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(中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長沙 410078)

·文獻(xiàn)綜述·

肺纖維化動物模型研究進(jìn)展

李燕飛，胡長平，李峰*

(中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長沙 410078)

肺纖維化是以肺泡上皮細(xì)胞損傷、肺成纖維細(xì)胞大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)聚集增多為主要特征的一類嚴(yán)重肺間質(zhì)疾病。然而，目前肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床上的早期防治亦未獲得突破性進(jìn)展。為了闡明肺纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療藥物，已建立多種肺纖維化動物模型，主要分為基因相關(guān)模型與非基因相關(guān)模型，前者主要指基因工程動物模型，后者包括環(huán)境性、藥物/毒物性及其他類型的動物模型。本文綜述各種肺纖維化動物模型的最新建模方法、發(fā)病機(jī)制、應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)。

肺纖維化； 博來霉素； 動物模型

肺纖維化是一種嚴(yán)重的間質(zhì)性肺疾病，其病理特點(diǎn)為肺泡上皮細(xì)胞損傷和增殖、基底膜剝蝕、肺泡實(shí)變和成纖維細(xì)胞病灶，并最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難、咳嗽、呼吸生理機(jī)能受限及氣體交換障礙等癥狀[1]。肺纖維化按病因可分為原因已明和原因未明兩大類，其中病因未明的特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是臨床上最常見最嚴(yán)重的肺纖維化，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)。IPF預(yù)后差，診斷后平均生存期僅3～5年。部分患者可出現(xiàn)IPF的急性惡化，呼吸困難(< 1個月)急性發(fā)作伴隨組織缺氧加劇，最終呼吸衰竭而死亡[2]。為了闡明肺纖維化(尤其是IPF)的發(fā)病機(jī)制和尋找新的藥物靶點(diǎn)，已建立多種肺纖維化動物模型。目前肺纖維化動物模型可分為基因相關(guān)模型與非基因相關(guān)模型，前者主要指基因工程動物模型，非基因相關(guān)模型主要指在相同或相似的遺傳背景下，通過環(huán)境因素、藥物/毒物或其他因素誘導(dǎo)得到的肺纖維化模型。本文就目前出現(xiàn)的肺纖維化動物模型進(jìn)行分類并綜述其最新進(jìn)展。

1 基因相關(guān)模型

1.1轉(zhuǎn)基因模型

1.1.1 細(xì)胞因子過表達(dá)模型 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)細(xì)胞因子造成嚴(yán)重的肺纖維化，主要細(xì)胞因子包括：TGF-β、TGF-α、IL-13、TNF-α和IL-1β等[1]。一般通過病毒載體過表達(dá)特定的細(xì)胞因子。常用的病毒載體有腺病毒和慢病毒，其中腺病毒多用于短暫性地過表達(dá)細(xì)胞因子，慢病毒則可用于長期基因過表達(dá)分析[3]。此外，一些肺特異性啟動子(Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中的表面活性蛋白SPC啟動子、支氣管上皮細(xì)胞中的CC-10啟動子以及成纖維細(xì)胞中的Ⅰ型膠原啟動子)可介導(dǎo)促纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)，通過啟動這些組織特異性啟動子可誘導(dǎo)肺纖維化形成[4]，因此相比于傳統(tǒng)造模方法，細(xì)胞因子過表達(dá)模型可在多種組織細(xì)胞類型中探索促纖維化細(xì)胞因子誘導(dǎo)肺纖維化的下游信號通路，也能研究多種促纖維化細(xì)胞因子之間的交叉調(diào)節(jié)作用。這類模型靶點(diǎn)明確，對篩選抗纖維化藥物意義重大。此外，如果通過誘導(dǎo)時間特定啟動子，可使目的基因只表達(dá)于成年小鼠中，用于模擬肺纖維化在成年晚期出現(xiàn)的臨床特征。通常介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因所用的病毒載體本身具潛在危害性，且人類肺纖維化的過程是多基因多種因子共同作用的結(jié)果，因此這種單一的過表達(dá)基因模型與多基因相關(guān)的肺纖維化存在一定差異[5]。

1.1.2 靶向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷模型 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells，AECs)受損與肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6]。目前靶向損傷Ⅱ型AECs的模型是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將白喉毒素受體(diphtheria toxin receptor，DTR)與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞啟動子(surfactant protein C，SPC)通過載體融合，形成SPC-DRT表達(dá)框，然后將SPC-DTR表達(dá)框注入C57Bl/6小鼠受精卵中，建立Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)DTR的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。用白喉毒素(diphtheria toxin ，DT)反復(fù)刺激DTR轉(zhuǎn)基因小鼠可特異性損傷肺泡上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)增殖性反應(yīng)，使肺間質(zhì)增厚[7]。該模型模擬肺纖維化發(fā)生過程中Ⅱ型AECs的病理變化，可用于闡明Ⅱ型AECs損傷所致的成纖維細(xì)胞增殖、膠原沉積和肺泡破裂的下游機(jī)制。

1.2基因突變模型研究發(fā)現(xiàn)遺傳性的特發(fā)性肺纖維化與四種基因的突變密切相關(guān)，這四種基因分別是：肺表面活性蛋白C (SFTPC)、肺表面活性蛋白A2(SFTPA2)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和端粒酶RNA復(fù)合物(TERC)[8]。

SFTPC和 SFTPA2由Ⅱ型AECs特異性分泌，參與Ⅱ型AECs蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊反應(yīng)。當(dāng)SFTPC和SFTPA2發(fā)生突變時可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白錯誤折疊和聚集從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Lawson等將突變的人L188Q SFTPC導(dǎo)入小鼠Ⅱ型AECs中，小鼠在低劑量博來霉素誘導(dǎo)下易形成肺纖維化，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以加劇纖維化反應(yīng)[9]。因此，SFTPC和SFTPA2突變模型可用于研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在特發(fā)性肺纖維化中的作用及機(jī)制。

端粒是染色體末端的保護(hù)性結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞分裂過程中端粒逐漸變短，當(dāng)端粒短到特定長度會激活持續(xù)的端粒DNA損傷反應(yīng)，隨后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或凋亡。而端粒酶能以自身TERC為模板，在TERT催化下，將重復(fù)序列合成到染色體末端從而補(bǔ)償損耗的端粒。當(dāng)TERT和TERC發(fā)生突變時，可導(dǎo)致端粒功能發(fā)生紊亂、端粒變短[10]。單獨(dú)敲除小鼠TERT或TERC不能自發(fā)形成肺纖維化，用博來霉素(0.5 mg/kg)處理TERT-/-小鼠可成功誘導(dǎo)肺纖維化形成，而此劑量的博來霉素不足以誘導(dǎo)野生型小鼠出現(xiàn)肺纖維化[11]。因此，這種突變模型可用于研究端粒及端粒酶在特發(fā)性肺纖維化中的作用及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 非基因相關(guān)模型

2.1環(huán)境因素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型環(huán)境因素在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，通過將動物暴露于不同的環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生肺纖維化，主要包括以下三種類型。

2.1.1 高氧 長時間暴露于高氧環(huán)境中可導(dǎo)致多器官和組織損傷。肺是高濃度氧吸入后直接作用的靶器官，因此最易受損，形成高氧性急性肺損傷并進(jìn)一步發(fā)展成漸進(jìn)性肺纖維化[12]。目前，高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷動物模型常采用的氧濃度為95%～100%，暴露時間為72～96小時。長時間暴露于50%～85%氧濃度環(huán)境中可誘導(dǎo)形成漸進(jìn)性肺纖維化。例如，將CD-1小鼠(3～4周齡)置于80%高氧環(huán)境中168小時，小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重肺纖維化[13]。嚙齒類動物對高氧的耐受性具品種差異，在>95%氧濃度環(huán)境中暴露48～60小時，F(xiàn)ischer大鼠相比于SD大鼠，胸腔積液更多，總蛋白濃度更高。同樣地，C57BL/6小鼠比C3H/HeJ小鼠對高氧更敏感[14]。此類模型主要應(yīng)用于模擬臨床氧療引起的急性肺損傷和肺纖維化。

2.1.2 輻射 在臨床上，輻射誘導(dǎo)的肺纖維化是長期體外放射治療腫瘤過程中產(chǎn)生的副作用。用小鼠造模時通常采用的劑量是10～20 Gy，局部照射(只照射胸腔)，給予輻射24周，肺纖維化形成。如給予C57BL/6小鼠胸部16Gy輻射，1～8周，小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤逐漸增多，肺泡壁和肺間質(zhì)增厚，至24周，肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂并出現(xiàn)塌陷，形成纖維化[15]。在輻射誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，骨髓源性細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)在肺纖維化區(qū)域聚集和增殖，生成自由基和促炎、促纖維化因子如TNF-α、TGF-β進(jìn)一步促進(jìn)肺纖維化[16]。這種模型是最早用于闡明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)作用的動物模型[17]。同時該模型由于不同品種的小鼠對輻射損傷的敏感性不同從而便于遺傳因素和臨床的相關(guān)性研究，但這種模型造模時間長，實(shí)驗(yàn)成本高。

2.1.3 無機(jī)粉塵 將無機(jī)粉塵如石棉、二氧化硅等滴入嚙齒類動物肺中可導(dǎo)致纖維結(jié)節(jié)形成，模擬接觸石棉和二氧化硅的職業(yè)人群中出現(xiàn)的石棉肺和矽肺疾病過程。石棉和二氧化硅均可通過吸入途徑和氣管內(nèi)滴入途徑進(jìn)入小鼠肺中引起肺纖維化。氣管內(nèi)滴入途徑可快速誘導(dǎo)肺纖維化形成，如氣管內(nèi)給予C57BL/6小鼠角閃石纖維0.1 mg，14天后小鼠肺中出現(xiàn)明顯纖維化[18]。氣管內(nèi)給予C57BL/6小鼠二氧化硅(0.2 g/kg)14天后，末端支氣管-肺泡管區(qū)域出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣纖維化，28天后，膠原大量沉積[19]。通過吸入途徑造模則需較長時間，如將C3H/HeN小鼠置于方石英霧化劑中(70 mg/m3,5 h/天)12天，其肺中出現(xiàn)纖維結(jié)節(jié)，肺淋巴組織增多，12～16周后纖維化反應(yīng)明顯[20]。相比氣管內(nèi)滴入途徑，吸入途徑所致纖維化更能模擬人石棉肺和矽肺的病理過程。在此類模型中，不同物質(zhì)誘導(dǎo)肺纖維化所產(chǎn)生的病理學(xué)變化有顯著差異，但這些物質(zhì)在肺部沉積均可引起肺泡巨噬細(xì)胞聚集，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并釋放促纖維化生長因子，從而誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡、成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積，最終導(dǎo)致纖維化形成。另外，二氧化硅可激活固有免疫系統(tǒng)，引起巨噬細(xì)胞NALP3炎性小體活化，因而常被用于研究肺纖維化過程中的固有免疫調(diào)節(jié)[21]。石棉纖維和二氧化硅留存在肺中可使纖維化結(jié)節(jié)圍繞其沉積部位生長，因此通過組織學(xué)檢查可定位纖維化區(qū)域。此外，這些無機(jī)粉塵不易從肺中被清除，可形成持久的纖維化。但這種模型需特定的吸入腔，產(chǎn)生的纖維化反應(yīng)具有品種差異，這使其應(yīng)用受到限制。

2.2藥物/毒物誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型

2.2.1 博來霉素 博來霉素是一種多肽類抗腫瘤藥物，具有肺毒性。在過去幾十年中，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型是應(yīng)用最普遍的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型，已在多種動物中應(yīng)用，如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、犬和靈長類動物，其中，小鼠最常用[22]。

博來霉素的給藥途徑包括肺特異性給藥(氣管內(nèi)滴入)和系統(tǒng)性給藥(腹腔注射、皮下注射和靜脈注射)(表1)，可單劑量給藥也可多次反復(fù)給藥。其中，靜脈注射和氣管內(nèi)給藥是最常用的給藥途徑[4]。無論那種給藥途徑，博來霉素均可直接損傷細(xì)胞，其機(jī)制是通過誘導(dǎo)DNA鏈斷裂、生成自由基并引起氧化應(yīng)激，隨后出現(xiàn)細(xì)胞壞死和凋亡、炎癥、纖維化[23]。采用不同的給藥途徑，博來霉素最初損傷的細(xì)胞類型不同。因此，在用博來霉素造模時，最初的損傷部位可通過給藥途徑控制(表1)[22]。博來霉素可以在相對較短的時間內(nèi)誘導(dǎo)纖維化，氣管內(nèi)滴入需2～4周，系統(tǒng)給藥需4～12周[24]。

系統(tǒng)給藥方式能模擬人在化療過程中使用博來霉素產(chǎn)生肺毒性的過程，臨床相關(guān)性好。肺特異性給藥方式(氣管內(nèi)給藥)可采用直接氣管內(nèi)注射、注入干粉或氣管插管術(shù)。這種給藥方式單劑量即可使動物在給藥后14天出現(xiàn)肺纖維化，21～28天纖維化反應(yīng)加強(qiáng)至最重。然而，經(jīng)過這個階段后，纖維化自發(fā)消退[23]。氣管內(nèi)多次給藥解決了單劑量給藥的局限性，這種給藥方式可模擬肺慢性損傷過程，使纖維化反應(yīng)更持久。如每隔一周給予博來霉素0.04 U，給藥8次。在最后一次給予博來霉素后10周，纖維化仍很明顯[25]。

表1博來霉素肺纖維化動物模型的不同給藥途徑比較

給藥途徑分類損傷部位給藥劑量及特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)肺特異性給藥氣管內(nèi)給藥直接損傷肺泡上皮細(xì)胞1．24～4U/kg只需單次給藥；形成纖維化所需時間短纖維化具自限性系統(tǒng)性給藥靜脈注射最初損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨后損傷肺泡上皮細(xì)胞30U/kg，每周2次，給藥4～8周；胸膜下纖維化臨床相關(guān)不適應(yīng)于所有動物；形成纖維化時間長腹腔注射最初損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨后損傷肺泡上皮細(xì)胞15～35U/kg；胸膜下纖維化臨床相關(guān)需多劑量給藥皮下給藥最初損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨后損傷肺泡上皮細(xì)胞150U/kg；在動物背部注射可在短時間內(nèi)模擬纖維化漸進(jìn)性特征需每天注射或需微滲透泵給藥

2.2.2 百草枯 百草枯是一種常用的接觸性速效除草劑。肺是百草枯中毒的主要靶器官，繼發(fā)性損傷產(chǎn)生肺纖維化[26]。百草枯中毒涉及多種機(jī)制，現(xiàn)普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激、炎癥損傷是最主要的致病機(jī)制[27]。在動物實(shí)驗(yàn)研究中，百草枯給藥途徑主要是灌胃給藥和腹腔注射，采用的動物一般為大鼠和小鼠。如：用Wistar雄性大鼠一次性灌胃百草枯溶液(20%)70 mg/kg，給藥后7天、14天肺纖維化明顯[28]。腹腔注射百草枯造急性肺損傷模型時，劑量可增大(可達(dá)30 mg/kg)，而造肺纖維化模型時，劑量需略微減少(20 mg/kg或更低)[29]。目前尚無治療百草枯所致肺纖維化的特效藥物，因此，此類動物模型是闡明百草枯中毒發(fā)病機(jī)制及找尋有效藥物的重要工具。

2.2.3 異硫氰酸熒光素 將異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)通過氣管內(nèi)給藥滴入小鼠肺中，可使小鼠肺泡和血管滲透性增加，在14～21天形成肺纖維化[3]。這種模型常用于研究趨化因子信號受體2(CCR2)與其配體CCL12在招募纖維細(xì)胞時的相互作用(這種相互作用可使纖維化加劇)[30]。FITC是一種半抗原，可與肺中薄壁組織蛋白結(jié)合，在其沉積部位產(chǎn)生持續(xù)刺激，使纖維化反應(yīng)持久。如氣管內(nèi)滴入FITC 0.007 mg/g，纖維化反應(yīng)可持續(xù)6個月。因此，這種模型可用于長期性肺纖維化研究[31]。 FITC作為一種熒光素，可通過免疫熒光定位纖維化發(fā)生的區(qū)域。此外，F(xiàn)ITC適用于多個品種的小鼠，對Balb/c和C57BL/6小鼠均有明顯作用。但這種模型也存在明顯的缺點(diǎn)，如無臨床相關(guān)性、纖維化反應(yīng)程度可變性大、FITC溶液必須新鮮配置并進(jìn)行超聲處理[3]。

2.3其他肺纖維化模型過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型是將特發(fā)性肺纖維化患者肺成纖維細(xì)胞靜脈注射至免疫缺陷的NOD/SCID/beige(非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠中，小鼠肺部出現(xiàn)病理性重構(gòu)，并能激活小鼠上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞發(fā)生病理重構(gòu)和增殖，這是目前成纖維細(xì)胞自發(fā)性病理表型的最好證據(jù)[32,33]。過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)移的成纖維細(xì)胞可通過細(xì)胞滲透性染料示蹤，纖維化發(fā)展相對迅速(注射后30～35天)且能持續(xù)數(shù)月。該模型的出現(xiàn)使研究不同類型肺纖維化患者的細(xì)胞成為可能，有助于進(jìn)一步了解特發(fā)性肺纖維化的異質(zhì)性，同時為研究特異性的抗纖維化藥物提供了新的思路[34]。

另外，隨著對肺纖維化研究的不斷深入，目前出現(xiàn)了更多與臨床相關(guān)的肺纖維化模型。如年老動物肺纖維化模型促進(jìn)了肺纖維化的年齡相關(guān)性研究[35]；用γ-皰疹病毒-68感染FITC入侵的小鼠，可模擬特發(fā)性肺纖維化的急性惡化過程[36]。在其他的疾病模型如糖尿病、Hermansky-Pudlak綜合征模型中，也可觀察到實(shí)驗(yàn)動物肺纖維化。研究者可根據(jù)研究目的選用不同的肺纖維化動物模型。

3 展望

綜上所述，基因相關(guān)模型基于單基因或雙基因的肺纖維化研究，為肺纖維化的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。非基因相關(guān)模型中，環(huán)境因素誘導(dǎo)的肺纖維化模型具很好的臨床相關(guān)性，對闡明發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要；藥物/毒物性肺纖維化建模方法相對簡單且可通過多種途徑給藥，有利于研究不同因素誘導(dǎo)肺纖維化的相關(guān)機(jī)制，因此被廣泛應(yīng)用；其他肺纖維化模型如過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型可研究成纖維細(xì)胞的自主作用，年齡相關(guān)模型、急性惡化模型則能更好的模擬疾病的臨床特征。然而，目前對肺纖維化動物模型的研究多集中于小動物，在大動物中的研究甚少。另外，由于人類肺纖維化的病理學(xué)進(jìn)程復(fù)雜并具時空異質(zhì)性，且疾病的形成與發(fā)展受遺傳、生物化學(xué)、環(huán)境和表型的相互作用影響，動物模型并不能完全模擬人類肺纖維化過程，還需進(jìn)一步完善和探索。隨著研究的深入，相信肺纖維化動物模型將進(jìn)一步揭示肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律，并更好的服務(wù)于臨床治療藥物的發(fā)現(xiàn)。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.02.025

2016-01-08；

2016-02-14

國家自然科學(xué)基金(81473209；91439105).

*通訊作者，E-mail：leefeng@csu.edu.cn.

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