王 超， 張會欣， 邢邯英， 王 杏， 張 哲

(1河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051； 2河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室, 河北 石家莊 050035)

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氧化苦參堿改善高脂誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠的胰島素抵抗*

王 超1， 張會欣2△， 邢邯英1， 王 杏1， 張 哲1

(1河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室, 河北 石家莊 050035)

目的：觀察氧化苦參堿對高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠的作用并初步探討可能機(jī)制。方法:ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)16周，分為胰島素抵抗組以及氧化苦參堿25、50、100 mg/kg組，C57BL/6J小鼠設(shè)為對照組，每組10只。灌胃給藥8周后，進(jìn)行小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)；測定血清空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)和空腹胰島素(FINS)的含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定肝組織胰島素受體(INSR)、胰島素受體底物-2(IRS-2)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2(GLUT2)的mRNA表達(dá)；Western blot法測定肝組織GLUT2、INSR、IRS-2、p-INSR、p-IRS-2、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、p-PI3K、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)和p-AKT的蛋白水平。結(jié)果:氧化苦參堿能不同程度降低FBG、TG、TC、FFA和FINS水平，改善胰島素抵抗；氧化苦參堿組INSR、IRS-2和GLUT2的mRNA表達(dá)比胰島素抵抗組升高(P<0.05)，p-INSR/INSR、p-IRS-2/IRS-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和GLUT2的蛋白水平也升高(P<0.05)。結(jié)論:氧化苦參堿能通過PI3K/AKT通路，改善高脂誘導(dǎo)小鼠的胰島素抵抗。

氧化苦參堿； 高脂飲食； 胰島素抵抗； 胰島素； PI3K/AKT信號通路

研究顯示，慢性肝病患者中約有50%～80%病人存在糖耐量異常，慢性病毒性肝炎患者繼發(fā)糖尿病的發(fā)生率可達(dá)17.5%以上[1]。大量臨床研究資料表明病毒性肝炎、肝炎后肝硬化、脂肪肝等肝臟疾病與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)關(guān)系密切，胰島素抵抗可能是肝源性糖尿病發(fā)病的重要因素之一[2]。氧化苦參堿(oxymatrine，OXY)是豆科植物苦參的主要生物堿之一，具有抗病原體、抗氧化、調(diào)血脂等作用[3-4]，臨床上用于乙肝、脂肪肝的治療。任路平等[5]報(bào)道了氧化苦參堿能夠改善高果糖誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠，我們采用高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立胰島素抵抗模型，觀察氧化苦參堿對胰島素抵抗功能的作用及可能作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料和儀器

雄性ApoE-/-小鼠40只，雄性C57BL/6J小鼠10只，體質(zhì)量18～22 g，均購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心[動物許可證號SCXK(京)2011-0012]。氧化苦參堿購自正大天晴藥業(yè)股份有限公司；胰島素放免試劑盒購自上海研晶生物；抗胰島素受體(insulin receptor，INSR)和p-INSR抗體、胰島素受體底物-2(insulin receptor substrate-2，IRS-2)和p-IRS-2抗體、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2(glucose transporter 2，GLUT2)抗體、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和p-PI3K抗體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)和p-AKT抗體均購自Abcam；引物均委托上海生工生物公司合成。7080型全自動生化分析儀(HITACHI)；DFM-96 型放射免疫γ計(jì)數(shù)器(合肥眾成機(jī)電技術(shù)公司)；7300熒光定量PCR儀(ABI)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥ApoE-/-小鼠給予高脂飼料(脂肪59.8%)喂養(yǎng)，C57BL/6J小鼠給予普通飼料(脂肪10.3%)喂養(yǎng)，16周后將ApoE-/-小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)組、氧化苦參堿25、50、100 mg·kg-1·d-1干預(yù)組(25 OXY、50 OXY、100 OXY組)，每組10只小鼠。氧化苦參堿干預(yù)組每天灌胃給予8周的氧化苦參堿，胰島素抵抗組小鼠給予等體積的純凈水。C57BL/6J小鼠設(shè)為正常對照組(normal control, NC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，留取血清和肝臟，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 生化指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀測定小鼠血清空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)BG)、甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total choleste-rol，TC)和游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)的含量。放射免疫法測定空腹血清空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)含量，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)=1/(空腹血糖×胰島素)和穩(wěn)態(tài)模型評估法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model of assessment for insulin resistance index，HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

2.3 小鼠靜脈葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intravenous glucose tolerance test，IGTT) 給藥結(jié)束，小鼠禁食不禁水14～16 h，尾部采血，用微量血糖儀測定空腹血糖，記為0 min的血糖值，每只小鼠隨后口服30%的葡萄糖溶液，測定30、60、120 min血糖值。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測小鼠肝臟INSR、IRS-2和GLUT2的mRNA表達(dá) 小鼠肝臟冰浴中按比例加入TRIzol試劑，勻漿，獲得總RNA，紫外吸收法測定RNA純度和濃度，用RNA試劑盒反應(yīng)體系將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量擴(kuò)增試劑盒反應(yīng)體系依次加樣上機(jī)檢測，2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將GAPDH設(shè)為內(nèi)參照，NC組設(shè)為1，以目的基因RQ值反映INSR、IRS-2和GLUT2的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

2.5 Western blot法檢測小鼠肝臟INSR、p-INSR、IRS-2、p-IRS-2、GLUT2、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT的蛋白水平 小鼠肝臟，加入組織裂解液，冰浴中勻漿，充分裂解后離心，取上清，提取肝組織總蛋白，BCA方法測定蛋白濃度，變性后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，加入合適濃度稀釋的 I 抗孵育過夜，加入合適濃度稀釋的II抗孵育反應(yīng)，洗膜后膠片曝光顯影。以目的蛋白與內(nèi)參照積分吸光度(integrated absorbance，IA)比值反映相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

最后，希望大家可以進(jìn)一步夯實(shí)基礎(chǔ)、破解難題。當(dāng)前，西江轄區(qū)還存在不少困擾水上安全的難題和瓶頸，與社會的期待有差距，對比陸域的發(fā)展有所滯后。我們希望和共建單位一道，正視問題，真抓實(shí)干，敢啃硬骨頭，發(fā)揮新作為，著力在防治船舶污染、處置閑置船舶、“三無船舶”，提升西江航運(yùn)企業(yè)安全管理水平等問題上取得更大的成效

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析結(jié)合SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氧化苦參堿對胰島素抵抗小鼠生化指標(biāo)的影響

與NC組比較，IR組小鼠的體重、血清FBG、TC、TG和FFA含量均明顯升高(P<0.05)。氧化苦參堿干預(yù)后，與IR組相比，25 OXY組的TC、TG和FFA含量降低(P<0.05)，50 OXY組血清的FBG、TC和TG、FFA含量降低(P<0.05)，100 OXY組的體重及血清FBG、TC、TG和FFA水平均降低(P<0.05)，見表2。

表2 氧化苦參堿對小鼠體重及血清生化指標(biāo)的影響

2 氧化苦參堿對胰島素抵抗小鼠胰島素敏感性的影響

與NC組比較，IR組小鼠的FINS水平和HOMA-IR值升高，ISI值降低(P<0.05)。氧化苦參堿干預(yù)后，與IR組相比，25 OXY組和50 OXY組FINS水平和HOMA-IR值降低(P<0.05)，100 OXY組的FINS水平和HOMA-IR值降低，ISI值升高(P<0.05)，見表3。

表3 氧化苦參堿對胰島素抵抗小鼠胰島素敏感性的影響

Table 3.The effect of OXY on insulin sensitivity in IR mice (Mean±SD.n=10)

*P<0.05 vs NC group； #P<0.05 vs IR group.

3 氧化苦參堿對胰島素抵抗小鼠IGTT的影響

4 氧化苦參堿對胰島素抵抗小鼠肝組織INSR、IRS-2和GLUT2的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與NC組比較，IR組小鼠肝臟INSR、IRS-2和GLUT2的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與IR組相比，50 OXY組和100 OXY組INSR、IRS-2和GLUT2的mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The effect of OXY on IGTT in IR mice. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsIR group.

圖1 氧化苦參堿對胰島素抵抗小鼠IGTT的影響

Figure 2.The mRNA expression of INSR, IRS-2 and GLUT2 in the liver tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsIR group.

圖2 小鼠肝組織INSR、IRS-2和GLUT4的mRNA表達(dá)變化

與NC組比較，IR組小鼠肝臟p-INSR、p-IRS-2和GLUT2 的蛋白水平降低(P<0.05)；與IR組相比，25 OXY組p-IRS-2的蛋白水平升高(P<0.05)，50 OXY組和100 OXY組p-INSR、p-IRS-2和GLUT2的蛋白水平均升高(P<0.05)，各組INSR和IRS-2蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

Figure 3.The protein levels of INSR, IRS-2 and GLUT2 in the liver tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsIR group.

圖3 小鼠肝組織INSR、IRS-2和GLUT2的蛋白水平的變化

5 氧化苦參堿對胰島素抵抗小鼠肝組織PI3K/AKT通路的影響

與NC組比較，IR組小鼠肝臟p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值降低(P<0.05)；與IR組相比，50 OXY組和100 OXY組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值均升高(P<0.05)，見圖4。

討 論

本研究表明高脂誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠血糖、血脂和胰島素水平升高，HOMA-IR值降低，ISI值升高，說明高脂誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠出現(xiàn)血脂紊亂和胰島素抵抗。糖耐量實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了高脂誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠是理想的胰島素抵抗動物模型[6-7]。氧化苦參堿能夠降低胰島素抵抗小鼠血糖、血脂、胰島素及升高胰島素指數(shù)，上調(diào)肝組織胰島素受體及底物表達(dá)，提示了氧化苦參堿可通過提高小鼠肝組織胰島素活性及受體功能，改善ApoE-/-小鼠的胰島素抵抗。

Figure 4.The levels of p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT in the liver tissue. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsIR group.

圖4 小鼠肝組織PI3K/AKT通路的變化

胰島素抵抗是機(jī)體對胰島素的反應(yīng)減退，主要是肝臟、骨骼肌、脂肪的糖代謝缺陷。研究表明，胰島素抵抗分子水平機(jī)制包括受體前缺陷、受體缺陷和受體后缺陷[8]。其中，受體缺陷指的是胰島素受體數(shù)目及親和力降低；受體后缺陷指胰島素與受體結(jié)合后信號傳導(dǎo)到細(xì)胞過程受到阻礙，也是多數(shù)胰島素抵抗的分子發(fā)生機(jī)制。IRS是胰島素受體底物，主要包括IRS-1和IRS-2，在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，IRS-2的作用更為重要[9]，因此我們觀察了IRS-2在胰島素抵抗小鼠肝臟的變化。結(jié)果表明，胰島素抵抗小鼠胰島素受體和其底物及磷酸化水平降低，顯示了肝臟胰島素受體缺陷，胰島素信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻。氧化苦參堿能同時(shí)提高p-INSR/INSR和p-IRS-2/IRS-2比值，使大鼠胰島素敏感性得以恢復(fù)。

肝細(xì)胞胰島素信號傳導(dǎo)途徑包括PI3K、MAPK等多種途徑，PI3K通路是肝臟胰島素信號傳導(dǎo)中的主要通路[10]，PI3K與IRS相結(jié)合而被激活。我們觀察到高脂誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠肝臟p-PI3K的蛋白水平降低，同時(shí)位于PI3K下游AKT磷酸化水平也下調(diào)，氧化苦參堿干預(yù)后，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值上調(diào)，提示了氧化苦參堿改善胰島素抵抗與激活PI3K/AKT磷酸化、提高胰島素及受體功能、提高肝組織胰島素敏感性有關(guān)。但PI3K是否是唯一途徑，是否有其他作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

PI3K/AKT磷酸化激活后可引發(fā)一系列糖原合成、蛋白合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等生理效應(yīng)，因此我們進(jìn)一步觀察了GLUT2的表達(dá)變化。GLUT2屬于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在肝細(xì)胞中，GLUT2占全部葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的97%以上，胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，肝臟GLUT2功能受損，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少，引起糖代謝紊亂[11]。我們結(jié)果顯示氧化苦參堿能提高高脂誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠肝臟GLUT2表達(dá)，推測氧化苦參堿是通過INSR -IRS2-PI3K-AKT-GLUT2等一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程完成其改善胰島素抵抗的作用。

我們還觀察到氧化苦參堿能夠降低胰島素抵抗小鼠的體重。研究認(rèn)為肥胖是高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的重要危險(xiǎn)因素，是代謝綜合征的病理特征之一[12]，因此我們推測氧化苦參堿能夠通過降低脂肪細(xì)胞的分化和增殖、增加脂肪動員，減少脂肪形成等來抑制脂肪沉積和抑制體重增加。但是氧化苦參堿是否通過對脂肪細(xì)胞的作用改善胰島素抵抗及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Oxymatrine ameliorates high fat-induced insulin resistance in ApoE-/-mice

WANG Chao1, ZHANG Hui-xin2, XING Han-ying1, WANG Xing1, ZHANG Zhe1

(1KeyLaboratoryofGeriatricsofHebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China;2PharmacologyDepartmentofHebeiYilingMedicineInstitute,Shijiazhuang050035,China.E-mail:hxzhang76@sohu.com)

AIM: To investigate the effect of oxymatrine (OXY) on high fat-induced insulin resistance in mice, and to investigate the mechanism. METHODS:ApoE-/-mice with high-fat diet for 16 weeks were divided into insulin resistance group, and OXY groups at concentrations of 25, 50 and 100 mg/kg. C57BL/6J mice served as normal control group. The mice in OXY groups were gavaged with OXY for 8 weeks. Glucose tolerance test in the mice was performed. Fasting blood glucose (FBG), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), fatty acid (FFA) and fasting insulin (FINS) in the plasma were measured. The mRNA expression of insulin receptor (INSR), insulin receptor substrate-2 (IRS-2), glucose transporter 2 (GLUT2) in the liver tissues was examined by RT-qPCR. The protein levels of GLUT2, INSR, IRS-2, p-INSR, p-IRS-2, PI3K， p-PI3K, serine/threonine protein kinase (AKT) and p-AKT were examined by Western blot.RESULTS: OXY reduced the levels of FBG, TC, TG, FFA and FINS， and attenuated insulin resistance. Compared with insulin resistance group, the mRNA expression of INSR, IRS-2 and GLUT2 significantly increased in OXY groups (P<0.05). The protein levels of p-INSR/INSR, p-IRS-2/IRS-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT and GLUT2 also increased in OXY groups (P<0.05). CONCLUSION: OXY ameliorates high fat-induced insulin resistance in mice via PI3K/AKT pathway.

Oxymatrine; High-fat diet; Insulin resistance; Insulin; PI3K/AKT signaling pathway

1000- 4718(2016)11- 2010- 05

2016- 05- 30

2016- 09- 06

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(No. 2012CB518606)；河北省重大醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(No. zd2013002; No. zd2013004)

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.015

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