吳德佩， 肖 瑛， 張瑩瑩， 曾令萍， 石明雋， 王圓圓， 郭 兵

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

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糖尿病大鼠腎組織中PTEN/AKT/mTOR通路對(duì)自噬的調(diào)控作用*

吳德佩， 肖 瑛△， 張瑩瑩， 曾令萍， 石明雋， 王圓圓， 郭 兵

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

目的： 觀察糖尿病大鼠腎組織中PTEN和自噬水平的變化，探討糖尿病腎病中PTEN/AKT/mTOR通路對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制。方法:將SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)和糖尿病組(DM組)，每組各8只。用鏈脲佐菌素復(fù)制DM大鼠模型。于成模后10周處死大鼠后測(cè)定相應(yīng)生化指標(biāo)和腎臟指數(shù)，免疫組化觀察腎小管上皮細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)部位；Western blotting法檢測(cè)腎組織LC3、PTEN及PTEN/AKT/mTOR通路的變化；real-time PCR檢測(cè)腎組織PTEN的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:DM組的血糖、24 h尿蛋白量和腎臟指數(shù)均顯著高于NC組(P<0.05)。與NC組相比，DM組大鼠腎組織的LC3I和LC3II水平明顯降低(P<0.05)。PTEN主要分布于腎小管上皮細(xì)胞中，DM組PTEN蛋白的表達(dá)水平明顯低于NC組(P<0.05)。DM大鼠腎組織中，PTEN/AKT/mTOR通路的活性增高。結(jié)論:糖尿病大鼠腎臟組織中細(xì)胞自噬水平下降，而參與自噬調(diào)控的PTEN/AKT/mTOR通路活性升高，提示其自噬水平的變化可能受到PTEN/AKT/mTOR通路的調(diào)節(jié)。

自噬; 糖尿病腎病; PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路

糖尿病腎病(diabetic nephrapathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的常見(jiàn)原因[1]，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。自噬是細(xì)胞的自我吞噬過(guò)程，即細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和生物大分子物質(zhì)，它可參與細(xì)胞的分化和發(fā)育，是一種高度保守的維持自身穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[2-3]。DN發(fā)生時(shí)腎組織中存在蛋白質(zhì)損傷，而自噬途徑是細(xì)胞內(nèi)損傷蛋白質(zhì)清除的主要途徑之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道，DN發(fā)生時(shí)自噬水平明顯降低[4]。第10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)編碼具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重磷酸酶，它可以負(fù)性調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/AKT通路。本課題組前期研究結(jié)果顯示，在糖尿病大鼠腎臟中PTEN表達(dá)明顯減少，促進(jìn)了腎纖維化的發(fā)生發(fā)展[5-6]。另有文獻(xiàn)報(bào)道PTEN可以調(diào)控自噬的變化水平[7]，但在DN中，PTEN的表達(dá)與自噬形成關(guān)系尚不明確，因此本研究擬采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)復(fù)制Ⅰ型糖尿病大鼠模型，通過(guò)多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)PTEN/AKT/mTOR通路對(duì)DM大鼠腎臟組織自噬水平的調(diào)控，以期為糖尿病腎病的防治提供新的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(160±20) g，購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司，許可證號(hào)為[SCXK(京)2009-0004]。

2 主要試劑

STZ(購(gòu)自Sigma)；兔抗大鼠PTEN單克隆抗體(Abcam)；兔抗大鼠LC3A/B抗體和兔抗大鼠p-mTOR(Ser2448)多克隆抗體(CST)；兔抗大鼠mTOR多克隆抗體(Proteintech)；兔抗大鼠AKT多克隆抗體和兔抗大鼠p-AKT(Thr308)多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(武漢普美克生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色劑和免疫組織化學(xué)SP兩步法檢測(cè)試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜和Whatman 3MM濾紙(Millipore)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物研究所)；檸檬酸、檸檬酸三鈉、總RNA提取試劑盒以及PTEN和β-actin引物(上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)；2×SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型的制備及分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周，造模前稱重，禁食6～8 h，采用乙醚麻醉，16只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(normal control，NC組)和DM組，每組8只。DM組大鼠一次性尾靜脈注射溶于pH 4.5、0.01 mol/L無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的鏈脲佐菌素，劑量為55 mg/kg； NC組大鼠予以尾靜脈注射等體積STZ溶媒枸櫞酸鈉緩沖液。注射后72 h，尾靜脈采血測(cè)空腹血糖，以血糖值大于或等于16.7 mmol/L為造模成功。

3.2 血、尿及腎組織采集 于實(shí)驗(yàn)10周處死各組大鼠，處死前1 d用代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，收集的尿液取部分離心后，取上清，于-20 ℃保存；處死前禁食6～8 h，麻醉后稱重，股動(dòng)脈取血，分離血清，-20 ℃保存；開腹取雙側(cè)腎臟，去掉包膜及周圍脂肪組織，稱重后一部分用4%中性甲醛固定，其余放于-80 ℃保存。以腎重(mg)與體重(kg)的比值為腎臟指數(shù)(kidney index，KI)。

3.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 用氧化酶法測(cè)血糖(blood glucose，BG)，雙縮脲法測(cè)尿總蛋白(urine protein，UP)，以24 h尿量與尿蛋白濃度的乘積為24 h尿總蛋白量。

3.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 用4%中性甲醛固定腎組織，經(jīng)包埋、固定，然后行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。

The sun goes down without twilight, rain or snow will come next.

3.5 免疫組織化學(xué)染色 3 μm厚腎組織石蠟切片經(jīng)微波修復(fù)抗原，采用SP法檢測(cè)PTEN(1∶100)在各組大鼠腎組織中的表達(dá)， I 抗4 ℃孵育過(guò)夜，同時(shí)以PBS作為陰性對(duì)照，取出室溫10 min，PBS沖洗，II 抗室溫孵育40 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染，固定封片，脫水透明，晾干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并攝取圖像。

3.6 Western blotting法檢測(cè)PTEN、AKT、p-AKT(Thr308)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)和LC3的蛋白水平 取大鼠腎皮質(zhì)每 0.2 g用蛋白裂解液(按RIPA∶PMSF=100∶1的比例制備)1 mL，勻漿器研磨成液體，離心取上清測(cè)得蛋白含量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyaerylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，然后以300 mA電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后分別加 I 抗β-actin(1∶4 000)、PTEN(1∶1 000)、AKT(1∶300)、p-AKT(Thr308)(1∶400)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(Ser2448)(1∶600)和LC3(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；加II抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL試劑顯影曝光。LC3和PTEN以β-actin蛋白條帶作內(nèi)參照；磷酸化p-AKT(Thr308)和p-mTOR(Ser2448)分別以總AKT及mTOR蛋白條帶作內(nèi)參照，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image Lab圖像分析軟件對(duì)每個(gè)條帶灰度進(jìn)行定量分析。

3.7 Real-time PCR檢測(cè)PTEN的mRNA表達(dá) TRIzol法提取總RNA；核酸蛋白分析儀測(cè)濃度及純度后，按Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作合成cDNA，通過(guò)Bio-Rad CFX96熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參照，目的基因的相對(duì)含量以2-ΔΔCt表示，引物序列和退火溫度見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件

Table 1. The sequences and conditions of the primers used in real-time PCR

NameThesequencesoftheprimer(5'-3')AnnealingtemperaturePTENF:CAATGTTCAGTGGCG-GAACTT60℃R:GGCAATGGCTGAGG-GAACTβ-actinF:GCCAACACAGTGCTGTCT60℃R:AGGAGCAATGATCTT-GATCTT

F： forward; R: reverse.

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，再采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組大鼠的腎臟指數(shù)、血糖和尿蛋白的變化

糖尿病組大鼠腎臟指數(shù)、血糖及24 h尿蛋白均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正常組和糖尿病組大鼠血糖、腎臟指數(shù)和24 h尿蛋白量的變化

Table 2.The levels of kidney index (KI), blood glucose (BG), 24 h urine protein (24 h UP) in normal control (NC) group and diabetic (DM) group (Mean±SD.n=8)

*P<0.05 vs NC.

2 兩組大鼠腎臟組織的病理變化

HE染色可見(jiàn)正常大鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，間質(zhì)中未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。糖尿病組可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，部分腎小管管腔擴(kuò)張，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The histological changes of the renal tissues in the control and diabetic rats (HE staining, ×200).

圖1 正常組和糖尿病組大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)觀察

3 糖尿病大鼠腎組織中自噬水平明顯下調(diào)

與正常對(duì)照組相比，糖尿病組LC3I蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與正常對(duì)照組相比，糖尿病組LC3II蛋白的表達(dá)也明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The protein expression of LC3 in the control and diabetic rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC.

圖2 LC3在正常組和糖尿病組大鼠腎組織中的表達(dá)

4 糖尿病大鼠腎組織中PTEN表達(dá)明顯下調(diào)

免疫組化結(jié)果顯示正常對(duì)照組PTEN蛋白高表達(dá)于集合管和腎小管，腎間質(zhì)及腎血管外膜也有少量表達(dá)，但糖尿病組大鼠腎組織PTEN的表達(dá)明顯減少,見(jiàn)圖3；通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠腎皮質(zhì)中的PTEN蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，real-time PCR結(jié)果顯示糖尿病組大鼠腎皮質(zhì)PTEN的mRNA水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The expression of PTEN in the renal tissues of the control and diabetic rats detected by immunohistochemical staining (×200).

圖3 PTEN在正常組和糖尿病組大鼠腎組織中的表達(dá)

Figure 4.The expression of PTEN at mRNA and protein levels in the renal tissues of control group and diabetic group. A: Western blotting analysis for renal PTEN. The representative images of Western blotting shows 2 samples per group. β-actin was used for normalization to calculate the relative abundance of PTEN in control group and diabetic group. B: the graphical presentations show the relative abundance of PTEN mRNA in control group and diabetic group after normalization with β-actin. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC.

圖4 PTEN的蛋白和mRNA在正常組和糖尿病組大鼠腎組織中的表達(dá)

5 糖尿病大鼠腎組織中PTEN/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白水平的變化

與正常對(duì)照組相比，糖尿病組AKT蛋白的水平無(wú)明顯變化，而p-AKT(Thr308)蛋白明顯增多(P<0.01)；與正常對(duì)照組相比，糖尿病組的mTOR蛋白水平無(wú)顯著變化，而p-mTOR的蛋白水平顯著增高(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The protein levels of p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR in the renal tissues of control group and diabetic group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsNC.

圖5 正常組和糖尿病組大鼠腎組織中p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR的蛋白水平

討 論

自噬是一種溶酶體參與的、降解細(xì)胞內(nèi)老化及受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的細(xì)胞代謝過(guò)程，是應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞自我保護(hù)的適應(yīng)性表現(xiàn)。自噬具有一定的細(xì)胞保護(hù)作用，在糖尿病腎病中，腎小管受損加重，會(huì)引起慢性腎功能衰竭的形成，而且自噬水平減弱；另有研究表明，高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬的增強(qiáng)[8]，因此不同類型的自噬對(duì)細(xì)胞有著不同的病理生理意義。

mTOR信號(hào)通路是參與自噬的主要信號(hào)通路之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)與mTOR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，mTOR的失活誘導(dǎo)了自噬的激活[9]。目前在DN中，關(guān)于mTOR通路的研究甚少，且DN中自噬水平的高低與PTEN/AKT/mTOR通路之間的關(guān)系尚不明確。因此，本研究旨在觀察糖尿病大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白LC3及PTEN/AKT/mTOR通路的變化，探討DN中自噬水平降低的可能機(jī)制。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在糖尿病大鼠腎臟組織中表達(dá)下調(diào)[10]，在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，PTEN表達(dá)減少，而p-Akt蛋白水平上調(diào)[11]。但在DN中AKT與mTOR通路的關(guān)系尚不清楚。已有研究表明，抑癌基因PTEN可以負(fù)性調(diào)控PI3K/AKT通路，在此通路中，PI3K激活后使質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白AKT和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)結(jié)合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Thr308位點(diǎn)導(dǎo)致AKT活化[12]。PTEN是一個(gè)PIP3磷酸酶，與PI3K的功能相反，它可以通過(guò)去磷酸化使PIP3轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2，減少AKT的活化，進(jìn)而阻止由AKT調(diào)控的下游信號(hào)傳導(dǎo)事件的發(fā)生。AKT又稱蛋白激酶B，是PI3K下游的主要效應(yīng)物，它通過(guò)與下游多條信號(hào)通路相互作用進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等。mTOR信號(hào)通路是與AKT相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，活化的mTOR可以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等過(guò)程，起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用，該通路的失調(diào)與多種人類疾病相關(guān)，包括癌癥、糖尿病與心血管疾病[13-15]。mTORC2可磷酸化激活A(yù)KT，活化的AKT又可以激活mTORC1[16]，進(jìn)而抑制自噬的變化水平，但在DN中，AKT與mTOR之間的相互關(guān)系還不是很清楚，所以有待深入研究。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫蛋白印跡檢測(cè)糖尿病組大鼠腎組織中自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達(dá)明顯降低；免疫組織化學(xué)顯示PTEN主要分布于腎小管上皮細(xì)胞中；糖尿病大鼠腎組織中PTEN的蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著降低；p-AKT和p-mTOR在糖尿病組大鼠腎組織中的蛋白水平均明顯高于正常對(duì)照組。因此推測(cè)DN中，PTEN/AKT/mTOR通路的過(guò)度激活可能介導(dǎo)了自噬的變化水平。但在本實(shí)驗(yàn)中未做藥物干預(yù)研究，所以在后期實(shí)驗(yàn)中可以給予藥物治療，檢測(cè)給予藥物干預(yù)前后糖尿病大鼠腎臟自噬水平的變化情況，以期為改善糖尿病腎病尋找新的靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of PTEN/AKT/mTOR signalling pathway on regulation of autophagy in renal tissues of diabetic rats

WU De-pei, XIAO Ying, ZHANG Ying-ying, ZENG Ling-ping, SHI Ming-jun,WANG Yuan-yuan, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China.E-mail:yxhx20060725@126.com)

AIM: To observe the expression change of PTEN and autophagy in the renal tissues of diabetic rats, and to explore the regulatory mechanism of PTEN/AKT/mTOR pathway to autophagy in diabetic nephropathy. METHODS: The Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group and diabetic group (8 in each group). The diabetic rat model was established by injection of streptozotocin. The biochemical and kidney indexes were measured after the model of diabetic nephropathy was successfully established. The expression location of PTEN in the renal tubular epithelial cells was observed by the method of immunohistochemistry. The protein levels of autophagy-related protein LC3, PTEN and PTEN/AKT/mTOR signalling molecules were determined by Western blotting. The mRNA expression of PTEN was detected by real-time PCR. RESULTS: The blood glucose, 24 h urine protein and kidney index in diabetic group were all obviously higher than those in control group. Compared with control group, the protein levels of LC3I and LC3II in diabetic group were obviously decreased. PTEN was mainly located in the renal tubular epithelial cells. Compared with control group, the protein expression of PTEN was significantly down-regulated in diabetic group. Furthermore, the activity of PTEN/AKT/mTOR pathway increased in diabetic nephropathy rats. CONCLUSION: The level of autophagy in renal tissues of diabetic rats is decreased, whereas the activity of PTEN/AKT/mTOR pathway is increased. The level of autophagy may be mediated by PTEN/AKT/mTOR pathway.

Autophagy; Diabetic nephropathy; PTEN/AKT/mTOR signalling pathway

1000- 4718(2016)11- 2015- 05

2016- 05- 30

2016- 08- 06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360116)；貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(黔科合SY字[2013]3175號(hào))；貴陽(yáng)市科技局攻關(guān)項(xiàng)目(No. GY2015-31)

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.016

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