徐烈雨，徐云澤，廉建坡，林登強，沈周俊，祝 宇

(上海交通大學醫(yī)學院：1.附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，2.附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科，上海 200025)

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·臨床研究·

EGFR、IGF1R、Ki67及Weiss評分對腎上腺皮質(zhì)腫瘤診斷和預后預測的價值

徐烈雨1，徐云澤2，廉建坡1，林登強1，沈周俊1，祝 宇1

(上海交通大學醫(yī)學院：1.附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，2.附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科，上海 200025)

目的 探討表皮生長因子受體(EGFR)及胰島素樣生長因子受體(IGF1R)在腎上腺皮質(zhì)腫瘤中的表達，分析EGFR、IGF1R、細胞增殖抗原標記物(Ki67)及Weiss評分與腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)總體預后的關(guān)系。方法 選取ACT標本37例(其中良性腺瘤17例，惡性皮質(zhì)癌20例)，采用免疫組化及蛋白免疫印跡法檢測其中EGFR和IGF1R的表達，并通過生存曲線分析各項指標與惡性組預后的關(guān)系。結(jié)果 EGFR在惡性組中表達陽性率明顯高于良性組(15/20vs.3/17；P<0.01)，惡性組中IGF1R的表達亦高于良性組(14/20vs.4/17；P<0.01)，兩者在惡性組中的蛋白水平高于良性組；預后分析發(fā)現(xiàn)Ki67>10%的皮質(zhì)癌患者預后明顯差于<10%的患者(P<0.01)，而>6分的ACC生存期明顯短于Weiss<6分的患者(P<0.01)。結(jié)論 EGFR和IGF1R表達有助于鑒別腎上腺腫瘤良惡性，而Ki67指數(shù)及Weiss評分可以作為ACC預后預測指標。

腎上腺皮質(zhì)癌；EGFR；IGF1R；Ki67；Weiss評分

目前腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma，ACC)發(fā)病機制尚未完全闡明，早期診斷困難[1]；目前主要依靠Weiss評分，其通過細胞形態(tài)學、腫瘤結(jié)構(gòu)及侵襲特征來分析鑒別，但敏感度和特異度并不十分理想[2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)參與細胞增殖、代謝等過程[3]；另外胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)亦參與腫瘤的增殖進展等[4]。本研究通過檢測EGFR和IGF1R在ACT中的表達情況，從而為良惡性鑒別診斷提供依據(jù)。最新研究證明，EGFR和IGF1R的過表達與其他腫瘤增殖和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，但兩者在腎上腺皮質(zhì)腫瘤(adrenocortical tumor, ACT)中的表達情況國內(nèi)尚無相關(guān)研究。ACC預后較差，進展期五年生存率<15%[5]；關(guān)于ACC的預后預測指標研究甚少，既往報道稱EGFR及IGF1R的表達與其他腫瘤的長期預后有關(guān)[6]。因此本研究進一步分析EGFR、IGF1R表達陽性與ACC總體預后之間的關(guān)系。另外本研究亦同時探討Ki67及Weiss評分與ACC預后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集1996年8月至2013年8月上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科手術(shù)治療的37例ACT患者標本的臨床病理資料。術(shù)前根據(jù)癥狀、體征、內(nèi)分泌檢查以及B超、CT、MRI等影像學檢查初步診斷，術(shù)后病理診斷根據(jù)改良的Weiss評分法，≥ 3分診斷為ACC，<3分診斷為腎上腺皮質(zhì)腺瘤(adrenocortical adenoma,ACA)。良性腫瘤組(ACA)17例，惡性腫瘤組(ACC)20例。所有術(shù)后標本均經(jīng)4%(體積分數(shù))中性甲醛液固定、脫水后石蠟包埋。

良性組17例患者中，男性8例，女性9例；平均年齡(44.7±16.3)歲，分別包括庫欣綜合征6例、原發(fā)性醛固酮增多癥5例、無功能性腎上腺皮質(zhì)腺瘤6例；惡性組20例患者中，男8例，女12例，平均年齡(57.5±17.2)歲。根據(jù)2004年ACC的TNM分期標準，惡性組(ACC)20例中包括Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期6例。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會批準備案。在患者診斷后開始隨訪，直至患者死亡或者到2013年8月研究終止；所有的患者均獲得完整隨訪資料，其中惡性組患者平均隨訪時間為(6.26±5.11)年，良性組為(10.12±3.46)年，詳見表1。

最終所有20例惡性組患者中，18例死亡；而良性組中僅1例死亡。18例隨訪期間死亡的惡性組患者平均生存期為(4.2±3.3)年，余2例患者隨訪結(jié)束后仍存活，2例患者分別隨訪9.5和7.8年，且EGFR表達均為陽性，而IGF1R表達則為1例陽性，1例陰性；同時該2例患者的Ki67指數(shù)<10分，Weiss<6分。1.2 主要試劑及實驗方法 免疫組化實驗：一抗為鼠抗人多克隆EGFR抗體(Abcam，USA，1︰100稀釋)，兔抗人多克隆IGF1R抗體(Abcam，USA，1∶150)以及兔抗人Ki67多克隆抗體(Immuno Technology，F(xiàn)rance，1∶50稀釋)；二抗為DAKO公司EnVisionTM抗兔及EnVisionTM抗鼠IgG試劑盒。

采用免疫組化半定量方法；標本經(jīng)4%(體積分數(shù))中性甲醛固定脫水及石蠟包埋后，4 μm厚連續(xù)切片；再經(jīng)二甲苯脫蠟15 min；之后用3%H2O2孵育以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，微波抗原修復，滴加10%正常山羊血清，室溫封閉。分別滴加上述三種一抗，濕盒中4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，之后分別滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min。PBS洗滌3次后再二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，封片。

表1 ACC和ACA組患者一般資料

項目惡性組(ACC)良性組(ACA)P值例數(shù)2017性別(男/女)8/128/90．746診斷年齡(歲)57．5±17．244．7±16．30．048腫瘤大小(cm)8．62±3．44．26±2．1<0．01ENSAT分期[例(%)]- Ⅰ5(25．00) Ⅱ9(45．00) Ⅲ6(30．00) ⅣWeiss評分[例(%)]5．45±1．881．29±0．46<0．001 3～615(75．00) >65(25．00)Ki67評分[例(%)]8．85±5．562．95±1．69<0．001 <10%13(65．00) >10%7(35．00)隨訪(年)6．26±5．1110．12±3．460．034

蛋白免疫印跡實驗：提取腎上腺皮質(zhì)腫瘤和正常腎上腺組織蛋白，分別加入RIPA、Cocktail及PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min后離心；之后采用BCA法蛋白質(zhì)定量計算樣品蛋白的濃度。取蛋白加樣于10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h后以3%BSA封閉1 h，與相應(yīng)一抗4 ℃過夜(稀釋1∶1 000)。TBST洗滌3次后與含相應(yīng)種屬的二抗作用1h(稀釋1∶10 000)，機器顯影。

1.3 免疫組織化學檢測結(jié)果判定標準 EGFR和IGF-1R染色均以腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)或胞膜出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為陽性，否則為陰性，由2位病理科醫(yī)師獨立完成。高倍鏡下(×400)對每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計1 000個。陽性染色細胞為細胞結(jié)構(gòu)清晰、陽性顆粒定位好、著色與背景對比清晰。判斷陽性或陰性的根據(jù)為細胞染色強度和染色細胞所占比例兩種指標的積分之和。其中染色強度積分為：不染色=0，輕度染色=1，中度染色=2，強染色=3；陽性細胞比例積分為：無細胞染色=0，<30%細胞染色=1，30～60%細胞染色=2，>60%細胞染色=3.若兩種積分之和>3分則表達為陽性，≤3分則為陰性[7]。

Ki67指數(shù)及Weiss評分的判定：通過選擇高倍鏡視野下，每100個腎上腺細胞中Ki67陽性的細胞數(shù)量及比率計作為Ki67指數(shù)(%)。Weiss評分主要通過9種不同的組織學特征：細胞核分裂指數(shù)≥5/50高倍鏡視野，核異型性增生，不典型核分裂，低百分比透明細胞，腫瘤壞死，竇狀樣結(jié)構(gòu)浸潤，彌漫分布，包膜外侵犯以及血管侵襲，上述任一組織學特征出現(xiàn)即賦值1分，然后將分數(shù)加權(quán)。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR及IGF1R 在ACC中呈明顯高表達 EGFR在惡性組中陽性表達率為75.00%(15/20)，但其在良性組中陽性表達率僅為17.64%(3/17，P<0.01)； 同時IGF1R在惡性組中呈高表達(70.00%，14/20)，在良性組中表達較低(23.52%，4/17)，兩組之間表達存在顯著性差異(P<0.001,圖1,表2)。同時發(fā)現(xiàn)惡性組中EGFR及IGF1R同時表達增高的陽性率為60.00%(12/20)，而在良性組中EGFR及IGF1R同時表達增高的陽性率僅為11.76%(P<0.01)。通過Spearman等級相關(guān)分析證實惡性組患者中EGFR與IGF1R的表達呈正相關(guān)(r_s=0.814，P<0.01)。另外通過Western blot檢測惡性組、良性組及正常對照組蛋白表達水平(圖2)，結(jié)果顯示EGFR和IGF1R在惡性組中的蛋白表達水平同樣高于良性組，而正常腎上腺皮質(zhì)組織中EGFR和IGF1R表達水平最低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 ACC和ACA患者EGFR及IGF1R免疫組化結(jié)果(×400)

A：惡性組中EGFR陽性；B：良性組中EGFR陰性；C：惡性組中IGF1R陽性；D：良性組中IGF1R陰性。

2.2 EGFR、IGF1R、Ki67及Weiss評分與ACC患者總體生存期的關(guān)系Kaplan-Meier預后分析曲線表明(圖3)，EGFR表達陽性組ACC患者生存期與陰性組無顯著差別(P=0.115)；ACC患者中IGF1R表達陽性組與陰性組總體預后無明顯差別(P=0.197)。而分析Ki67及Weiss評分與總體預后相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ki67指數(shù)以10分為臨界值，Ki67>10分組ACC患者生存期要明顯短于Ki67<10分組(P<0.001)，而Weiss評分<6分的患者總體生存期同樣明顯長于>6分組(P<0.001)。

圖2 惡性組、良性組及正常腎上腺標本EGFR及IGF1R蛋白表達水平

圖3 Ki67、Weiss評分、EGFR及IGF1R指標與ACC患者預后Kaplan-Meier曲線

3 討 論

腎上腺皮質(zhì)腫瘤已逐漸成為人體最常見的實體腫瘤之一，雖然良性腺瘤患者行腫瘤切除后均能獲得滿意的療效和預后；但惡性皮質(zhì)癌惡性程度極高，預后極差，且臨床確診時由于腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此腎上腺皮質(zhì)癌的早期診斷顯得尤為重要，但目前的生化檢查及影像學技術(shù)尚不能有效鑒別出腎上腺腫塊的良、惡性，如何做到及時發(fā)現(xiàn)與早期決策有著非常重要的臨床意義。而當腫瘤進展至中晚期時，米托坦聯(lián)合細胞毒藥物為目前惟一可選的一線治療方案，但患者的總體生存率仍非常低，最新的研究顯示伴有遠處轉(zhuǎn)移或復發(fā)的腎上腺皮質(zhì)癌五年生存率僅為5%，且中位生存期低于15個月[5]。

晚期腫瘤的靶向治療己成為當前抗腫瘤治療的有效手段之一，針對不同分子靶點的單克隆抗體及酪氨酸激酶抑制劑等多種靶向治療藥物已應(yīng)用于臨床多種不同種類的腫瘤，而探索針對ACC的潛在靶點也顯得十分有必要。EGFR是一種膜表面具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白受體，屬于蛋白激酶超家族的成員，可以被EGF、THF-α等配體結(jié)合而活化，繼而激活下游信號轉(zhuǎn)導通路，引起胞內(nèi)一系列信號的級聯(lián)反應(yīng)，最終參與細胞的分化、遷移、血管生成和抑制凋亡等過程[3]。繼研究者首次在非小細胞肺癌中檢測出EGFR過表達后，人們相繼在多種實體瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、腎癌中檢測到EGFR的超表達或擴增[8]。我們對臨床收集的37例腎上腺皮質(zhì)腫瘤標本進行免疫組化半定量分析，結(jié)果顯示EGFR在腎上腺皮質(zhì)癌中呈高表達，在腎上腺皮質(zhì)腺瘤中表達低，兩者之間EGFR的表達存在顯著性差異(P<0.001)。并應(yīng)用Western blot技術(shù)進一步驗證腎上腺皮質(zhì)癌中的EGFR水平明顯高于腎上腺皮質(zhì)腺瘤和正常腎上腺皮質(zhì)組織。

IGF1R蛋白也是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶受體，而IGF-2基因位于11p5號染色體，編碼表達的生長因子IGF2可以特異性結(jié)合IGF1R。既往研究發(fā)現(xiàn)85%的腎上腺皮質(zhì)癌患者的染色體11p5上IGF2過度表達，RT-PCR亦顯示80%以上的患者過表達IGF2[9]；而IGF2與IGF1R特異性結(jié)合后，導致受體自身的磷酸化，進一步通過PI3K-AKT和STAT等途徑，或激活RAS-MAPK級聯(lián)反應(yīng)，從而促進細胞生長增殖并抑制凋亡[10]。我們通過對收集的腎上腺皮質(zhì)腫瘤標本進行免疫組化和蛋白印跡實驗檢測，研究結(jié)果證實ACC中IGF1R的表達水平遠高于良性的腎上腺皮質(zhì)腺瘤。

同時，我們通過Kaplan-Meier預后曲線分析，發(fā)現(xiàn)EGFR及IGF1R表達陽性患者總體生存期并無明顯相關(guān)(P>0.05)，提示可能EGFR及IGF1R并不能用于預測ACC患者的總體預后。Ki67抗原存在于細胞周期中除G0期外所有階段，它開始表達于G1期，在S期及G2期表達增加，至M期達高峰，在分裂晚期消失，是檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標[11]。在腎上腺腫瘤中，Ki67在惡性組中指數(shù)較高，而在良性腺瘤中一般均小于5分。本研究中發(fā)現(xiàn)將Ki67指數(shù)分為<10%及>10%，發(fā)現(xiàn)>10%組ACC患者預后總體生存期明顯更差(P<0.01),這與近期其他報道類似[12]；同時既往亦有文章報道Ki67與疾病復發(fā)有關(guān)[13]，進一步確認了Ki67作為ACC預后觀察指標的應(yīng)用。而Weiss評分主要根據(jù)9項組織學指標來鑒別腎上腺腫瘤的良惡性，本研究發(fā)現(xiàn)將Weiss評分分為3～6分及>6分，大于6分組患者總體生存期明顯更短(P<0.01),亦提示可以將Weiss評分作為ACC患者總體預后的觀察指標。進一步比較Ki67指數(shù)及Weiss評分的預測效能，提示兩者預測能力類似。

通過本研究我們推測，EGFR和IGF1R的過度表達與ACC腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均有密切關(guān)系，兩者可以作為鑒別良、惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤一種有價值的分子標志物，且可能成為抑制ACC細胞增殖和遠處轉(zhuǎn)移的治療新的分子靶標；同時Ki67及Weiss評分可以作為腎上腺皮質(zhì)癌患者的預后預測指標。

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(編輯 何宏靈)

The diagnostic and prognostic value of EGFR, IGF1R, Ki67 and Weiss score for adrenocortical tumors

XU Lie-yu1, XU Yun-ze2, LIAN Jian-po1, LIN Deng-qiang1, SHEN Zhou-jun1, ZHU Yu1

(1.Department of Urology,Ruijin Hospital; 2. Department of Urology, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 20025, China)

Objective To investigate the expressions of epidermal growth factor receptor(EGFR) and insulin like growth factor 1 receptor(IGF-1R) in adrenocortical carcinoma(ACC), and to further evaluate the prognostic value of Ki67 and Weiss score for ACC. Methods A total of 37 adrenal cortical neoplasm specimens resected from patients were examined with immunohistochemistry and western immunoblot for the expressions of EGFR and IGF-1R. The patients were divided into two groups(17 benign and 20 malignant cases). The association between these markers with the prognosis of ACC was investigated withKaplan-Meiercurve. Results The expression of EGFR in the malignant group was significantly higher than that of benign group(15/20vs. 3/17,P<0.01), and the positive expression of IGF1R was significantly higher in the malignant group than in the benign group(14/20vs. 4/17,P<0.01). Moreover, the protein expression levels of EGFR and IGF1R were higher in the malignant group than in the benign group. Prognosis analysis indicated that patients with Ki67>10% had poor prognosis than those with Ki67<10%(P<0.01), while patients with Weiss score>6 had shorter survival than those with Weiss score<6(P<0.01). Conclusion The high expressions of EGFR and IGF-1R in ACC contribute to tumor angiogenesis, which provide the theoretical evidence for anti-angiogenesis regime in ACC. Meanwhile, the Ki67 and Weiss score can serve as valuable prognostic marker for ACC.

adrenocortical carcinoma; epidermal growth factor receptor(EGFR); insulin like growth factor 1 receptor(IGFIR); Ki67 index; Weiss score

2015-10-19

2016-03-05

國家自然科學基金(No.81272936)，上海市科委引導基金(No.134119a2700)

祝宇，主任醫(yī)師. E-mail：zyyyhyq@126.com

徐烈雨(1991-)，男(漢族)，碩士研究生.研究方向：腎上腺腫瘤.E-mail:877312540@qq.com

R736.6

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.06.003