不同工藝對(duì)麩曲中酸性蛋白酶活性的影響

程 偉，卓毓崇，楊 柳，王 西，甘浪飛，陳夢(mèng)園，羅愛民

（1.四川郎酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川古藺646523； 2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065）

不同工藝對(duì)麩曲中酸性蛋白酶活性的影響

程 偉1，卓毓崇1，楊 柳1，王 西1，甘浪飛1，陳夢(mèng)園2，羅愛民2

（1.四川郎酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川古藺646523； 2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065）

以1株蛋白酶活性較高的菌株為種子培養(yǎng)液，通過改變麩曲培養(yǎng)基配比、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)前接種量3個(gè)因素，研究不同工藝對(duì)麩曲中酸性蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明，選擇麩皮80%、谷殼20%的配比制作麩皮培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為55 h，菌液接種量為1%的條件，麩曲中酸性蛋白酶活性可以達(dá)到最大值。

麩曲； 工藝； 酸性蛋白酶； 活性

白酒在我國已有幾千年的歷史[1]，它主要以香味獨(dú)特、酒體醇厚、幽雅細(xì)膩、空杯留香等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者喜愛[2-3]。莊名揚(yáng)的研究發(fā)現(xiàn)白酒的獨(dú)特性質(zhì)與其特定的生產(chǎn)工藝有關(guān)[4]。沈玉潔等[5]從大曲中分離篩選出具有較高活性的酸性蛋白酶，在大曲制作的傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)之上，引入一定量的酸性蛋白酶制成麩曲來提升酒質(zhì)貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)的麩曲在提高酒的質(zhì)量上有明顯的作用[4]。應(yīng)用純種微生物制成麩曲應(yīng)用到白酒的生產(chǎn)中，是以后科研工作的努力方向[6]。周恒剛發(fā)現(xiàn)在白酒多次發(fā)酵過程中，隨著酒醅中殘留蛋白質(zhì)越來越少，酒味越來越寡淡，提出白酒中許多香味成分來自蛋白質(zhì)和蛋白酶[7]。但這并不是說蛋白質(zhì)含量越高，蛋白酶活力越高，白酒中香味成分就越高，酒質(zhì)就越好。在白酒的生產(chǎn)過程中，酒糟通過堆積后，經(jīng)過微生物的發(fā)酵呈偏酸性，在酵池中發(fā)揮作用的主要是酸性蛋白[8]。在白酒生產(chǎn)過程中，高級(jí)醇也主要來源于酸性蛋白酶分解蛋白質(zhì)所生成，酸性蛋白酶與白酒中香味物質(zhì)的形成有著密切的關(guān)系，因此適當(dāng)提高麩曲中酸性蛋白酶活力以使其能在發(fā)酵過程中更好地發(fā)揮作用就顯得非常重要[9]。

影響麩曲中酸性蛋白酶活性的因素的研究報(bào)道較為少見。本實(shí)驗(yàn)以高溫大曲中篩選出的1株產(chǎn)蛋白酶活力較高的細(xì)菌作為種子菌，通過研究不同制作工藝對(duì)麩曲中酸性蛋白酶的影響，并優(yōu)化培養(yǎng)條件，以期得到麩曲中酸性蛋白酶活力較高時(shí)的制作工藝，為后續(xù)麩曲的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：菌株DQ-34，Bacillus subtilis，保存于四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院食品科學(xué)與工程新技術(shù)研究室；谷殼、麩皮和小麥粉（由酒廠提供）。

試劑：福林試劑、0.4mol/L碳酸鈉溶液、0.4mol/L三氯醋酸溶液、10 g/L酪蛋白溶液、pH3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液。

儀器：G2-250-HIS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；WH-2型微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司：SW-CJ-2F型潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式透明門冷藏柜、手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器、721型分光光度計(jì)等。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，pH7.0～7.2，121℃滅菌30m in，備用。

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，pH7.0，121℃滅菌20m in，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 接種前培養(yǎng)液細(xì)菌密度的確定

取DQ-34斜面菌種1支，以無菌操作方式挑取并在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃平板，37℃條件下倒置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后選擇單菌落，無菌環(huán)境下挑取1環(huán)于40m L的LB培養(yǎng)液內(nèi)，37℃條件下160 r/m in搖床培養(yǎng)，每隔1 h取出1次，無菌條件下?lián)u勻測(cè)培養(yǎng)液在600 nm條件下的OD值，并取出1m L培養(yǎng)液，梯度稀釋后取其中3個(gè)梯度的稀釋液進(jìn)行平板涂布，37℃條件下倒置培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.3.2 酸性蛋白酶酶活性測(cè)定

酸性蛋白酶活力測(cè)定采用福林酚法[10]，酸性蛋白酶活力單位定義：1 g酶粉在40℃、pH3.0條件下，1m in水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，即為1個(gè)酸性蛋白酶活力單位，以U/g表示。

1.3.3 麩曲培養(yǎng)基配比對(duì)酸性蛋白酶活力影響

清蒸后的谷殼添加量為20%，分別混合80%的麩皮、60%的麩皮配20%的小麥粉、40%的麩皮配40%的小麥粉、20%的麩皮配60%的小麥粉、80%的小麥粉制作麩皮培養(yǎng)基，原料混勻后加60%～65%的水充分拌和。常壓條件下蒸1 h，冷卻后分裝進(jìn)1 L的三角瓶后用雙層紗布封口，于121℃、0.1MPa條件下滅菌30m in。將滅菌完成的麩皮培養(yǎng)基在無菌操作臺(tái)中冷卻，備用。向各培養(yǎng)基接種體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%（v∶m=3m L∶100 g）的種子培養(yǎng)液，搖勻后以37℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干24 h，粉碎測(cè)酸性蛋白酶活力[11]，每個(gè)配比組合做3個(gè)平行樣。

1.3.4 麩曲培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酸性蛋白酶活力影響

在滅菌冷卻后的麩皮培養(yǎng)基（20%谷殼、80%麩皮）中接種體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的種子培養(yǎng)液，搖勻后于37℃條件下分別培養(yǎng)45 h、50 h、55 h、60 h、65 h和70 h，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干24 h，粉碎測(cè)酸性蛋白酶活力，每種培養(yǎng)時(shí)間做3個(gè)平行樣。

1.3.5 麩曲培養(yǎng)前接種量對(duì)酸性蛋白酶活力影響

在滅菌冷卻后的麩皮培養(yǎng)基（20%谷殼、80%麩皮）中分別接種體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%的種子培養(yǎng)液，充分搖勻后在37℃條件下培養(yǎng)55 h，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干24 h，粉碎測(cè)酸性蛋白酶活力，每種接種量做3個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DQ-34液體培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

培養(yǎng)時(shí)間從1～3 h細(xì)菌數(shù)量緩慢增長(zhǎng)，OD值變化?。◤?.026到0.040）。培養(yǎng)時(shí)間從3 h到6 h細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)迅速，OD值由0.040增加到0.420。之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)速度逐漸放緩，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為9 h時(shí)，培養(yǎng)液中細(xì)菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值達(dá)到8.821，OD值達(dá)到1.060。

由圖1可知，為了保證每次接種到麩皮培養(yǎng)基中的細(xì)菌的數(shù)量和生長(zhǎng)狀態(tài)一致，選取對(duì)數(shù)期接近穩(wěn)定期的細(xì)菌作為種子細(xì)菌，當(dāng)LB液體培養(yǎng)基600 nm條件下OD值為0.700左右時(shí)，停止培養(yǎng)并進(jìn)行麩皮培養(yǎng)基接種。

圖1 細(xì)菌DQ-34生長(zhǎng)曲線

2.2 麩皮培養(yǎng)基配比對(duì)產(chǎn)酸性蛋白酶的影響

用不同配比的麩皮和小麥粉制成的培養(yǎng)基培菌完成后測(cè)其酸性蛋白酶活力值，其結(jié)果見圖2。圖2表明，隨著培養(yǎng)基中麩皮含量的降低，酸性蛋白酶活力值呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化規(guī)律。

圖2 麩皮培養(yǎng)基配比對(duì)DQ-34產(chǎn)酸性蛋白酶的影響

酸性蛋白酶活力在麩皮含量80%時(shí)其酸性蛋白酶活力最高（19.003U/g），而在麩皮和小麥粉含量各為40%時(shí)最低（9.304 U/g），之后隨著麩皮含量的增加逐漸增大，但是仍低于麩皮含量較高時(shí)的值。麩皮含量高時(shí)培養(yǎng)基較蓬松，DQ-34是好氧性細(xì)菌，在氧氣較充足的條件下能更好地生長(zhǎng)，相應(yīng)產(chǎn)生的蛋白酶也較多，所以麩皮含量從80%降到60%、40%時(shí)，酸性蛋白酶活力也迅速下降達(dá)到16.250U/g、9.304U/g。麩皮含量降到20%時(shí)，蛋白酶活力不降反升，為12.767U/g，當(dāng)麩皮含量為0%時(shí)，蛋白酶活力稍有下降，為12.331U/g，這與小麥粉中蛋白質(zhì)含量比麩皮中的高，培養(yǎng)前期培養(yǎng)基較蓬松時(shí)積累了一定的蛋白酶有關(guān)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的水吸附在培養(yǎng)基質(zhì)上不易排出，細(xì)菌生長(zhǎng)速度減緩，培養(yǎng)結(jié)束后其酸性蛋白酶活力較低。

2.3 麩曲培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸性蛋白酶的影響

培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)微生物的生長(zhǎng)速度和代謝能力有著重要的影響[12]。由圖3可知，在所選的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，培養(yǎng)時(shí)間為45 h時(shí)，酸性蛋白酶活力最低，只有17.214U/g，培養(yǎng)時(shí)間為50 h時(shí)，酸性蛋白酶活力為19.204 U/g。55 h時(shí)酶活力達(dá)到最大值30.101 U/g，之后延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到60 h、65 h時(shí)，酶活力逐漸下降到24.639U/g、22.681U/g。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為70 h時(shí)，酸性蛋白酶活力值已經(jīng)降到19.679U/g。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酸性蛋白酶活力在開始的55 h內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì)，說明此時(shí)的菌體數(shù)在不斷增長(zhǎng)，達(dá)到頂點(diǎn)后隨時(shí)間的推移逐漸下降，說明在底物不斷消耗的同時(shí)，菌體生長(zhǎng)也進(jìn)入衰亡期，導(dǎo)致產(chǎn)酶及酶活性也逐漸下降。

圖3 麩曲培養(yǎng)時(shí)間對(duì)DQ-34產(chǎn)酸性蛋白酶的影響

2.4 麩曲接種量對(duì)產(chǎn)酸性蛋白酶的影響

不同接種量的麩曲培養(yǎng)完成后酸性蛋白酶活力值變化情況見圖4，由圖4可知，當(dāng)接種量從1%增加至5%的過程中，酸性蛋白酶活力從97.145 U/g開始一直下降，分別為81.393U/g、30.101U/g、24.270U/g、5.706U/g。

酸性蛋白酶活力與接種量呈負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)殡S著接種量的增加，進(jìn)入麩皮培養(yǎng)基的初始細(xì)菌數(shù)量增加，培養(yǎng)基的消耗速度加快，這些處于對(duì)數(shù)期的種子細(xì)菌更快地結(jié)束了調(diào)整期，通過了對(duì)數(shù)期進(jìn)入了穩(wěn)定期并接著走向衰亡期，而酸性蛋白酶主要產(chǎn)生于對(duì)數(shù)期，所以對(duì)數(shù)期時(shí)間持續(xù)長(zhǎng)的麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)完成后酸性蛋白酶活力就高。從這一方面來看，適當(dāng)減少接種量有助于延長(zhǎng)種子細(xì)菌在麩皮培養(yǎng)基中對(duì)數(shù)期持續(xù)的時(shí)間，增加酸性蛋白酶活力。

3 結(jié)論

圖4 麩曲接種量對(duì)DQ-34產(chǎn)酸性蛋白酶的影響

本研究探討了麩曲中產(chǎn)蛋白酶菌中的酸性蛋白酶活性與不同制作工藝的關(guān)系，得到了麩曲中酸性蛋白酶活力最大時(shí)的制作工藝。麩曲培養(yǎng)基的配比對(duì)酸性蛋白酶的影響與王秋辰[13]等在固態(tài)發(fā)酵中酸性蛋白酶條件優(yōu)化中結(jié)果一致。隨著培養(yǎng)基中麩皮用量的降低，酸性蛋白酶活力值呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化規(guī)律。隨麩曲培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酸性蛋白酶活力在開始的55 h內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì)，達(dá)到頂點(diǎn)后隨時(shí)間的推移逐漸下降。隨著麩曲接種量的增加，酸性蛋白酶活力呈下降趨勢(shì)。最終確定麩曲在麩皮80%、谷殼20%的配比制作麩皮培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)時(shí)間為55 h，菌液接種量為1%的條件下時(shí)酸性蛋白酶的活性最大。

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Influenceof Different Techniqueson Acid Protease Activity in Fuqu

CHENGWei1,ZHUOYuchong1,YANG Liu1,WANG Xi1,GAN Langfei1,CHENMengyuan2and LUOAimin2
(1.Sichuan Langjiu Group Co.Ltd.,Gulin,Sichuan 646523;2.College of Light Industry, Textileand Food Engineering,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610065,China)

Using a strain w ith high protease activity as the seed,we investigated the influence of different techniques on acid protease activity in Fuqu by changing the culture composition,the culture time and the inoculation quantity.The results showed that,the highestacid protease activity was achieved when the culture consisted of 80%bran and 20%husk,culture timewas 55 h,and inoculation quantity was 1%.(Trans. by HUANG Xiaoli)

Fuqu;technique;acid protease;activity

TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）12-0040-03

10.13746/j.njkj.2016349

四川省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014SC0013）。

2016-11-24

程偉（1973-），男，本科，白酒國家評(píng)委，郎酒集團(tuán)公司高級(jí)工程師，主要從事白酒嘗評(píng)、勾調(diào)和釀酒生產(chǎn)科研工作。

羅愛民（1971-），男，四川大學(xué)副教授，博士，主要從事釀酒生產(chǎn)科研工作。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-12-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161202.1631.007.htm l。