張 代，李慧芬，馬 成

（1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南商丘476000；2.青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島，266061）

根源生物技術(shù)專欄

一種富含酪酸菌發(fā)酵豆粕的制備

張 代1，李慧芬2，馬 成2

（1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南商丘476000；2.青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島，266061）

DO I：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162308

本研究制備了一種復(fù)合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品-酪酸菌發(fā)酵豆粕。結(jié)果表明：該產(chǎn)品具有較強的益生菌價值，產(chǎn)品初始含有＞6×105CFU/g的酪酸菌，且穩(wěn)定性較好，一年后仍留存＞5×105CFU/g的酪酸菌。此外，該產(chǎn)品與豆粕原料相比，多種常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)得到改善，具體表現(xiàn)為：粗蛋白質(zhì)提升4.04%，酸溶蛋白質(zhì)提升12.02%，蛋白質(zhì)體外消化率提升9.69%，pH降低1.18，L-乳酸增加了2.92%，另外，該產(chǎn)品還可有效去除大分子抗原蛋白與不良寡糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子。

豆粕發(fā)酵劑；酪酸菌；常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)；抗原蛋白；不良寡糖

發(fā)酵豆粕具有較高的應(yīng)用價值，主要應(yīng)用于仔豬料、母豬料、水產(chǎn)飼料等。酪酸菌是新興的微生態(tài)制劑，具有減少腹瀉、抑制魏氏梭菌、提高飼料報酬等作用。但高純度酪酸菌單菌生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，應(yīng)用成本較高，限制了其應(yīng)用范圍。

復(fù)合型發(fā)酵豆粕是指用兩種或兩種以上的菌種聯(lián)合對豆粕進(jìn)行發(fā)酵，它有機結(jié)合了各菌種的特點，能對豆粕進(jìn)行充分有效的發(fā)酵。乳酸菌對豆粕進(jìn)行發(fā)酵時產(chǎn)生的大量乳酸，可用于維持畜禽腸道微生物平衡，并能改善發(fā)酵豆粕風(fēng)味，降低豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量（魏炳棟等，2010）。酪酸菌為絕對厭氧菌，可與兼性厭氧的乳酸菌共生，在固態(tài)發(fā)酵初始添加酪酸菌，在最終產(chǎn)品中仍有大量活酪酸菌菌體與代謝物質(zhì)殘留，可以起到促進(jìn)益生菌繁殖、抑制雜菌生長、修復(fù)腸黏膜損傷、提高機體免疫力等作用（王潤之等，2009等；王保正，2007；施大林，2006）。不同的菌種發(fā)酵豆粕所產(chǎn)生的營養(yǎng)價值不同，各有其特有的優(yōu)良性質(zhì)，本研究將酪酸菌與豆粕發(fā)酵菌共同發(fā)酵，旨在生產(chǎn)一種富含酪酸菌的發(fā)酵豆粕。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 根源豆粕發(fā)酵劑 （GY JY SBM fermentation agent）、酪酸菌菌粉（butyric acid bacteria fungus powder)，菌量1010CFU/g。

1.2 供試豆粕 渤海豆粕。

1.3 酪酸菌發(fā)酵豆粕制備 1000 kg豆粕+5 kg根源豆粕發(fā)酵劑+200 g酪酸菌菌粉+420 kg水，溫度控制在35～40℃，攪拌機內(nèi)混合均勻后，采用車陣式固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)，在恒溫發(fā)酵車間，35°C恒溫密封發(fā)酵72 h，采用流化床低溫烘干，獲得富含酪酸菌的發(fā)酵豆粕（李慧芬等，2015）。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 酪酸菌菌量測定方法 用胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基 （TSC），采用夾層培養(yǎng)法，進(jìn)行酪酸菌菌量測定。TSC培養(yǎng)基成分:胰胨15 g/L，大豆胨 5 g/L，酵母粉5 g/L，焦亞硫酸鈉1 g/L，檸檬酸鐵銨1 g/L，瓊脂15 g/L。調(diào)節(jié)pH至7.6，121℃高壓滅菌15min。

先用滅菌TSC培養(yǎng)基分裝平皿，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)空培24 h。無菌條件下取1 g酪酸菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)品，加入含有100 mL滅菌水與滅菌玻璃珠的錐形瓶內(nèi)，常溫攪拌30min，制成1∶100的初始懸浮液。吸取此懸浮液1 mL，加入9 mL滅菌水，充分混合后，制成1∶1000的稀釋液，根據(jù)含菌量，做進(jìn)一步的10倍梯度稀釋。取適宜梯度的稀釋液0.1mL，接種到3個平行的TSC平板上，用滅菌涂布棒涂布均勻，然后再傾注一層滅菌TSC培養(yǎng)基，形成TSC夾層培養(yǎng)。待培養(yǎng)基完全凝固后，將平皿放于含有1個厭氧袋的密封厭氧罐內(nèi)，37℃完全厭氧培養(yǎng)12h后，計量平皿上的菌落平均數(shù)量，并鏡檢酪酸菌菌體形態(tài)。

1.4.2 酪酸菌發(fā)酵豆粕中酪酸菌菌量測定 利用TSC培養(yǎng)基，采用夾層培養(yǎng)法，對L-1批次、L-3批次、L-7批次和L-15批次，進(jìn)行酪酸菌菌量測定。

1.4.3 酪酸菌發(fā)酵豆粕中酪酸菌存活率跟蹤 用TSC培養(yǎng)基，采用夾層培養(yǎng)法，對L-3批次的酪酸菌發(fā)酵豆粕，進(jìn)行一年的酪酸菌菌量跟蹤。跟蹤時間點為1月后、2月后、6月后、12月后。

1.4.4酪酸菌發(fā)酵豆粕與豆粕原料的常規(guī)指標(biāo)測定 采用國標(biāo)或企標(biāo)，對pH、L-乳酸、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白（%粗蛋白質(zhì)）、蛋白質(zhì)體外消化率等指標(biāo)進(jìn)行測定。pH:取10 g樣品（精確到0.001 g），加50 mL蒸餾水，混合后靜置15 min，用PHS-3C 型pH計測定；L-乳酸:取1 g樣品（精確到0.001 g），加100mL水，常溫磁力攪拌1 h，10000 r/min離心10min，取上清，利用SBA生物傳感器，測定L-乳酸含量；粗蛋白質(zhì):按照國標(biāo)飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法（GBT 6432-94），采用凱氏定氮法測定；酸溶蛋白:按照國標(biāo)大豆肽粉測定方法（GB/T 22492-2008），采用三氯乙酸TCA-凱氏定氮法測定；蛋白質(zhì)體外消化率:按照國標(biāo)動物性蛋白質(zhì)飼料胃蛋白酶消化率的測定（GB/T 17811-2008），采用過濾法測定。所有指標(biāo)測定3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.4.5 酪酸菌發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的測定 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法，對豆粕、酪酸菌發(fā)酵豆粕的抗原蛋白進(jìn)行定性測定（王寅等，2013）。樣品粉碎，過60目篩。稱取樣品0.1 g，加入30 mL 0.6%KOH溶液（質(zhì)量體積比），常溫下磁力攪拌器攪拌1 h，4000 r/min離心10 min，取上清；100μL+100μL上樣緩沖液，混勻后煮沸8min，即可點樣；20μL上樣，恒流15mA，約1 h，進(jìn)入分離膠后，恒流20 mA，2～2.5 h，蛋白條帶至膠底1.2 cm處停止；撥膠并用蒸餾水漂洗；采用考馬斯亮藍(lán)染色1.5 h；脫色液更換3次，并過夜；觀察條帶、照相。

1.4.6 酪酸菌發(fā)酵豆粕中不良寡糖的測定 采用薄層分析法（TLC）進(jìn)行不良寡糖指標(biāo)測定。采用0.5μm平頭微量進(jìn)樣器進(jìn)行點樣。稱取粉碎樣品5 g（精確到0.001 g）于250 mL碘量瓶，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇50mL，70℃水浴浸提1 h以上。浸提液經(jīng)10000 r/min離心10min，取上清4℃保藏備用。常規(guī)的TLC薄層，105℃活化30min，冷卻后取5μL點樣。點樣后，都用電吹風(fēng)的涼風(fēng)吹干。TLC板在倒入相應(yīng)展開劑的展層缸內(nèi)展開，展開液:V（乙腈）∶V（冰乙酸）∶V（水）=6∶3∶2。溶劑向上展開約90%的薄板長度，取出薄板并且馬上用鉛筆標(biāo)注出溶劑前沿，并計算Rf值。自然晾干后，噴淋顯色液，在140℃下烘至顯色（約2～6 min）。顯色液:20%硫酸+0.5%3,5—二羥基甲苯。觀察不良寡糖樣點并照相。

2 結(jié)果及分析

2.1 酪酸菌菌量測定 按照TSC夾層培養(yǎng)法，稀釋特定梯度的酪酸菌發(fā)酵豆粕檢測平板，每個平板生長酪酸菌菌落50～100個，菌落形態(tài)如圖1，為黑色、邊緣整齊、直徑較小的圓形菌落。菌體與亞硫酸鹽發(fā)生反應(yīng)，可產(chǎn)生臭氣硫化氫，焦亞硫酸鈉和檸檬酸鐵銨用于檢測硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色。菌體鏡檢如圖2，菌體呈梭狀，中心膨脹。

2.2 酪酸菌發(fā)酵豆粕中酪酸菌菌量測定 多批次酪酸菌發(fā)酵豆粕酪酸菌菌量測定結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，酪酸菌發(fā)酵豆粕中，均含有＞6× 105CFU/g的酪酸菌，這些酪酸菌進(jìn)入動物腸道內(nèi)，可以降低腸道pH，抑制有害菌生長，提高有益菌菌量，有效預(yù)防腸炎發(fā)生，并能緩解修復(fù)腸黏膜損傷，提高動物機體非特異性免疫力。

2.3 酪酸菌發(fā)酵豆粕中酪酸菌存活率跟蹤 酪酸菌發(fā)酵豆粕L-3批次中酪酸菌存活率跟蹤結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，酪酸菌發(fā)酵豆粕L-3批次產(chǎn)品中，最初含有6.45×105CFU/g的酪酸菌，1月后含有89.73%的酪酸菌，半年內(nèi)含有83.25%的酪酸菌，酪酸菌菌量＞5.3×105CFU/g，1年后仍含有78.97%的酪酸菌，酪酸菌菌量＞5×105CFU/g。

圖1 TSC夾層平板上的酪酸菌菌落

圖2 酪酸菌鏡檢圖（10×100）

圖3 酪酸菌發(fā)酵豆粕-多生產(chǎn)批次酪酸菌菌量測定

圖4 酪酸菌發(fā)酵豆粕L-3批次-酪酸菌存活率跟蹤

2.4 酪酸菌發(fā)酵豆粕與豆粕原料的常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)差異 酪酸菌發(fā)酵豆粕與豆粕原料的常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)差異比較結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，酪酸菌發(fā)酵豆粕相對于豆粕原料而言，各常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)都有所提升，具體表現(xiàn)為:經(jīng)發(fā)酵劑與酪酸菌聯(lián)合發(fā)酵獲得的發(fā)酵豆粕，具有更低的pH和更高的L-乳酸含量，PH降低了 1.18，L-乳酸增加了2.92%；在蛋白質(zhì)方面，因微生物的分解作用，酪酸菌發(fā)酵豆粕比豆粕原料具有更高的粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白和蛋白質(zhì)體外消化率，這幾個指標(biāo)分別提升了4.04%、12.02%、9.69%。

表1 發(fā)酵豆粕與豆粕原料的常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)差異比較

2.5 酪酸菌發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的去除 酪酸菌發(fā)酵豆粕與豆粕原料抗原蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，豆粕中的抗原蛋白，經(jīng)根源JY發(fā)酵劑與酪酸菌聯(lián)合發(fā)酵后，幾乎完全降解為小分子基團，其抗原活性大大降低，抗原蛋白的去除有利于減少動物養(yǎng)殖過程中蛋白質(zhì)過敏現(xiàn)象的發(fā)生（龔靈芝等，2008；于春艷等，2009；李婷琳等，2012）。

圖5 酪酸菌發(fā)酵豆粕與豆粕原料的SDS-PAGE對比圖

2.6 酪酸菌發(fā)酵豆粕中不良寡糖的降解 酪酸菌發(fā)酵豆粕與豆粕原料不良寡糖的薄層平板TLC結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，酪酸菌發(fā)酵豆粕相對于豆粕原料而言，不良寡糖幾乎完全被降解。豆粕原料中，一般含有5%蔗糖，1%棉籽糖和4%水蘇糖，其中棉籽糖和水蘇糖被稱為不良寡糖。不良寡糖又叫脹氣因子，這是因為動物體內(nèi)缺乏α-半乳糖苷酶，不良寡糖進(jìn)入腸道被微生物利用，轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸，進(jìn)而形成CO2，NH3，甚至甲烷，引起動物嗝氣、腸鳴等腸胃脹氣或腹疼等（曹鈺等，2007）。

3 討論與結(jié)論

固態(tài)發(fā)酵過程中不需添加任何化學(xué)試劑，成本較低，且在發(fā)酵后沒有廢水廢氣等殘留，無毒副作用，較安全可靠。微生物發(fā)酵豆粕，可消除多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時產(chǎn)生微生物蛋白質(zhì)，豐富并平衡豆粕中的蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平，最終改善豆粕的營養(yǎng)品質(zhì)，提高蛋白質(zhì)消化率與飼料轉(zhuǎn)化效率。

圖6 酪酸菌發(fā)酵豆粕與豆粕原料的不良寡糖薄層平板TLC對比圖

酪酸菌作為微生物飼料添加劑的使用，減少了使用抗生素所引起的抗藥性、二重感染等問題，提高了動物的自然防御機制和經(jīng)濟效益，已經(jīng)成為替代抗生素的一種理想選擇（魏偉群等，2011）。

根源酪酸菌發(fā)酵豆粕，采用根源自主研發(fā)的發(fā)酵劑與酪酸菌聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵豆粕而成，含有＞6× 105CFU/g的酪酸菌，且穩(wěn)定性較好，一年后仍留存＞5×105CFU/g的酪酸菌，具有較強的益生菌價值。此外，該產(chǎn)品與豆粕原料相比，可去除大分子抗原蛋白、棉籽糖與水蘇糖等不良寡糖，提高粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白、體外蛋白質(zhì)消化率和L-乳酸等有機酸含量，還可顯著降低發(fā)酵體系pH，這有利于抑制霉菌等雜菌的污染。酪酸菌發(fā)酵豆粕作為一種新型的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品，在降低抗原的基礎(chǔ)上，還具有較強的益生價值，可以作為一種添加劑推廣使用。

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This study was carried out to prepare a special composite solid-state fermented product-GY Butyric acid bacteria FSBM （fermented soybean meal）.Results showed that GY Butyric acid bacteria FSBM possess strong probiotic value which contain＞6×105CFU/g Butyric acid bacteria initially，and preserve＞5×105CFU/g Butyric acid bacteria one year later.In addition，compared with SBM，the product could improve multiple convention nutritive index，such as crude protein promote 4.04%，acid soluble protein promote 12.02%，protein in vitro digestibility coefficient promote 9.69%，pH reduce 1.18，L-Lactic acid increased by 2.92%，anti nutritional factors within giant molecule antigen protein and harmful oligosaccharide were removed effectively.

JY SBM fermentation agent；Butyric acid bacteria；convention nutritive index；antigen protein；harmful oligosaccharide

S816.6

A

1004-3314（2016）23-0036-04