全炎銘 賈澤穎 劉 鄧 郭又春 劉修權(quán) 劉莉如 伊秀春 陳華林
(北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站,北京 100192)
比較兩種ELISA試劑盒在豬偽狂犬病血清抗體檢測(cè)中的一致性
全炎銘 賈澤穎 劉 鄧 郭又春 劉修權(quán) 劉莉如 伊秀春 陳華林
(北京三元集團(tuán)畜牧獸醫(yī)總站,北京 100192)
比較兩種ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性,為流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷篩選適合的商品化試劑盒。采用來自兩個(gè)廠家的野毒抗體 (gE)和免疫抗體 (gB)ELISA檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)362份和392份豬血清,應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性。結(jié)果顯示:兩種豬偽狂犬病抗體 (gE)檢測(cè)試劑盒聯(lián)合檢測(cè)出95份抗體陽(yáng)性和256份陰性,符合率97.24%,結(jié)果一致性為極強(qiáng) (Kappa值0.932);兩種豬偽狂犬病抗體 (gB)檢測(cè)試劑盒聯(lián)合檢測(cè)出351份抗體陽(yáng)性和9份陰性,符合率91.84%,一致性為弱 (Kappa值0.347)。以上結(jié)果說明,兩種豬偽狂犬病抗體 (gE)檢測(cè)試劑盒都適用于PRV gE抗體檢測(cè),而兩種豬偽狂犬病抗體 (gB)檢測(cè)試劑盒差異較大,需慎重選擇。
豬偽狂犬??;ELISA試劑盒;比較;Kappa檢驗(yàn)
偽狂犬?。≒seudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種急性傳染病,其特征為發(fā)熱、奇癢及腦膜炎癥狀[1-2]。該病曾得到很好的控制,但2011年至今,從北方向南方,PR疫情再次抬頭,席卷我國(guó)大部分地區(qū),許多免疫過基因缺失苗的規(guī)?;幮载i場(chǎng)瞬間轉(zhuǎn)陽(yáng),很多研究[3-6]表明此次大面積的豬場(chǎng)發(fā)病是由變異的PRV引起。雖然近期該病看似得到控制,很多野毒感染陽(yáng)性穩(wěn)定場(chǎng)很少發(fā)病,僅出現(xiàn)混合感染病例,但是在種豬場(chǎng)各個(gè)生長(zhǎng)階段的豬群野毒感染的高陽(yáng)性率,很大程度上影響了國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展,增加了疫病防控的復(fù)雜性[7-9],同時(shí)PR野毒感染率居高不下,存在疫情暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,為了保證被檢豬群的安全性和加快陽(yáng)性豬場(chǎng)的野毒凈化措施,有效開展野毒感染抗體與免疫抗體水平的跟蹤監(jiān)測(cè)顯得十分重要[7-8]。
病毒抗體監(jiān)測(cè)的方法較多,其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有客觀、敏感、特異、快捷等優(yōu)點(diǎn),為國(guó)際貿(mào)易中抗體檢測(cè)指定方法之一,目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床診斷和血清學(xué)調(diào)查中[10-12]。本研究通過比較國(guó)內(nèi)運(yùn)用較為廣泛的兩種進(jìn)口PR病毒野毒抗體gE和gB抗體ELISA檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)樣本來源清晰的PR陽(yáng)性豬場(chǎng)和陰性豬場(chǎng)血清,對(duì)其檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)估和分析,為合理選擇診斷試劑盒提供參考。
1.1檢測(cè)樣品
豬血清采自9個(gè)不同的規(guī)?;i場(chǎng)(陽(yáng)性豬場(chǎng)3個(gè),陰性豬場(chǎng)6個(gè)),為本實(shí)驗(yàn)室保
存的秋季抽檢血清樣本。選取392份生長(zhǎng)階段清晰的血清樣本進(jìn)行免疫抗體檢測(cè)(除25~30日齡哺乳仔豬外,其他均免疫過PRV gE基因缺失弱毒苗),再?gòu)倪@392份血清中剔除PR陰性場(chǎng)(A豬場(chǎng))30份血清進(jìn)行野毒抗體檢測(cè)。
1.2檢測(cè)試劑
ELISA進(jìn)口試劑盒分別購(gòu)買于美國(guó)愛德士(IDEXX)公司和西班牙海博萊(HIPRA)公司。PRV-gpI(gE)抗體檢測(cè)試劑盒:IDEXX(批號(hào)為99-09836 FM349),HIPRA(批號(hào)為 CAE.IM90);gB抗體檢測(cè)試劑盒:IDEXX(批號(hào)為99-09732 EM176),HIPRA(批號(hào)為FS6397)。
1.3檢測(cè)方法及結(jié)果判定
豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)方法均按試劑盒說明書進(jìn)行。IDEXX:讀取OD650值,用S/N值來判定結(jié)果(S/N=樣品OD值/陰性對(duì)照平均OD值),其中S/N≤0.6判為陽(yáng)性,S/N>0.7為陰性,0.6<S/N≤0.7為可疑;HIPRA:讀取OD450值,采用IN%值判定(IN%=(陰性對(duì)照平均OD值-樣品OD值)/陰性對(duì)照平均OD值*100%),其中IN%>45為陽(yáng)性,IN%<40為陰性,40≤IN%≤45為可疑。
豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)方法也按試劑盒說明書進(jìn)行。IDEXX:讀取OD650值,用S/N值來判定結(jié)果,其中S/N≤0.5為陽(yáng)性,S/N>0.6為陰性,0.5<S/N≤0.6為可疑;HIPRA:測(cè)定OD405值并計(jì)算S/P值,S/P= (樣品OD值-陰性對(duì)照平均OD值)/(陽(yáng)性對(duì)照平均OD值-陰性對(duì)照平均OD值),其中S/P≥0.5為陽(yáng)性,S/P<0.5為陰性。
如有結(jié)果差異,選取兩試劑盒檢測(cè)結(jié)果不一致的血清樣本,再檢測(cè)1次,取2次平均OD值作為最終結(jié)果判定。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和判定指標(biāo)
采用EXCEL處理數(shù)據(jù),使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)判定一致性,其中Kappa值<0,提示一致性極差;Kappa值在0~0.2,表示一致性微弱;Kappa值在0.21~0.4,一致性弱;Kappa值在0.41~0.6,中度一致;Kappa值在0.61~0.80,較高一致性;Kappa值>0.80,極強(qiáng)一致性。通過符合率、Kappa值等統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo),并結(jié)合送檢豬場(chǎng)流行病學(xué)情況綜合評(píng)價(jià)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。
2.1 Kappa檢驗(yàn)比較豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒
采用兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果見表1,總體樣品結(jié)果的符合率為97.24%。根據(jù)Kappa一致性檢驗(yàn),Kappa值為0.932,表明兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果有極強(qiáng)的一致性。
表1 兩種gE抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性分析 (份)
兩種豬偽狂犬病病毒gpI(gE)抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,362份樣品中有10份樣品結(jié)果不一致,分析發(fā)現(xiàn)這10份血清樣品的IDEXX檢測(cè)結(jié)果S/N值都是介于0.4~0.7之間,且分別來源于1份種公豬樣品(B033-1),1份哺乳仔豬樣品(B033-P5),1份母豬樣品(B036-8)和7份育成育肥豬樣品。不相符合豬血清樣品檢測(cè)結(jié)果見表2。
表2 兩種gE抗體試劑盒檢測(cè)不相符合血清樣品結(jié)果比較
2.2 Kappa檢驗(yàn)比較豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)試劑盒
豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果見表3,總體樣品檢測(cè)結(jié)果的符合率為91.84%。Kappa值為0.347,判定結(jié)果為弱,表明兩種產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果存在較弱的一致性。
表3 兩種gB抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性分析 (份)
兩種gB ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果可見,392份豬血清樣品中,有33份樣品結(jié)果不一致,分析檢測(cè)差異主要集中在育成育肥豬群(中大豬),4份育仔豬。參考送檢豬場(chǎng)的送樣信息可看出,用這兩種試劑盒檢測(cè)PR陰性場(chǎng)和陽(yáng)性場(chǎng)一部分中大豬血清樣品出現(xiàn)了明顯差異,見表4。
Kappa統(tǒng)計(jì)量是Cohen在1960年首先提出的一種旨在校正機(jī)遇可能后衡量一致性的方法,也是一種用于檢驗(yàn)分類變量資料的一致性和重現(xiàn)性的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)[13]。具體而言,在研究工作中,可用來檢驗(yàn)比較兩種檢查或測(cè)定方法結(jié)果的一致性,以及評(píng)估臨床診斷結(jié)果或調(diào)查結(jié)果的重現(xiàn)性問題[14]。近幾年來,該方法在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究、流行病學(xué)及臨床資料可靠性考察衡量方面的應(yīng)用越來越廣泛[14-16],但在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中較少。隨著國(guó)家對(duì)一些重大動(dòng)物疫病防控的高度重視,在強(qiáng)制免疫成為防疫的關(guān)鍵一環(huán)后,臨床診斷和抗體跟蹤監(jiān)測(cè)顯得尤為重要,于是市面上很多獸醫(yī)臨床診斷試劑盒,如雨后春筍不斷涌現(xiàn),可以應(yīng)用Kappa一致性檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行比較和評(píng)估[10-12,17]。
豬偽狂犬病的防治主要依靠疫苗接種和常規(guī)診斷檢測(cè),豬PR病毒野毒抗體檢測(cè)采用gE抗體檢測(cè)試劑盒,診斷豬群是否感染豬偽狂犬病野毒株。PRV gE和gB抗體檢測(cè)試劑盒可用于PR診斷和該病的綜合防治及PR凈化效果的評(píng)估。本研究根據(jù)Kappa值為0.932這個(gè)判定指標(biāo),表明兩個(gè)廠家gE-ELISA試劑盒一致性極強(qiáng),說明兩種試劑盒在血清學(xué)診斷和監(jiān)測(cè)中差異不顯著,均可用于臨床個(gè)體樣本和群體野毒抗體檢測(cè),這與楊濤等[17]報(bào)道的基本一致。
表4 兩種gB抗體試劑盒檢測(cè)不相符合血清樣品結(jié)果比較
在規(guī)?;i場(chǎng)豬群PRV gE野毒抗體檢測(cè)的同時(shí),采用gB抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)豬群免疫后產(chǎn)生的抗體水平進(jìn)行檢測(cè),能更好地反映豬群PR防疫水平和抵制強(qiáng)毒感染的能力。通過我們對(duì)北京部分規(guī)?;B(yǎng)殖豬場(chǎng)PR的摸底排查和持續(xù)的跟蹤監(jiān)測(cè),了解到目前豬場(chǎng)普遍使用PRV gE基因缺失弱毒苗防控PR,近一兩年內(nèi)出現(xiàn)很多PR陽(yáng)性穩(wěn)定場(chǎng),全群受野毒侵蝕,后備豬群表現(xiàn)高的陽(yáng)性率,是母豬群陽(yáng)性率居高不下,其豬群中隱性感染的豬只隨之進(jìn)入后備群,在豬場(chǎng)中形成循環(huán)感染,造成PR難以凈化的重要原因。但是出現(xiàn)的豬群免疫后持續(xù)性抗體水平(gB抗體高達(dá)95%以上)這種奇怪的現(xiàn)象引人深思,而本研究通過比較兩種gB抗體檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)結(jié)果差異較大,一致性為弱,提示兩種試劑盒至少有一種結(jié)果不可靠,對(duì)兩者檢測(cè)結(jié)果存在差異的33份豬血清進(jìn)行分析不難看出,主要集中在中大豬的檢測(cè)樣本中,HIPRA-gB ELISA結(jié)果檢出陰性,符合當(dāng)前豬場(chǎng)中大豬群抗體低,容易感染的實(shí)際背景。表明不管是PR陰性場(chǎng)還是PR陽(yáng)性場(chǎng)部分中大豬群免疫抗體水平低,加上衛(wèi)生環(huán)境差,容易激發(fā)混合感染而發(fā)病,有必要加強(qiáng)育成育肥豬舍的日常消毒衛(wèi)生和生物安全工作。因此建議在開展PR免疫后gB抗體檢測(cè)時(shí),應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)群體來源和檢測(cè)對(duì)象,慎重選擇不同的診斷試劑盒[10,12]。
當(dāng)然,根據(jù)實(shí)際檢測(cè)樣本計(jì)算的Kappa值僅僅只是一個(gè)樣本的統(tǒng)計(jì)量,是反映一致性程度的數(shù)值[10],體現(xiàn)兩種檢查方法或試劑檢測(cè)的一致性水平,可作為可靠性參考,但不是判定試劑盒或方法好壞優(yōu)劣的唯一性指標(biāo),還需要參考敏感性、特異性和穩(wěn)定性等指標(biāo)[11-12],以及抽樣誤差和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中不可控的其他影響因素。
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S858.28
A
1673-4645(2016)12-0045-04
2016-12-04
三元種業(yè)自立課題(SYZY20130019)
全炎銘(1984-),湖南湘西人,碩士研究生,E-mail:26326109@qq.com