秘魯魷魚肝臟油脂淡堿水解法提取及其脂肪酸分析

徐彤硯 樓喬明 高 娟 楊文鴿 徐大倫 張進(jìn)杰

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

秘魯魷魚肝臟油脂淡堿水解法提取及其脂肪酸分析

徐彤硯 樓喬明 高 娟 楊文鴿 徐大倫 張進(jìn)杰

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

對(duì)秘魯魷魚肝臟的基本營(yíng)養(yǎng)成分和脂質(zhì)組成進(jìn)行分析，同時(shí)采用淡堿水解法對(duì)其油脂提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)油脂的脂肪酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明：秘魯魷魚肝臟富含油脂，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)干重的46.61%，且以三酰甘油(61.26%)和磷脂(26.45%)為主；淡堿水解法提取油脂的最佳條件為料液比1∶1.5、初始pH 9.0、水解溫度70 ℃、水解時(shí)間80 min、加鹽量4%，在此優(yōu)化條件下，油脂提取率為82.87%；秘魯魷魚肝臟油脂富含C20∶5n-3和C22∶6n-3，兩者總質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)31%以上，表明秘魯魷魚肝臟具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可開發(fā)成食品添加劑、保健品和藥品以作為C20∶5n-3和C22∶6n-3功能性脂肪酸的重要食藥來源。

秘魯魷魚 肝臟 油脂 淡堿水解法 提取 脂肪酸

魷魚是軟體動(dòng)物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、槍形目(Teuthoidea)、柔魚科(Ommastrephidae)和槍烏賊科(Loliginidae)動(dòng)物的俗稱，亦稱柔魚，是我國重要的遠(yuǎn)洋漁獲資源和水產(chǎn)加工品種[1]。魷魚資源豐富，且生長(zhǎng)周期短、繁殖力強(qiáng)和資源恢復(fù)迅速，是一種可持續(xù)的海洋漁業(yè)資源。目前，國內(nèi)市場(chǎng)上的魷魚主要為阿根廷滑柔魚(Illex argentinus)、北太平洋褶柔魚(Todarodes pacificus)和秘魯魷魚(Dosidicus gigas)3個(gè)品種；隨著捕撈技術(shù)和遠(yuǎn)洋漁業(yè)的發(fā)展，秘魯魷魚的產(chǎn)量顯著提高，2011年其產(chǎn)量超過25萬t，已成為我國魷魚重要加工品種[2-3]。

目前，我國魷魚加工產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)品層次較低，以魷魚干、魷魚片、魷魚絲、面包魷魚段和冷凍魚糜等制品為主，而加工過程產(chǎn)生的魷魚肝臟等下腳料一般直接廢棄掩埋或加工成低值飼料，這不僅浪費(fèi)資源，還易造成環(huán)境污染，因此有效利用和開發(fā)魷魚肝臟，生產(chǎn)高附加值具有保健功能的魷魚肝臟油脂，將為魷魚加工下腳料綜合利用提供新途徑[4-5]。本研究以秘魯魷魚肝臟為研究對(duì)象，對(duì)其基本營(yíng)養(yǎng)成分、脂質(zhì)和脂肪酸組成進(jìn)行分析，并采用淡堿水解法對(duì)油脂提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為拓展魷魚肝臟利用途徑，提高魷魚綜合利用率和附加值提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮秘魯魷魚：寧波豐群食品有限公司；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)：美國Sigma公司；三酰甘油試劑盒和膽固醇試劑盒：南京建成生物工程研究所；甲醇、正己烷、氫氧化鉀等分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-4820紫外分光光度計(jì)：北京恒峰瑞創(chuàng)科技發(fā)展有限公司；IR35電子水分測(cè)定儀：丹佛儀器(北京)有限公司；7890A型氣相色譜儀：美國Agilent公司；M7-80EI型質(zhì)譜儀：北京普析通用儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；EX-124型精密電子分析天平：奧豪斯儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

新鮮秘魯魷魚經(jīng)解剖，取其肝臟，去除粘膜組織，經(jīng)勻漿后，密封包裝，貯藏于-40 ℃冰箱中備用。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)成分分析

含水量：參照GB 5009.3—2010 直接干燥法測(cè)定；蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2010凱氏定氮法測(cè)定；總脂含量：參照Folch法進(jìn)行提取測(cè)定[6-7]；灰分含量：參照GB 5009.4—2010測(cè)定。

1.2.3 脂質(zhì)組成分析

三酰甘油和總膽固醇含量：按試劑盒的使用說明測(cè)定；磷脂含量：總脂經(jīng)濕法消化后，鉬藍(lán)比色法測(cè)定[8]；游離脂肪酸含量：參考銅皂比色法測(cè)定[9]。

1.2.4 單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)

取50 g新鮮魷魚肝臟勻漿，按一定料液比加入水和抗氧化劑(0.02%TBHQ)，在45 ℃保溫條件下，用2 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)初始pH，保溫20 min；再經(jīng)水浴保溫水解，氯化鈉鹽析10 min后，5 000 r/min離心15 min，收集上清液即為魷魚肝臟油脂。同時(shí)以料液比、初始pH、水解溫度、水解時(shí)間、加鹽量為因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)；并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用極差法對(duì)初始pH、水解溫度、水解時(shí)間和加鹽量進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.5 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg魷魚肝臟油脂，加入1 mL正己烷充分溶解，再加入1 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，旋渦混合1 min，靜置分層后，上清液用無水Na2SO4干燥，供GC-MS分析。

色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，高純氦氣為載氣，采用恒壓模式，壓力0.4 MPa；進(jìn)樣量1 μL，分流比30∶1，進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃；升溫程序?yàn)?00 ℃保持4 min，以10 ℃/min升溫至200 ℃，保持6 min，并以4 ℃/min升溫至250 ℃，整個(gè)分析過程40 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度280 ℃，EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，全掃描模式檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析法(ANOVE，Tukey檢驗(yàn))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并采用Duncan’s法進(jìn)行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 魷魚肝臟基本成分

魷魚肝臟基本成分列于表1。由表1可知，魷魚肝臟水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.21%，蛋白質(zhì)為14.26%(占干重的42.20%)，灰分為2.24%(占干重的6.63%)；而總脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)15.75%(占干重的46.61%)，遠(yuǎn)高于魷魚胴體、魷魚皮中的總脂含量[10-11]，表明魷魚肝臟富含油脂，可作為提取油脂的良好原料。

表1 魷魚肝臟基本成分

2.2 魷魚肝臟總脂組成

魷魚肝臟總脂組成較為復(fù)雜，本研究?jī)H對(duì)總脂中的三酰甘油、磷脂、游離脂肪酸和總膽固醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表2。從表2可知，魷魚肝臟總脂以三酰甘油和磷脂為主，分別占總脂的61.26%和26.45%，兩者總量占總脂的80%以上，是魷魚肝臟總脂的主要組成成分。魷魚肝臟油脂中游離脂肪酸和總膽固醇含量相對(duì)較低，分別僅占總脂的1.82%和1.13%，其中總膽固醇含量經(jīng)換算占魷魚肝臟干重為5.27 mg/g，遠(yuǎn)低于雞蛋[12]、鱸魚卵[13]、大黃魚魚卵[14]等。魷魚肝臟富含油脂，且磷脂含量較高，總膽固醇含量相對(duì)較低，表明其具有較高的脂質(zhì)開發(fā)潛力。

表2 魷魚肝臟總脂脂質(zhì)組成

2.3 魷魚肝臟油脂提取單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)提取率的影響

在料液比(1∶1、1∶1.3、1∶1.5、1∶2)、初始pH 9.0、水解溫度70 ℃、水解時(shí)間80 min和加鹽量4%的條件下，不同料液比對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖1所示。

由圖1可知，隨料液比增加，魷魚肝臟油脂提取率呈先增加后降低趨勢(shì)，在料液比為1∶1.5時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大值(82.87%)。這是由于隨著料液比的增加，油脂提取體系的黏度降低，流動(dòng)性增加，增加了體系的傳質(zhì)速率，使KOH能與脂蛋白、脂質(zhì)復(fù)合物等物質(zhì)進(jìn)行充分接觸，促進(jìn)水解反應(yīng)進(jìn)行，釋放油脂，從而提高油脂提取率。當(dāng)料液比過高，致使油脂提取體系中KOH總量增加，易于發(fā)生皂化反應(yīng)；且料液比過高，易使油脂發(fā)生乳化現(xiàn)象，增加后續(xù)油脂分離難度和強(qiáng)度。因此，魷魚肝臟油脂提取最佳料液比為1∶1.5。

圖1 料液比對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響

2.3.2 初始pH對(duì)提取率的影響

在料液比1∶1.5、初始pH(8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、水解溫度70 ℃、水解時(shí)間80 min和加鹽量4%的條件下，不同初始pH對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨初始pH升高，魷魚肝臟油脂提取率呈逐漸增加趨勢(shì)；這是因?yàn)樵谌鯄A性條件下，pH升高能有效提高脂蛋白的水合能力，增加溶解度，促進(jìn)水解反應(yīng)進(jìn)行，同時(shí)pH升高可有效降低水解體系的乳化穩(wěn)定性，釋放油脂，進(jìn)而提高油脂提取率。當(dāng)初始pH為9.0時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大(82.26%)；繼續(xù)提高初始pH至10.0時(shí)，加劇了魷魚肝臟油脂的皂化反應(yīng)進(jìn)行，油脂皂化產(chǎn)物析出，致使油脂提取率急劇下降。因此，魷魚肝臟油脂提取最佳初始pH為9.0。

圖2 初始pH對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響

2.3.3 水解溫度對(duì)提取率的影響

在料液比1∶1.5、初始pH 9.0、水解溫度(50、60、70、80、90 ℃)、水解時(shí)間80 min和加鹽量4%的條件下，不同水解溫度對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖3所示。

圖3 水解溫度對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響

由圖3可知，在50～80 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，油脂的提取率逐漸增大；溫度升高加速破壞蛋白質(zhì)與油脂間的結(jié)合，釋放油脂，進(jìn)而提高油脂提取率。當(dāng)溫度為70 ℃和80 ℃時(shí)，油脂提取率都較高，分別為81.85%和81.92%，且兩者溫度對(duì)油脂提取率無顯著影響(P>0.05)；當(dāng)溫度為90 ℃時(shí)，過高的溫度加速油脂皂化和氧化分解等副反應(yīng)進(jìn)行，致使油脂提取率下降[15]。綜合考慮油脂提取率和氧化程度，魷魚肝臟油脂提取最佳水解溫度為70 ℃。

2.3.4 水解時(shí)間對(duì)提取率的影響

在料液比1∶1.5、初始pH 9.0、水解溫度70 ℃、水解時(shí)間(60、70、80、90、100 min)和加鹽量4%的條件下，不同水解時(shí)間對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，魷魚肝臟油脂提取率逐漸增加；當(dāng)水解時(shí)間為80 min時(shí)，油脂提取率達(dá)到最大值(82.27%)；之后，隨著水解時(shí)間增加，油脂提取率緩慢降低。水解時(shí)間短，油脂提取過程中水解不充分，致使油脂提取率低；水解時(shí)間過長(zhǎng)，易造成油脂皂化、氧化分解等副反應(yīng)發(fā)生，皂化物析出和氧化分解損失，導(dǎo)致油脂提取率降低；故魷魚肝臟油脂提取最佳水解時(shí)間為80 min。

圖4 水解時(shí)間對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響

2.3.5 加鹽量對(duì)提取率的影響

在料液比1∶1.5、初始pH 9.0、水解溫度70 ℃、水解時(shí)間80 min和加鹽量(2%、3%、4%、5%、6%)的條件下，不同加鹽量對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響如圖5所示。

由圖5可知，魷魚肝臟油脂提取率隨加鹽量呈先增加后小幅降低，當(dāng)加鹽量為4%時(shí)，油脂提取率最大(81.42%)。當(dāng)加鹽量≤4%時(shí)，油脂提取率隨加鹽量增加而增加；這是因?yàn)轸滛~肝臟富含蛋白質(zhì)，易于吸水而呈膠體狀態(tài)，當(dāng)加入適量電解質(zhì)，電解質(zhì)的陰、陽離子電荷能中和膠體分散相質(zhì)點(diǎn)的表面電荷，降低(或消除)膠體表面電位和水合度，使膠體微粒絮凝聚集，同時(shí)破壞蛋白質(zhì)與油脂間的乳化作用，促使油脂析出，降低膠體絮凝團(tuán)的油脂含量，進(jìn)而提高油脂提取率；同時(shí)加鹽量的增加，增大了油脂提取體系整體密度，有利于油脂破乳，對(duì)提高油脂提取率具有一定的輔助作用[15-16]。當(dāng)加鹽量>5%時(shí)，油脂提取率呈小幅降低，這是因?yàn)轸滛~肝臟富含磷脂(占魷魚肝臟干重的12%以上)，加鹽量的增加，降低了磷脂膠體水合度，促使磷脂膠體絮凝，并從油脂中析出，從而在一定程度上降低了油脂的提取率[17]。因此，魷魚肝臟油脂提取的最佳加鹽量為4%。

圖5 加鹽量對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響

2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選取初始pH、水解溫度、水解時(shí)間、加鹽量為試驗(yàn)因素，以提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法考察各因素對(duì)魷魚肝臟油脂提取率的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果列于表3，方差分析列于表4。

表3 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可知，淡堿水解法提取魷魚肝臟油脂過程中，各因素對(duì)油脂提取率影響依次為：初始pH>水解溫度>水解時(shí)間>加鹽量，即初始pH對(duì)油脂提取率的影響最大，水解溫度和水解時(shí)間次之，加鹽量最小。表4方差分析表明：初始pH和水解溫度對(duì)油脂提取率具有顯著影響(P<0.05)，而水解時(shí)間和加鹽量對(duì)提取率影響不顯著；優(yōu)化試驗(yàn)條件為初始pH 9.0、水解溫度70 ℃、水解時(shí)間80 min、加鹽量4%，在此優(yōu)化條件下，油脂提取率達(dá)到(82.87±0.43)%，略低于超聲波輔助有機(jī)溶劑法(91.26%)[18]和水酶法(90.67%)[19]；但淡堿水解法具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備試劑依存度低、生產(chǎn)量大、成本低等優(yōu)勢(shì)，因此淡堿水解法在魷魚肝臟油脂工業(yè)化提取上具有廣闊的應(yīng)用前景。

表4 正交優(yōu)化試驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2, 2)=19.000，F(xiàn)0.01(2, 2)=99.000；*表示P<0.05，差異顯著。

2.5 脂肪酸組成分析

將Folch法和優(yōu)化后淡堿水解法提取的魷魚肝臟油脂經(jīng)甲酯化處理，采用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)油脂脂肪酸組成進(jìn)行分析，其總離子流色譜圖見圖6；通過標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照和數(shù)據(jù)庫檢索對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行定性分析，并按峰面積歸一法進(jìn)行定量，分析結(jié)果列于表5。

圖6 魷魚肝臟總脂脂肪酸GC-MS總離子流色譜圖

魷魚肝臟油脂脂肪酸組成豐富，主要為C14～C22脂肪酸，其中從Folch法提取的魷魚肝臟總脂中共分析鑒定出20種脂肪酸，優(yōu)化淡堿水解法提取的油脂中共分析鑒定出18種脂肪酸，2種油脂脂肪酸組成沒有明顯差別，均以C16∶0、C18∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-9、C20∶5n-3(EPA)、C22∶6n-3(DHA)為主；魷魚肝臟油脂中多不飽和脂肪酸主要為C20∶5n-3和C22∶6n-3等n-3型多不飽和脂肪酸，n-6型多不飽和脂肪酸含量較低；C22∶6n-3含量遠(yuǎn)高于C20∶5n-3，且C20∶5n-3和C22∶6n-3兩者總質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)31.16%，高于南美白對(duì)蝦(11.84%～23.36%)[20]、蝦蛄(25.2%～30.2%)[21]、三疣梭子蟹(18.94%～20.91%)[22]、大黃魚(16.0%～25.8%)[23]等常見海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種以及黑印真鯊(27.5%～29.5%)、沙拉真鯊(24.6%～25.2%)、白邊真鯊(29.9%)、瓦氏斜齒鯊(27.2%)和中國團(tuán)扇鰩(27.1%)等鯊鰩肝臟[24]。C20∶5n-3和C22∶6n-3具有降血脂、抗血栓、預(yù)防動(dòng)脈硬化等預(yù)防心血管疾病以及抗炎、提高免疫力、促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育、增強(qiáng)記憶力等多種生理調(diào)節(jié)功能，是人和動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的脂肪酸[25-27]。魷魚肝臟油脂含量高，且油脂富含C20∶5n-3和C22∶6n-3，表明魷魚肝臟具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可開發(fā)成食品添加劑、保健品和藥品以作為C20∶5n-3和C22∶6n-3功能性脂肪酸的重要食藥來源。

表5 魷魚肝臟油脂脂肪酸組成

3 結(jié)論

3.1 魷魚肝臟富含蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，兩者分別占干重的42.20%和46.61%；其中總脂以三酰甘油(61.26%)和磷脂(26.45%)為主，游離脂肪酸和總膽固醇含量相對(duì)較低。

3.2 經(jīng)單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)得到淡堿水解法提取魷魚肝臟油脂的最佳工藝條件：料液比1∶1.5、初始pH9.0、水解溫度70 ℃、水解時(shí)間80 min、加鹽量4%、鹽析10 min，并5 000 r/min離心15 min；在此優(yōu)化條件下，魷魚肝臟油脂提取率為82.87%。

3.3 Folch法和優(yōu)化后淡堿水解法所提魷魚肝臟油脂在脂肪酸組成上沒有明顯差別；魷魚肝臟油脂富含C20∶5n-3和C22∶6n-3，兩者總質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)31%以上，表明魷魚肝臟具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可開發(fā)成食品添加劑、保健品和藥品以作為C20∶5n-3和C22∶6n-3功能性脂肪酸的重要食藥來源。

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Hepatic Oil Extraction of Dosidicus gigas by Weak Alkaline Hydrolysis and Analysis of the Fatty Acid Compositions

Xu Tongyan Lou Qiaoming Gao Juan Yang Wenge Xu Dalun Zhang Jinjie

(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211)

Abstract The basic nutrient components and lipid compositions ofDosidicusgigaslivers were analyzed, and meanwhile the weak alkaline hydrolysis to optimize the oil extraction process was applied and the fatty acid compositions were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) in this paper. The results indicate thatDosidicusgigaslivers are rich in oil, and the oil mass fraction is as high as 46.61% of dry weight, which is mainly composed of triglycerides (61.26%) and phospholipids (26.45%). The best extraction conditions of weak alkaline hydrolysis were as follows: 1∶1.5 of material-liquid ratio, initial pH 9.0, 70 ℃ for hydrolysis temperature, 80 min for hydrolysis time and 4% sodiumchloride, and the oil extraction yield was up to 82.87% under the optimal condition. The liver oil ofDosidicusgigaswas a rich source of C20∶5n-3 and C22∶6n-3, and the total mass fraction of C20∶5n-3 and C22∶6n-3 reached as high as above 31%.Dosidicusgigaslivers had high nutritional value and considerable potential for lipid exploitation, showed that the oil could be developed into food additives, health care products and drugs as important sources of C20∶5n-3 and C22∶6n-3 functional fatty acids.

dosidicusgigas, liver, oil, weak alkaline hydrolysis, extraction, fatty acids

TS251.9

A

1003-0174(2016)02-0058-06

國家自然科學(xué)基金(31201283)，浙江省教育廳科研資助項(xiàng)目(Y201223991)，寧波市自然科學(xué)基金(2012 A610136)

2014-07-02

徐彤硯，女，1993年出生，碩士，食品科學(xué)

樓喬明，男，1981年出生，博士，講師，食品科學(xué)