出三唑磷對翡翠貽貝的 96h LC50為3.5mg/L, 96h LC5為1mg/L.

2.2 翡翠貽貝性腺 RNA提取質(zhì)量和抑制性差減雜交產(chǎn)物檢測

對照組和 1mg/L三唑磷處理組翡翠貽貝性腺組織總RNA濃度分別為0.8154和0.9339μg/ μL, 260/A280值分別為2.07和2.09,表明總RNA質(zhì)量達到構(gòu)建消減文庫的要求.試驗確定了18個循環(huán)為第2鏈cDNA合成的最佳PCR循環(huán)數(shù).差減后的cDNA和未差減的cDNA分別進行兩次抑制性PCR擴增后,產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示.電泳顯示片段大小主要集中在500～1000bp之間,差減和未差減cDNA兩者條帶分布明顯不同,正向文庫中較大的片段得到了明顯的消減.

圖1 正反向SSH文庫差減雜交產(chǎn)物第二輪PCR擴增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of SSH products of the forward and reverse subtracted libraries amplified after two rounds of PCR

2.3 差減文庫的構(gòu)建及分析

差減后的第二次PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化、平板培養(yǎng)后,從正、反向cDNA消減文庫分別挑取200個菌落克隆進行PCR檢測,結(jié)果顯示插入片段長度不一,主要分布在 200～1000bp之間(圖2).菌液PCR擴增產(chǎn)物顯示正向cDNA消減文庫有193個為重組克隆,反向文庫186個為重組克隆,重組效率分別為96.5%和93%.菌液 PCR 檢測結(jié)果顯示,除去插入片段＜200bp的菌液樣品外,正、反向cDNA消減文庫分別有180個和176個菌液樣品可進行測序.

圖2 三唑磷脅迫下翡翠貽貝正(A)反(B)向抑制性消減雜交cDNA文庫插入片段PCR鑒定電泳圖(部分)Fig.2 Identification of the inserted cDNA fragments in the forward (A) and reverse (B) SSH cDNA library of Perna viridis under triazophos stress by PCR (partial)

測序結(jié)果如表1所示,除去測序效果不好或序列測序片段小于 150bp等,實際上正、反向cDNA消減文庫共獲得166個和158個EST序列.利用NCBI網(wǎng)站上BLAST工具進行同源序列相似性搜索比對,結(jié)果表明正向文庫中含有72個ESTs與己知功能序列具有較高的同源性,4個假定蛋白,另外有97個序列未檢索到同源性相似的序列.反向cDNA文庫與Genbank中已知功能基因同源性較高的ESTs有57種,假定蛋白9種,未檢索到同源性相似的序列有101種.正向文庫已知功能的差異基因部分結(jié)果如表2所示,包括細胞周期蛋白、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶、卵黃膜卵透明帶蛋白、DNA修復(fù)相關(guān)蛋白、細胞色素和細胞色素氧化酶、NADH脫氫酶、NAD依賴性蛋白去乙?；?、核糖體蛋白等,主要涉及生殖調(diào)控、電子傳遞、活性氧清除、DNA修復(fù)等功能.反向文庫基因主要包括轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控基因、細胞骨架蛋白、催化酶類以及鈣調(diào)蛋白等.經(jīng) BLASTP同源比對發(fā)現(xiàn),正反向文庫中 117種已知功能EST序列編碼的蛋白主要與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)等貝類和部分魚類相應(yīng)蛋白的同源性最高(表 1和表 2).另外,幾乎很少相同ESTs同時出現(xiàn)在正反向文庫中,這表明該研究所構(gòu)建文庫的消減效率是比較高的.

表1 三唑磷作用下翡翠貽貝正、反向cDNA消減文庫ESTs序列統(tǒng)計分析Table 1 General characteristic of ESTs obtained from the forward (A) and reverse (B) SSH cDNA library of Perna viridis under triazophos stress

利用Blast2GO工具進行基因注釋和功能分類表明,從細胞組成(Cellular component)看,翡翠貽貝性腺組織正向 cDNA消減文庫ESTs 序列(圖3a)中基因產(chǎn)物主要定位于細胞(cell)、細胞器(organelle)和生物大分子復(fù)合物中(macromolecular complex);從分子功能(Molecular function)上分析差異基因劃分為 9 類:主要為結(jié)合類(binding)和催化類(catalytic),另外還有抗氧化活性類(antioxidant)、電子載體類(electron carrier)、酶調(diào)節(jié)因子類(enzyme regulator)、分子轉(zhuǎn)導類(molecular transducer)、結(jié)構(gòu)分子類(structural molecular)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子類(transcription regulator)和運輸活性類(molecular transducer).這些 ESTs 序列共參與 22類生物學過程(Biological proeess),分別是:結(jié)構(gòu)形成(anatomical structure formation)、 生 物 黏 附 (biological adhesion)、生物調(diào)節(jié)(biological regulator)、細胞組分生物合成(cellular component biogenesis)、細胞組分組裝(cellular component organization)、細胞過程(cellular process)、凋亡(death)、發(fā)育進程(developmental process)、建立定位(establishment of localization)、生長(growth)、免疫系統(tǒng)過程(immune system process)、定位(localization)、運動(locomotion)、代謝過程(metabolic process)、多生物過程(multi/-organism process)多細胞生物過程(multicellular organismal process)、色素沉著(pigmentation)、生殖(reproduction)、生殖過程(reproduction process)、壓力應(yīng)激(response to stimulus)、細胞周期過程(rhythmic process)和病毒增殖(viral reproduction).其中參與細胞進程和代謝進程的基因種類最多.另外,翡翠貽貝雌貝性腺組織反向cDNA消減文庫ESTs 序列在細胞定位、分子功能和生物過程三個層次的分布與正向文庫的 ESTs序列分布較為接近(圖3b).

表2 三唑磷作用下翡翠貽貝性腺正向消減文庫ESTs比對結(jié)果(部分)Table 2 BLAST results of forward subtracted cDNA library (partial)

表3 三唑磷作用下翡翠貽貝性腺反向消減文庫ESTs比對結(jié)果(部分)Table 3 BLAST results of reverse subtracted cDNA library (partial)

續(xù)表3

圖3 正向和反向cDNA消減文庫ESTs功能注釋分類Fig.3 Gene ontology classification of forward and reverse subtracted cDNA library

3 討論

三唑磷農(nóng)藥對水生生物的毒性試驗數(shù)據(jù)是危害影響評價的基礎(chǔ).本研究采用半靜態(tài)急性毒性實驗法獲得了三唑磷農(nóng)藥對翡翠貽貝的 96h LC50為 3.5mg/L,與其他海洋貝類的急性毒性數(shù)據(jù)相比(表 4),翡翠貽貝對三唑磷的耐受性更強.查閱近年來的相關(guān)研究表明,浮游動物橈足類和輪蟲對三唑磷農(nóng)藥最為敏感,然后依次為蝦類、魚類、蟹類,而藻類和貝類對三唑磷表現(xiàn)出較強的耐受性[3].貝類由于其獨特的濾食方式,對三唑磷具有較強的富集作用,比甲殼類和魚類高 1～3個數(shù)量級[3].

表4 三唑磷對海洋貝類的急性毒性數(shù)據(jù)Table 4 Acute toxic data of triazophos to marine shellfish

貝類性腺在成熟季節(jié)脂肪含量較高.親脂性的三唑磷農(nóng)藥更容易在性腺內(nèi)積累.性腺是貝類激素合成及卵黃蛋白原合成的部位[21],三唑磷在性腺中的積累及代謝必定會對貝類的生殖機能造成負面影響.然而有關(guān)三唑磷農(nóng)藥對海洋貝類的生殖毒性研究尚未見報道.因此本研究以翡翠貽貝雌貝性腺為材料,采用SSH技術(shù)構(gòu)建了三唑磷農(nóng)藥急性脅迫下貽貝正、反向消減雜交cDNA文庫,以篩選三唑磷作用下貽貝性腺中的差異表達基因.應(yīng)用 SSH 技術(shù)分離鑒定貝類差異表達基因也逐漸成為貝類毒理學和免疫學研究熱點之一. 如 Lüchmann等[22]、Tanguy等[23]、Miao等[24]、Araya等[25]和Prado-Alvarez等[26]分別構(gòu)建了柴油、農(nóng)藥、溴代阻燃劑以及病原生物作用下牡蠣(Crassostrea brasiliana和C. gigas)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)、砂海螂(Mya arenaria)以及溝紋蛤仔(Ruditapes decussatus)的SSH差減文庫,并分離和鑒定了多種差異表達基因.本研究中正、反向 cDNA 消減文庫測序后共獲得 324個 ESTs序列,其中117個EST序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知功能蛋白質(zhì)具較高同源性,假定蛋白12種,另有195個EST(60.19%)在數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源序列.同樣的問題也存在于對其它貝類EST文庫的研究中,如病原微生物作用下溝紋蛤仔血淋巴細胞中有高達60%以上的 ESTs序列在GenBank中找不到同源序列[26-27].造成這一問題的原因是由于對海洋生物尤其是貝類的大規(guī)模 ESTs分析還比較少,它們可能是目前還未知的 EST序列,又或者是因為另外一大部分ESTs是 5’或 3’-UTR 序列.

本研究中正、反向 cDNA消減文庫一共獲得 117個差異基因,極大的豐富了翡翠貽貝的ESTs數(shù)據(jù)資源.通過進一步的生物信息學分析,初步將它們分成了以下幾個類型:(1)生殖調(diào)控相關(guān)蛋白(2)DNA復(fù)制/修復(fù)/轉(zhuǎn)錄/翻譯蛋白(3)能量代謝/呼吸鏈相關(guān)蛋白;(4)核糖體蛋白(5)細胞纖維及骨架蛋白;(6)細胞信號轉(zhuǎn)導相關(guān)蛋白;(7)鈣調(diào)蛋白等.利用 Blast2GO 工具進行基因注釋和功能分類發(fā)現(xiàn),這些 ESTs 參與機體細胞周期調(diào)控、催化代謝、信號轉(zhuǎn)導、生殖調(diào)控等多種生物代謝過程.正向文庫中篩選得到了兩種細胞周期蛋白(cyclin A與cyclinB)和周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)、合子DNA復(fù)制許可因子(zygotic DNA replication licensing factor)、精子特異性蛋白(sperm-specific protein)、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶(estrogen sulfotransferase)、卵黃膜卵透明帶域蛋白(vitelline envelope zona pellucida)等7種生殖功能相關(guān)蛋白.周期蛋白通過與細胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合,并調(diào)節(jié)它們的酶活性,從而對細胞增殖分裂起了重要的監(jiān)控作用[28].周期蛋白 A與 B屬于 M 期周期蛋白

[29-30],主要負責細胞由G2期進入M期的準確性.有研究表明青蟹(Scylla paramamosain)中的周期蛋白A和B在卵巢中的表達量最高,參與了卵原細胞增殖、卵母細胞的減數(shù)分裂等卵子發(fā)生和精子發(fā)生過程[31-32].同樣在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)中也發(fā)現(xiàn)周期蛋白A和B在卵母細胞和精母細胞減數(shù)分裂調(diào)控以及卵巢成熟過程中發(fā)揮了主導性的作用[33-35].受精卵 DNA復(fù)制許可因子是一種存在于細胞核中的 DNA復(fù)制所必需蛋白因子,控制受精卵 DNA的復(fù)制.另外,雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶是硫酸化代謝雌激素(使雌激素活性降低)的主要酶,在機體雌激素合成與代謝中發(fā)揮著重要作用,如 17β-雌二醇作用下,紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)體內(nèi)該酶活性顯著升高[36].卵黃膜卵透明帶域是卵外的一道天然的物理屏障,在精卵識別和結(jié)合、誘發(fā)精子頂體反應(yīng)和穿透卵黃膜等一系列生殖事件中起著重要的作用[37].由以上討論可知,三唑磷農(nóng)藥對翡翠貽貝雌貝性腺的幾種生殖相關(guān)基因具有誘導作用,存在一定的生殖干擾毒性.相似的研究在昆蟲體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn),如Bao等通過抑制性消減雜交技術(shù)研究表明三唑磷可顯著誘導褐飛虱雌成蟲體內(nèi)卵黃蛋白原等生殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平[38].蛋白質(zhì)組學研究表明三唑磷顯著誘導雌性褐飛虱體內(nèi)卵巢絲氨酸蛋白酶和卵黃蛋白原表達水平,雄性褐飛虱體內(nèi)精子發(fā)生相關(guān)蛋白以及睪丸發(fā)育蛋白的含量也顯著升高,且三唑磷處理的雄性褐飛虱對雌性褐飛虱的生殖具有一定的刺激作用[39].

另外,正向文庫中還發(fā)現(xiàn)幾種與 DNA凋亡和修復(fù)相關(guān)的基因(DNA repair protein, mediator of DNA damage checkpoint protein和 DNA topoisomerase),表明三唑磷脅迫啟動了貽貝性腺中 DNA凋亡和修復(fù)基因的表達.正向文庫中篩選到的細胞色素、細胞素色氧化酶和NADH脫氫酶等能量代謝相關(guān)基因一般參與機體呼吸鏈電子傳遞、糖酵解和檸檬酸循環(huán),這表明三唑磷脅迫下貽貝性腺內(nèi)伴隨著緊密的能量分配和產(chǎn)生,指示機體代謝失衡的出現(xiàn).反向文庫中 DNA合成及蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控因子的響應(yīng)較明顯,如RNA解旋酶(ATP-dependent RNA helicase)、凝縮蛋白(condensin)、各類轉(zhuǎn)錄因子(helicaselike transcription factor、 membrane-bound transcription factor和transcription factor HES-1)、剪接因子(splicing factor)、延生因子(elongation factor),這表明三唑磷脅迫抑制了貽貝性腺中某些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達.另外,正、反向文庫中還發(fā)些一些細胞骨架及纖維蛋白相關(guān)基因(tubulin, actin, titin和collagen alpha等),這表明三唑磷脅迫后膜蛋白和細胞骨架蛋白的轉(zhuǎn)錄表達被激活或抑制以適應(yīng)外界環(huán)境的變化.另外,基因注釋和功能分類分析還發(fā)現(xiàn)有些 ESTs 可以同時存在于不同的細胞組分、生物學過程.如正向文庫中的 NAD依賴的蛋白去乙?；?naddependent protein deacetylase sirtuin-1isoform x2)通過基因功能注釋發(fā)現(xiàn)其可以定位于細胞質(zhì)、細胞核、線粒體等多個細胞組分,并參與葡萄糖代謝調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學過程.

4 結(jié)論

4.1 三唑磷農(nóng)藥對翡翠貽貝的 96h LC50為3.5mg/L, 與其他海洋貝類的急性毒性數(shù)據(jù)相比,翡翠貽貝對三唑磷的耐受性更強.

4.2 抑制性差減雜交技術(shù)研究表明,三唑磷農(nóng)藥作用下翡翠貽貝卵巢中細胞周期蛋白、性激素合成蛋白、DNA修復(fù)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控因子以及細胞骨架蛋白等一系列與生殖、能量代謝和應(yīng)激適應(yīng)等相關(guān)基因表達收到影響,三唑磷對翡翠貽貝的毒性涉及到生理代謝的多個方面.

4.3 正向文庫中發(fā)現(xiàn)的幾種生殖調(diào)控相關(guān)基因(細胞周期蛋白、周期蛋白依賴性蛋白激酶、合子DNA復(fù)制許可因子、精子特異性蛋白、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶和卵黃膜卵透明帶域蛋白)可能是三唑磷生殖干擾毒性作用過程中的關(guān)鍵基因.

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Construction and analysis of suppressive subtractive hybridization library from Perna viridis induced by triazophos.

SUN Wei,
ZHANG Lin-bao*, HU Ying, CAI Wei-gui, JIA Xiao-ping (Key Laboratory of Fishery Ecology Environment , Guangdong Province, Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China). China Environmental Science, 2016,36(12)：3807～3815

To study the reproductive toxicity and molecular mechanism of triazophos to marine shellfishes, a suppressive subtractive hybridization (SSH) cDNA library of gonads from female Perna viridis by actue triazophos (1mg/L) stress was constructed for the first time. A total of 117expressed sequence tags (ESTs) from the forward and reverse subtraction library exhibited homology with genes of know functions, 12ESTs related to hypothetical protein, and the remaining 195 ESTs had no significant matches in the GenBank database. Among the 117 annotated sequences,the most abundant upregulated transcripts identified in the forward SSH libraries were associated with cell cycle regulation, sex steroid biosynthesis, DNA repairing and respiratory processes, while genes encoding proteins of DNA replication, transcription and translation regulation, cytoskeleton were found in reverse SSH libraries. Altogether, the results showed that different pathways (reproduction control, respiratory processes and stress adaptation) of mussel metabolism were changed in both forward and reverse directions after exposed to triazophos. Several reproduction-related transcripts (cyclin, cyclin-dependent kinase, zygotic DNA replication licensing factor, sperm-specific protein, estrogen sulfotransferase and vitelline envelope zona pellucida domain) identified in forward library might be the key genes involved in reproductive disturbance of triazophos, and provided the basis for the study of reproductive toxicity of organophosphorus pesticide.

Perna viridis；gonads；triazophos；suppression subtractive hybridization library；ESTs

X55,S949

A

1000-6923(2016)12-3807-09

孫 偉(1981-),男,安徽巢湖人,碩士,助理研究員,主要從事海洋環(huán)境毒理學研究.發(fā)表論文5篇.

2016-04-02

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(中國水產(chǎn)科學研究院,2014A02XK02);國家自然科學基金資助項目(41306113);廣東省科技計劃項目(2013B021100014)

* 責任作者, 副研究員, zhanglinbao1984@163.com