CYP11A1基因在藏豬和藏梅豬卵巢、子宮和輸卵管組織表達差異

劉 銳 李江凌 陳曉暉龔建軍 楊躍奎 呂學斌

（1四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；2動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

CYP11A1基因在藏豬和藏梅豬卵巢、子宮和輸卵管組織表達差異

劉 銳1,2李江凌1,2陳曉暉1,2龔建軍1,2楊躍奎1,2呂學斌1,2

（1四川省畜牧科學研究院，四川成都 610066；2動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

基因是催化類固醇激素生成過程中的第一個水解酶，也是該過程的限速酶，對于受到激素調節(jié)的動物繁殖生理過程有重要作用。本文研究了基因在產仔數有明顯差異兩個豬種卵巢、子宮和輸卵管三個組織中的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)基因在卵巢組織中表達最豐富，且在兩個不同豬種中有顯著差異 （P＜0.05）。這說明基因豬卵巢功能發(fā)揮具有重要作用。

基因；藏豬；藏梅豬；差異表達

1 材料與方法

1.1試驗動物及組織樣品采集

試驗所用的藏豬和藏梅豬均由四川省畜牧科學研究院育種科研基地提供。隨機選擇發(fā)情期母豬藏豬和藏梅豬各3頭，其中，藏梅豬為四川省畜牧科學研究院自主培育的川藏黑豬配套系母本品系，該品系是由藏豬和梅山豬血緣組成的合成品系。藏豬和梅山豬在母豬繁殖力上有明顯的差異，是研究豬繁殖力的良好試驗材料。

豬只屠宰后，立即小心獲取生殖系統(tǒng)組織——卵巢、輸卵管和子宮入冷凍管，投入液氮保存以便于后續(xù)研究。

1.2組織樣品總RNA提取及cDNA合成

將-80℃凍結的大約50～100 mg組織樣品迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末（無明顯的可見顆粒），然后加入適量的RNAiso Plus（TaKaRa），將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，室溫靜置直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈玫瑰紅色透明狀。將勻漿液轉移至離心管中，按照試劑盒說明書進行總RNA提取。用NanoDrop 2000（Thermo）對提取的RNA進行質檢，RNA純度通過計算A260/280 nm（介于1.90和2.10之間）進行評估，RNA完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀測。

反轉錄采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA synthesis supermix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），按照其操作說明書完成cDNA的合成。

1.3熒光定量PCR

引物用PRIMER3軟件（http://frodo.wi.mit.edu/）設計，以肽基脯氨酰異構酶A（PPIA）、核糖體蛋白L4（RPL4）和Tyr-3/Trp-5單氧酶激活蛋白Zeta（YWHAZ）作為內參基因，由深圳華大基因科技有限公司合成，序列信息見表1。設計引物時要求至少有一條引物跨過了外顯子之間的連接處，以確保定量準確，設計好的引物Primer Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools /primer-blast）進行評價，并用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的特異性。

qPCR采用SsoFastTMEvaGreenSupermix（Bio-Rad）試劑盒，反應在CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀上進行（Bio-Rad）。根據試劑盒操作說明進行擴增，PCR反應條件如下：95℃熱啟動30秒，40個熱循環(huán)包括95℃變性5秒，退火/延伸（表1）5秒。PCR擴增后進行熔解曲線分析，溫度以0.5℃/30秒的速率從65℃緩慢遞增到95℃。每個樣品做3個重復。表1中列出的Q-PCR擴增效率用等比例稀釋模板，通過軟件得到的標準曲線計算而來。

1.4數據分析

目標基因在各組織中的表達水平采用2-△△Ct（Livak）法進行相對定量。用在豬各組織穩(wěn)定表達的基因PPIA、RPL4和YWHA作看家基因。不同品種不同組織目標基因的表達差異情況用SPSS軟件進行t檢驗。

2 結果與分析

由圖1可知，CYP11A1基因在豬生殖系統(tǒng)組織都有表達，但在藏豬和藏梅豬的不同生殖系統(tǒng)組織中的表達量有所不同。在卵巢組織中，CYP11A1基因mRNA含量豐富，其在藏梅豬表達量極顯著地高于藏豬（＜0.01），說明在母豬發(fā)情期的生理過程中，該基因對于卵巢生理功能的發(fā)揮具有明顯的促進作用。而在輸卵管組織中，藏梅豬基因表達量極顯著地低于藏豬（＜0.01），說明在母豬發(fā)情期，基因表達對輸卵管組織發(fā)揮生理功能是負向調節(jié)；在子宮組織中，兩個豬種間無顯著差異（＞0.05），這種豐富卻無顯著差異的轉錄意味著基因的表達對于發(fā)情期子宮發(fā)揮生理作用是必需的。。

三個生殖系統(tǒng)組織中，CYP11A1基因在藏梅豬和藏豬的表達模式也不完全相同。兩個豬種中都是卵巢組織表達量最高，但是在藏豬中，CYP11A1基因在輸卵管表達量略高于子宮，而藏梅豬中卻恰好相反，雖然這兩個組織的差別表達并未達顯著水平（＞0.05）。這一結果表明，CYP11A1基因的表達對于發(fā)情期卵巢的功能發(fā)揮有重要作用。

表1 熒光定量PCR引物序列及相關信息

圖1 藏豬和藏梅豬CYP11A1基因在卵巢、輸卵管、子宮組織的表達差異

3 討論

盡管有關CYP11A1基因功能研究的相關資料非常有限，但是目前可以查到在人類以及模式生物（鼠）和其他動物（羊、牛、家禽）上的有關資料，這些資料表明，CYP11A1基因除了參與類固醇激素的合成這一主要功能外，也參與其他信號通路，比如調節(jié)T細胞功能，調節(jié)卵泡生成等[7-8]。

Gregoraszczuk E等[13]的研究表明，無論是青年母豬，還是經產母豬，大劑量的瘦素會使CYP11A1和17b-HSD蛋白表達量增加，從而使孕酮和睪酮分泌增加，造成卵巢囊腫。他們的研究證實了母豬暴露在過多的雄性激素中時，CYP11A1的表達量增加，增加患卵巢囊腫的幾率，即使是雌性胎兒也是如此（Hogg K等[14]。

[1]Zhang CW,Zhang XL,Xia YJ,et al.Association between polymorphisms of the CYP11A1 gene and polycystic ovary syndrome in Chinese women[J].Mol Biol Rep,2012,39(8): 8379-8385.

[2]Reddy KR,Deepika ML,Supriya Ke,et al.CYP11A1 microsatellite (tttta)n polymorphism in PCOS women from South India[J].J Assist Reprod Genet,2014,31(7):857-863.

[3]Kowalski KI,Tilly JL,Johnson AL.Cytochrome P450 side-chain cleavage (P450scc)in the hen ovary.I.Regulation of P450scc messenger RNA levels and steroidogenesis in theca cells of developing follicles[J].Biol Reprod,1991,45(6):955–966.

[4]Tilly JL,Kowalski KI,Johnson AL.Cytochrome P450 side-chain cleavage (P450scc)in the hen ovary.II.P450scc messenger RNA,immunoreactive protein,and enzyme activity in developing granulosa cells[J].Biol Reprod,1991,45(6):967–974.

[5]Johnson A,Woods DC.Dynamics of avian ovarian follicle development: cellular mechanisms of granulosa cell differentiation[J].Gen Comp Endocrinol,2009,163(1):12-17.

[6]Qi Xu,Yadong Song,Yang Chen,et al.Molecular cloning and expression patterns of the cholesterol side chain cleavage enzyme(CYP11A1)gene during the reproductive cycle in goose (Anas cygnoides)[J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2015,6:54.

[7]Jia Y,Domenico J,Takeda K,et al.Steroidogenic enzyme Cyp11a1 regulates Type 2 CD8+T cell skewing in allergic lung disease[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(20):8152-8157.

[8]Hatey F,Gasparoux JP,Mulsant P,et al.P450scc regulation in pig granulosa cells:investigation into the mechanism of induction[J].J Steroid Biochem Mol Biol,1992,43(8):869-874.

[9]Moe M,Meuwissen T,Lien S,et al.Gene expression profiles in testis of pigs with extreme high and low levels of androstenone[J].BMC Genomics 2007,8:405.

[10]Grindflek E,Berget I,Moe M,et al.Transcript profiling of candidate genes in testis of pigs exhibiting large differences in androstenone levels[J].BMC Genetics 2010,11:4.

[11]Robic A,Le Mignon G,Fève K,et al.New investigations around CYP11A1 and its possible involvement in an androstenone QTL characterised in Large White pigs[J].Genet Sel Evol,2011,43:15.

[12]Newell-Fugate AE,Taibl JN,Alloosh M,et al.Effects of Obesityand Metabolic Syndrome on Steroidogenesisand Folliculogenesis in the Female Ossabaw Mini-Pig[J].PLoS ONE, 2015,10(6):e0128749.doi:10.1371/journal.pone.0128749.

[13]Gregoraszczuk E?1,Rak-Mardy?a A.Supraphysiological leptin levels shift the profile of steroidogenesis in porcine ovarian follicles toward progesterone and testosterone secretion through increased expressions of CYP11A1 and 17b-HSD:a tissue culture approach[J].Reproduction,2013,145(3):311-317.

[14]Hogg K,McNeilly AS,Duncan WC.Prenatal androgen exposure leads to alterations in gene and protein expression in the ovine fetal ovary[J].Endocrinology,2011:152(5):2048-2059.

■簡訊

萬洲國際子公司1.45億美元購美國豬肉產品生產商

【本刊輯】據北京商報2016年11月24日報道，繼3年前在美國買下全球最大豬肉供應商史密斯菲爾德（Smithfield）之后，萬洲國際再度出手，準備買下美國肉食企業(yè)荷美爾（Hormel Foods）的子公司Clougherty。根據萬洲國際11月22日公告，史密斯菲爾德以1.45億美元的價格收購Clougherty。

根據萬洲國際提供的資料顯示，Clougherty是美國綜合豬肉產品生產及加工商。Clougherty植根加州，經營多個品牌如Farmer John及Saag’s Specialty Meats等，每年銷售額約500百萬美元。其產品主要在美國西南部出售，包括熱狗、培根、早餐肉腸、生鮮豬肉、火腿、午餐肉及煙熏香腸。

萬洲國際表示，收購Clougherty將使史密斯菲爾德獲得既有的具盈利能的業(yè)務、生鮮肉及肉制品的客戶，以及直接進入美國西岸市場的通道，這將擴充并加強密斯菲爾德的垂直整合供應鏈。

S828.2

B

1673-4645(2016)12-0059-04

2016-12-06

豬高繁殖力關鍵基因高通量篩選及新基因鑒定（2014JY0086）

劉銳，女，博士，副研究員，研究方向為畜禽分子遺傳育種；Email：liuruicau@126.com