2—脫氧葡萄糖對人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖的影響

趙靜+連曉英+傅博

[摘要] 目的 探討2-脫氧葡萄糖（2-DG）對常染色體顯性多囊腎?。ˋDPKD）囊腫襯里上皮細(xì)胞WT9-12增殖的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法 將體外培養(yǎng)的細(xì)胞分為對照組、不同濃度2-DG處理組（5、10、20、40 mmol/L）。用CCK-8法篩選不同濃度2-DG處理多囊腎上皮細(xì)胞不同時(shí)間（12、24、36、48 h）后，抑制細(xì)胞增殖活力的最適濃度和最適時(shí)間。采用EdU核酸標(biāo)記技術(shù)和Western blot檢測2-DG最適濃度處理多囊腎上皮細(xì)胞48 h后細(xì)胞的增殖抑制情況及代謝相關(guān)磷酸化-AMPKα（P-AMPKα）及增殖相關(guān)mTOR信號通路分子磷酸化-mTOR、p70S6K、4E-BP1（P-mTOR、P-p70S6K、P-4E-BP1）的水平變化；流式細(xì)胞術(shù)及Caspase-3試劑盒檢測不同濃度2-DG處理多囊腎上皮細(xì)胞48 h后細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果 與對照組比較，2-DG可明顯抑制多囊腎上皮細(xì)胞的增殖，且呈濃度和時(shí)間的依賴性（P < 0.05）；細(xì)胞代謝相關(guān)分子P-AMPKα的水平明顯升高（P < 0.05），增殖相關(guān)mTOR信號通路分子P-mTOR、P-p70S6K、P-4E-BP1的活性明顯抑制（P < 0.05）；與對照組比較，各濃度2-DG處理組的多囊腎上皮細(xì)胞早期凋亡率均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 2-DG可能通過調(diào)控AMPK-mTOR信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，共同抑制多囊腎上皮細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞] 2-脫氧葡萄糖；常染色體顯性多囊腎病；腎囊腫襯里上皮細(xì)胞；增殖

[中圖分類號] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of 2-DG on the proliferation of cyst lining epithelial cells WT9-12 and its possible action mechanism. Methods Cyst lining epithelial cells WT9-12 in vitro were divided into control group and 2-DG treatment group with different concentrations （5， 10， 20， 40 mmol/L）. CCK-8 method was used to screen the optimal concentration and the best time for the growth inhabition of polycystic kidney epithelial cells after drug treatment for different concentrations and different time （12， 24， 36， 48 h）. EdU Imaging Kit and Western blot were used to observe the proliferation rate and the levels of metabolism-related phosphorylated AMPKα， and proliferation-related phosphorylated mTOR， phosphorylated p70S6K， phosphorylated 4E-BP1 in the mTOR signal pathway of cyst lining epithelial cells exposed to 15 mmol/L 2-DG for 48 h. Flow cytometry and Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit were used to detect the apoptosis rate of cyst lining epithelial cells treated by 2-DG of different concentrations for 48 h. Results The results showed that 2-DG can significantly inhibit the proliferation of polycystic kidney epithelial cells， compared with the control group， and the anti-proliferative effects in time-dependent and dose-dependent modes （P < 0.05）. The level of metabolic related molecule P-AMPKα was obviously increased （P < 0.05）， but the expression activity of the proliferation related molecule P-mTOR， P-p70S6K and P-4E-BP1 were markedly decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， the early apoptosis rate of polycystic kidney cells was promoted by the different concentrations of 2-DG， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion 2-DG may inhibit the growth of WT9-12 cyst lining epithelial cells through regulate the AMPK-mTOR signal pathway and promote apoptosis.

[Key words] 2-deoxyglucose； Autosomal dominant polycystic kidney disease； Cystic lining epithelial cells；Proliferation

常染色體顯性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種常見的遺傳性腎臟疾病[1]。由于具體的發(fā)病機(jī)制仍未明確，目前尚無能夠阻止囊泡形成和生長的有效藥物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，多囊腎上皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞類似，主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP，且細(xì)胞中ATP/AMP比值升高，能量感受器AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性下降，雷帕霉素哺乳靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性增加，細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)[3]。2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）是一種人工合成的葡萄糖類似物，可抑制糖酵解、減少ATP產(chǎn)生，已被用于腫瘤的治療研究[4-5]。本研究觀察了2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞增殖的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 試劑

人ADPKD 囊腫襯里上皮細(xì)胞系WT9-12與DMEM完全培養(yǎng)基，購自ATCC公司；胎牛血清購自Gibco公司；2-脫氧葡萄糖購自Med Chem Express（MCE）公司；Cell Counting Kit-8購自DOJINDO公司；Click-iTEdU Imaging Kits購自InvitrogenTM Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit購自BioVision公司；Annexin V/PI雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Bender公司；抗Phospho-（AMPKα、mTOR、p70S6K、4E-BP1）抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 分組方法

配制含10%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培養(yǎng)基。多囊腎上皮細(xì)胞復(fù)蘇后，在37℃ 5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，隔天換液，每2～3天傳代，細(xì)胞呈貼壁生長狀態(tài)。2-DG溶解于去離子水中配置為1 mol/L的終濃度。將傳代好的細(xì)胞分為5組：對照組，2-DG處理組（5、10、20、40 mmol/L），行CCK-8細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)。選取2-DG濃度為15 mmol/L進(jìn)行EdU核酸標(biāo)記實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測實(shí)驗(yàn)。

1.3. CCK-8法檢測2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞增殖的影響

將多囊腎上皮細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為3×107/L，每孔100 μL接種于96孔板，分為6組：空白組、對照組和2-DG處理組（5、10、20、40 mmol/L），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，換液為含0.1% FBS的完全培養(yǎng)基同步化24 h，之后每組給予不同濃度2-DG（空白對照無細(xì)胞只加培養(yǎng)基）培養(yǎng)12、24、36、48 h后，每孔加入10 μL Cell Couning Kit-8試劑，在37℃孵箱中孵育4 h，使用酶標(biāo)儀讀取 450 nm波長下每孔的吸光度值（A）。增殖抑制率（%）=（A對照-A實(shí)驗(yàn)）/（A對照-A空白）×100%。

1.4 EdU法檢測2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞增殖的影響

選擇15 mmol/L濃度2-DG治療的多囊腎上皮細(xì)胞作為處理組，培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入0.02 μmol EdU，孵育4 h，按EdU核酸標(biāo)記試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料）試劑染細(xì)胞核，最后用激光共聚焦顯微鏡采集圖片，其中藍(lán)色代表所有細(xì)胞核，粉色代表新增殖的細(xì)胞核。

1.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá)

收集對照組與處理組（15 mmol/L 2-DG干預(yù)48 h的多囊腎上皮細(xì)胞）細(xì)胞的蛋白，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取50 μg樣本蛋白按順序加樣，SDS-PAGE電泳后，I=250 mA恒流轉(zhuǎn)移至NC膜，5%BSA封閉1 h，分別予以不同的一抗孵育24 h，HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000）常溫孵育1.5 h，ECL顯影，Image-J 凝膠圖像分析軟件對各組蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6 流式細(xì)胞儀及Caspase-3試劑盒檢測多囊腎上皮細(xì)胞的凋亡情況

1.6.1 Annexin V/PI雙染色流式法 用0、5、10、20、40 mmol/L的2-DG處理多囊腎上皮細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器調(diào)整每組細(xì)胞數(shù)為1×106/mL。每組取100 μL細(xì)胞懸液于流式小管，加入200 μL Annexin V/PI Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min后上機(jī)檢測各藥物處理組與對照組中細(xì)胞的壞死和晚期凋亡率（D1、D2：PI+/Annexin V-FITC+）、活細(xì)胞率（D3：PI-/Annexin V-FITC-）和早期凋亡率（D4：PI-/Annexin V-FITC+）。

1.6.2 Caspase-3比色測定法 不同濃度（0、5、10、20、40 mmol/L）的2-DG處理多囊腎上皮細(xì)胞48 h后收集蛋白，測定每組蛋白的濃度，調(diào)整各組蛋白為相同濃度，每組取50 μL蛋白，加入50 μL Reaction Buffer和5 μL DEVD-pNA（caspase-3探針）后在37℃孵箱內(nèi)避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測405 nm波長的吸光度值（A）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示：在同一時(shí)間內(nèi)，隨著2-DG濃度的增加，存活細(xì)胞數(shù)逐漸減少（P < 0.05），提示2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性，其中40 mmol/L濃度的2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)；對同一濃度而言，隨著時(shí)間的延長，2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞的增殖抑制效果也逐漸增強(qiáng)，具有時(shí)間依賴性，48 h的抑制率最高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（見圖1A）。使用不同濃度（5、10、20、40 mmol/L）的2-DG處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的增殖抑制率分別是（30.7±2.3）%、（46.5±2.5）%、（54.8±1.9）%、（68.5±1.7）%，計(jì)算得到半數(shù)抑制濃度（IC50）為（14.61±2.1）mmol/L。故在后續(xù)的增殖實(shí)驗(yàn)中設(shè)定2-DG的最適給藥濃度為15 mmol/L（見圖1B）。

EdU核酸標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果顯示：15 mmol/L 2-DG處理組中EdU陽性細(xì)胞率為（45.36±4.26）%，而對照組中EdU陽性細(xì)胞率為（16.12±1.26）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.2 2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞中代謝相關(guān)分子AMPK及增殖相關(guān)信號通路分子活化的影響

多囊腎上皮細(xì)胞內(nèi)代謝相關(guān)信號通路活化型分子P-AMPKα的表達(dá)升高（P < 0.05）；增殖相關(guān)信號通路活化型分子P-mTOR、P-p70S6K和P-4E-BP1的表達(dá)降低（P < 0.05）。見圖3。

2.3 2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，各濃度2-DG處理組的多囊腎上皮細(xì)胞早期凋亡率（D4）均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與對照組比較，20 mmol/L 2-DG處理組細(xì)胞晚期凋亡率（D2）明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。各組壞死率及活細(xì)胞率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1、圖4。

2.4 2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞中凋亡執(zhí)行酶caspase-3活性的影響

與對照組比較，2-DG各處理組中caspase-3酶活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

ADPKD是人類常見的遺傳性疾病，發(fā)病率為1/1000～1/500，85%的ADPKD由于PKD1基因突變導(dǎo)致，而15%的患者由于PKD2基因突變所致[6]。其病變特點(diǎn)為雙腎充滿多個(gè)進(jìn)行性增長的液性囊泡，隨著病變的進(jìn)展，囊泡逐漸增多增大，壓迫正常腎組織，最終發(fā)展為終末期腎臟病。臨床中除對癥治療及應(yīng)用腎移植和透析治療終末期腎臟病外，尚無有效的靶向治療藥物[7-8]。近年來，在多種PKD嚙齒動(dòng)物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制劑雷帕霉素、PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮、生長抑素類似物奧曲肽、加壓素V2受體拮抗劑托伐普坦等藥物可以抑制多囊腎上皮細(xì)胞異常增殖及囊液過度分泌，顯示出良好的療效。但是，之后的臨床研究結(jié)果顯示，雷帕霉素、奧曲肽和托伐普坦在人體中的治療效果并不理想[9-12]，因此急需新的治療方法。

研究發(fā)現(xiàn)，PKD1突變小鼠模型中多囊腎上皮細(xì)胞的代謝方式與腫瘤細(xì)胞相似，存在瓦氏效應(yīng)，即在氧氣充足的條件下，也主要依賴有氧糖酵解途徑產(chǎn)生ATP，而正常細(xì)胞主要通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[3，13]。根據(jù)瓦氏效應(yīng)學(xué)說，腫瘤細(xì)胞能量代謝調(diào)控失常影響了細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)過程[14]。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種細(xì)胞內(nèi)能量代謝感受器，是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵分子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP/AMP比例降低時(shí)，可以激活A(yù)MPK，從而激活一系列能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)ATP合成。反之，當(dāng)ATP升高時(shí)，可抑制AMPK的活性。在腫瘤細(xì)胞中，通過糖酵解途徑大量消耗葡萄糖產(chǎn)生高水平ATP，AMP/ATP 比例下降，AMPK活性被明顯抑制[15]。在多囊腎上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ATP/AMP的比例升高，AMP相對下降，AMPK的活性被明顯抑制[3]。雷帕霉素哺乳靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）不僅在調(diào)控能量代謝方面發(fā)揮重要作用，而且是調(diào)控細(xì)胞生長與增殖的一個(gè)關(guān)鍵性蛋白激酶，mTOR下游信號通路分子包括p70S6K和4E-BP1，可促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明AMPK可特異性抑制mTOR的活性[16-17]。

2-DG是一種可競爭性抑制糖酵解過程的新型化學(xué)藥物，目前用于腫瘤的實(shí)驗(yàn)治療研究。在多個(gè)腫瘤動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)2-DG都具有良好的抗增殖效應(yīng)[18-20]。

本研究使用CCK-8及EdU核酸標(biāo)記技術(shù)（DNA合成過程中，EdU可取代胸腺嘧啶整合到DNA鏈中，體外螯合熒光染料的疊氮化鈉與EdU中乙炔基反應(yīng)后，使新合成的DNA在激光照射下發(fā)出熒光）檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的2-DG對多囊腎上皮細(xì)胞有明顯的抗增殖作用，且抗增殖效應(yīng)具有時(shí)間和劑量依賴性。Western blot結(jié)果顯示在2-DG處理后的多囊腎上皮細(xì)胞內(nèi)，P-AMPKα表達(dá)上調(diào)，P-mTOR、P-p70S6K和P-4E-BP1的表達(dá)均明顯下調(diào)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，其最終的共同途徑都是激活凋亡執(zhí)行酶Caspase-3。本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染法及Caspase-3/CPP32比色測定法，發(fā)現(xiàn)2-DG能促進(jìn)多囊腎上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示凋亡也可能參與了多囊腎上皮細(xì)胞的生長抑制作用。

本研究提示，2-DG可能主要通過靶向抑制多囊腎上皮細(xì)胞的糖代謝，使多囊腎上皮細(xì)胞內(nèi)ATP/AMP比值降低，AMP相對升高，激活能量感受器AMPK，從而抑制增殖相關(guān)的mTOR信號通路分子的活化，進(jìn)而抑制多囊腎上皮細(xì)胞的增殖，提示2-DG今后可能作為多囊腎臟病的潛在治療藥物。

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（收稿日期：2016-07-10 本文編輯：任 念）