對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯對酪氨酸酶的抑制效果

易晶晶

歐仕益

董穎妍

陳秋明

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

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對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯對酪氨酸酶的抑制效果

易晶晶

歐仕益

董穎妍

陳秋明

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

通過測定酶的穩(wěn)態(tài)活力、遲滯時間和動力學(xué)參數(shù)，研究對香豆酸、阿魏酸及低聚糖阿魏酸酯對酪氨酸酶的抑制效果。結(jié)果表明，3種物質(zhì)對酪氨酸酶單酚酶活性均有抑制作用，其中對香豆酸的抑制作用最強，其次為低聚糖阿魏酸酯和阿魏酸。對香豆酸、低聚糖阿魏酸酯和阿魏酸對單酚酶的IC50值分別為0.75，3.20，9.30 mmol/L。對香豆酸和阿魏酸抑制二酚酶活性，IC50值分別為4.3，12.7 mmol/L；但低聚糖阿魏酸酯對二酚酶活力沒有影響。對香豆酸能明顯延長單酚酶反應(yīng)的遲滯時間，阿魏酸影響很小，而低聚糖阿魏酸酯則縮短遲滯時間。動力學(xué)研究結(jié)果顯示，阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯對單酚酶的抑制作用表現(xiàn)為混合性抑制，而對香豆酸為競爭性抑制。

對香豆酸；阿魏酸；低聚糖阿魏酸酯；酪氨酸酶

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一種多酚氧化酶，其活性中心有兩個銅離子，可催化單酚類物質(zhì)(單酚酶活性)和二酚類物質(zhì)氧化為醌類(二酚酶活性)[1]，在黑色素形成的反應(yīng)前期起著非常重要的作用，是人體黑色素合成的限速酶。由于黑色素的過度沉淀會導(dǎo)致雀斑、黃褐斑、老年斑等皮膚疾病[2]，因此人們對酪氨酸酶抑制作用的研究日益重視。酪氨酸酶抑制劑主要分為五大類：某些酚類物質(zhì)、苯甲醛類、苯甲酸衍生物、長鏈脂類或類固醇、還有其他的一些天然或者合成的抑制劑[3]。

對香豆酸以游離態(tài)或結(jié)合態(tài)廣泛存在于水果、蔬菜、谷物及蕈類中，如蘋果、梨、大豆、土豆、玉米和燕麥等[4]；阿魏酸存在于一些水果、蔬菜、飲料和中藥，如當(dāng)歸、升麻屬類和川芎中[5]。玉米皮天然提取物低聚糖阿魏酸酯是阿魏酸與低聚糖酯化形成的物質(zhì)，因其結(jié)構(gòu)既含有阿魏?；?，又含有親水性的低聚糖基團，因此具有阿魏酸和低聚糖的雙重活性，能促進雙歧桿菌的增殖、清除自由基、抑制紅細胞氧化性溶血，水溶性好，熱穩(wěn)定性高[6]。因為酶抑制劑主要應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)，其安全穩(wěn)定和高效性是極其重要的因素，因此，低聚糖阿魏酸酯具有很高的實踐應(yīng)用價值。

近年來，對安全高效型酪氨酸酶抑制劑的探尋一直是一個研究熱點。有前人發(fā)現(xiàn)對香豆酸和阿魏酸對單酚酶顯示出一定的抑制效果，本試驗則從單酚酶和二酚酶兩個方面更系統(tǒng)地探討了這兩種物質(zhì)對酪氨酸酶的抑制作用。玉米低聚糖阿魏酸酯作為一種新型功能性谷物提取物，對酪氨酸酶的抑制作用未見報道。本試驗擬采用紫外分光光度法研究酪氨酸酶的活力，利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法求出3種物質(zhì)對酪氨酸單酚酶的抑制動力學(xué)參數(shù)從而探討其抑制機理，旨在為天然安全的美白劑開發(fā)和食品保鮮技術(shù)如延緩果蔬、飲料類褐變提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蘑菇酪氨酸酶：505 U/mg，超純級，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

酪氨酸、左旋多巴：99%，北京百靈威科技有限公司；

阿魏酸、對香豆酸：98%，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；

低聚糖阿魏酸酯：本實驗室參考文獻[6]從玉米麩皮中提取，其阿魏酸質(zhì)量分數(shù)為13%，還原糖主要有木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖；

玉米麩皮：山東西王集團有限公司；

二甲基亞砜(DMSO)：99.8%，北京百靈威科技有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

精密電子天平：HR-200型，廣州市艾安得儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV-900型，北京瑞利分析儀器公司；

水浴鍋：HH-4型，江蘇金壇市宏華儀器廠；

微型渦旋混合儀：XW-80A型，上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 3種物質(zhì)對酪氨酸酶抑制作用(IC50)及遲滯時間的測定 根據(jù)文獻[7～8]，修改如下：將對香豆酸、阿魏酸、低聚糖阿魏酸酯溶于DMSO中配成不同濃度的溶液；將酪氨酸、多巴和酪氨酸酶分別用0.1 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)配成一定濃度的溶液。向離心管中加入由3.4 mL的酪氨酸(或多巴)和0.1 mL抑制劑(對照組用DMSO代替抑制劑)組成的混合液，將混合液和酶液分別置于37 ℃水中溫浴5 min，取0.1 mL酶液加入混合液中，用渦旋混合儀混勻后立即倒入比色皿中，置于紫外分光光度計內(nèi)，記錄475 nm波長下吸光度的變化(以酪氨酸為底物，阿魏酸或低聚糖阿魏酸酯為抑制劑時，測量10 min內(nèi)吸光度的變化，而添加對香豆酸為抑制劑則需測量30 min內(nèi)的吸光度變化，以避免遲滯作用的干擾[9]；以多巴為底物，3種物質(zhì)分別為抑制劑時，均測量2 min內(nèi)的吸光度變化)。在此體系中，酶的最終濃度為50 U/mL(多巴為底物時，酶濃度為20 U/mL),酪氨酸的最終濃度為1.5 mmol/L(多巴濃度為10 mmol/L)。

反應(yīng)曲線的直線部分斜率即為速率，由于單酚酶反應(yīng)具有遲滯效應(yīng)，速率的計算應(yīng)先獲得反應(yīng)曲線上4個連續(xù)點呈線性關(guān)系的回歸方程，其斜率為速率；同時，將直線部分反向延長，交于橫軸的值即為遲滯時間[10]。

1.2.2 3種物質(zhì)對酪氨酸酶的抑制動力學(xué) 固定酶濃度50 U/mL，測量不同抑制劑濃度(對香豆酸：0.0，0.1，0.2 mmol/L；阿魏酸：0，3，7 mmol/L；低聚糖阿魏酸酯：0，1，2 mmol/L)和不同酪氨酸濃度(0.3～1.5 mmol/L)下酶的催化反應(yīng)速度，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法做出酶動力學(xué)曲線得到動力學(xué)參數(shù)以判斷其抑制類型。

1.2.3 相對抑制率的計算 計算公式：

(1)

式中：

I——相對抑制率，%；

Vi——有抑制劑存在時的反應(yīng)速率，ΔOD475 nm/min；

V0——無抑制劑存在時的反應(yīng)速率，ΔOD475 nm/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種物質(zhì)對單酚酶遲滯時間的影響

遲滯效應(yīng)是酪氨酸酶單酚酶催化反應(yīng)的典型特征[3]。表現(xiàn)為單酚底物與酶接觸后，反應(yīng)速度隨時間的延長而逐漸增加，并最終達到穩(wěn)定的最大速度。遲滯時間的延長，說明抑制劑增加了酶達到最大催化速度的時間，延緩了酶的反應(yīng)。

酪氨酸酶在自然狀態(tài)下主要以Emet形式存在[4]，該狀態(tài)下的酪氨酸酶不能與單酚底物結(jié)合，但具有二酚酶活性，能氧化鄰二酚類化合物成鄰二醌，同時酶轉(zhuǎn)化成Edoxy態(tài)(脫氧態(tài))，而Edoxy狀態(tài)下的酶能和氧分子結(jié)合轉(zhuǎn)變成Eoxy狀態(tài)[11]。Eoxy狀態(tài)下的酶能使單酚底物和二酚底物通過不同途徑氧化成醌類。酶從Emet狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镋oxy狀態(tài)需要一定的時間，因此產(chǎn)生了單酚酶氧化的遲滯效應(yīng)。單酚底物反應(yīng)的遲滯時間主要取決于反應(yīng)溶液中酶和單酚底物的濃度，單酚底物濃度越大遲滯時間越長，酶濃度越大遲滯時間則越短[10]。

以酪氨酸為底物，酪氨酸酶催化反應(yīng)的初始階段速度較小，隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸上升到穩(wěn)定速度。加入不同濃度的對香豆酸后，遲滯時間隨抑制劑濃度的升高而明顯延長，當(dāng)對香豆酸濃度達到1.5 mmol/L時，遲滯時間為對照組的7.5倍，見圖1(a)；以阿魏酸為抑制劑時，遲滯時間也隨抑制劑濃度的增加而增加，但增加幅度比對香豆酸小，當(dāng)阿魏酸濃度提高到10 mmol/L，遲滯時間僅增大到對照組的1.4倍，見圖1(b)；而低聚糖阿魏酸酯則縮短單酚酶的遲滯時間，當(dāng)?shù)途厶前⑽核狨?.5 mmol/L時，遲滯時間變?yōu)閷φ战M的50%，見圖1(c)。

二酚類物質(zhì)能使酶從Emet狀態(tài)轉(zhuǎn)化成Eoxy狀態(tài)，因此二酚類物質(zhì)的積累速度和單酚酶反應(yīng)的遲滯時間有關(guān)。二酚類物質(zhì)主要由Eoxy狀態(tài)的酶氧化單酚底物產(chǎn)生的鄰二醌還原而來[11]。本試驗中，對香豆酸和阿魏酸能延長遲滯時間，可能是它們與底物競爭結(jié)合Eoxy狀態(tài)的酶，而其氧化形成的鄰二醌無法被還原成二酚類物質(zhì)，因此減慢了二酚類物質(zhì)的積累速度；低聚糖阿魏酸酯由于具有還原性的糖配基，會加速鄰醌類還原成二酚類物質(zhì)，從而縮短遲滯時間。

低聚糖阿魏酸酯的濃度用其總阿魏酸的濃度代替；遲滯時間是反應(yīng)曲線直線部分反向延長并交于橫軸的值，如圖中虛線所示

圖1 對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯對酪氨酸酶抑制作用的進程曲線

Figure 1 Time course for the inhibition of monophenolase byp-coumaric acid, ferulic acid, and feruloylated oligosaccharides

2.2 3種物質(zhì)對單酚酶的抑制效果(IC50)

酪氨酸酶能催化單酚化合物和二酚化合物氧化成黑色素，其中測定單酚酶活性時通常用酪氨酸作為底物，而測定二酚酶活性時則用多巴為反應(yīng)底物。

由圖2可知，3種物質(zhì)的濃度與抑制效果都成正相關(guān)，對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯的半抑制濃度(IC50)分別為0.75，9.30，3.20 mmol/L。由此可見，以酪氨酸為底物時，對酪氨酸酶抑制效果最好的為對香豆酸，其次為低聚糖阿魏酸酯和阿魏酸。

阿魏酸在分子結(jié)構(gòu)上比對香豆酸多了一個甲氧基，而阿魏酸對酪氨酸酶催化反應(yīng)的抑制效果不如對香豆酸，說明酚酸苯環(huán)上甲氧基的增加會減弱酚酸對酪氨酸酶的抑制效果。因是甲氧基為供電子基團，使酚羥基上的電子云密度增加，電子不易離去，使得抑制劑較難與酪氨酸酶結(jié)合。低聚糖阿魏酸酯和游離的阿魏酸相比，具有更強的金屬離子螯合力[12]，從而將酶中的銅離子螯合，使酶的活力下降。同時，低聚糖阿魏酸酯中的醛基可與酶活性中心周圍的氨基酸殘基結(jié)合而形成空間位阻，因此具有更強的酪氨酸酶抑制力[13]。

低聚糖阿魏酸酯的濃度用其總阿魏酸的濃度替代圖2 不同濃度的對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯 單酚酶抑制率的影響

Figure 2 Inhibitory effect of different concentration ofp-coumaric acid, ferulic acid and feruloylated oligosaccharides on monophenolase

2.3 3種物質(zhì)對單酚酶的抑制動力學(xué)

對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯對酪氨酸酶單酚酶抑制作用的機理，可以以酪氨酸為底物，通過研究抑制劑對酶催化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的影響來推斷。通過做Lineweaver-burk雙倒數(shù)圖，可推算出酶抑制動力學(xué)的兩個重要參數(shù)：表觀米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)。

圖3為本試驗研究的3種物質(zhì)的Lineweaver-burk雙倒數(shù)圖。當(dāng)加入不同濃度的低聚糖阿魏酸酯和阿魏酸時，隨著抑制劑濃度增大，Km值增大而Vm值下降，可以推斷低聚糖阿魏酸酯和阿魏酸對酪氨酸酶的抑制機理都為混合型抑制，且得到的兩組Lineweaver-burk直線相都交于第二象限說明為競爭—非競爭性混合抑制[14]。對于對香豆酸，直線斜率隨對香豆酸濃度增加而增大，縱截距不變，說明米氏常數(shù)Km值增大而Vm值恒定，表現(xiàn)為競爭性抑制。

酪氨酸酶反應(yīng)活性中心有兩個金屬銅離子，CuA和CuB，酪氨酸會和其中的CuA結(jié)合從而進一步被催化氧化成醌類[15]。由于供試的3種物質(zhì)都具有與酪氨酸相似的結(jié)構(gòu)，由試驗結(jié)果可推測，對香豆酸與游離的酪氨酸競爭性結(jié)合CuA位點；低聚糖阿魏酸酯和阿魏酸與酪氨酸競爭酶的CuA位點或與酶—酪氨酸絡(luò)合物結(jié)合從而抑制產(chǎn)物的形成，另外，低聚糖阿魏酸酯中的糖苷配基的醛基能與酶活性中心周圍的氨基酸殘基結(jié)合，形成席夫堿結(jié)構(gòu)，從而在活性中心周圍形成空間位阻，也阻礙酶和底物結(jié)合[13]。

2.4 3種物質(zhì)對二酚酶的抑制效果(IC50)

圖4顯示了不同濃度的3種物質(zhì)與二酚酶抑制率的關(guān)系。以多巴為底物時，對香豆酸和阿魏酸對二酚酶的抑制率隨抑制劑濃度的增加而增加。對香豆酸和阿魏酸對二酚酶的IC50值分別為4.3，12.7 mmol/L，可見對香豆酸對二酚酶的抑制效率高于阿魏酸。低聚糖阿魏酸酯在DMSO的可溶解范圍內(nèi)對二酚酶基本沒有影響(如圖4中低聚糖阿魏酸酯曲線所示)。

圖3 加入對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯后單酚酶的 Lineweaver-Burk曲線

Figure 3 Lineweaver-Burk plots of monophenolase after the addition ofp-coumaric acid, ferulic acid, feruloylated oligosaccharides

低聚糖阿魏酸酯的濃度用其總阿魏酸的濃度替代，小圖為低聚糖阿魏酸酯曲線的放大圖

圖4 不同濃度的對香豆酸、阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯二酚酶抑制率的影響

Figure 4 Effect of different concentration ofp-coumaric acid, ferulic acid and feruloylated oligosaccharides on the inhibitory rate of diphenolase

3 結(jié)論

對香豆酸對單酚酶和二酚酶都有抑制作用，主要表現(xiàn)在延長單酚酶作用的遲滯時間，降低單酚酶和二酚酶反應(yīng)穩(wěn)態(tài)時的速度；阿魏酸對單酚酶和二酚酶都有抑制作用，但抑制效果不如對香豆酸，說明酚酸苯環(huán)上甲氧基的增加會減弱酚酸對酪氨酸酶的抑制效果；低聚糖阿魏酸酯會縮短單酚酶的遲滯時間，阿魏酸總濃度相同時，低聚糖阿魏酸酯對單酚酶穩(wěn)態(tài)速度的抑制效果高于游離態(tài)的阿魏酸，但低聚糖阿魏酸酯對二酚酶的活力沒有影響。對香豆酸對單酚酶的抑制機理為競爭性抑制，阿魏酸和低聚糖阿魏酸酯屬于混合型抑制。

考慮到低聚糖阿魏酸酯是從玉米皮中提取的天然化合物，成本低，具有抗氧化、抗糖基化等其他功效[16]，可以添加于美容或保健產(chǎn)品中，提升其保健價值。

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The inhibitory effect on tyrosinase from p-coumaric acid, ferulic acid and feruloylated oligosaccharides

YI Jing-jing

OUShi-yi

DONGYing-yan

CHENQiu-ming

(DepartmentofFoodScienceandEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China)

This study investigated the inhibitory effects ofp-coumaric acid, ferulic acid and feruloylated oligosaccharides on catalytic activities of tyrosinase by analysising tyrosinase steady state activity and enzyme kinetics. The results showed that the three compounds were found to efficiently inhibit tyrosinase monophenolase activities. Thep-Coumaric acid was the strongest inhibitor followed by feruloylated oligosaccharides and ferulic acid, with theIC50value of 0.75, 3.20, 9.30 mmol/L respectively. Moreover,p-coumaric acid and ferulic acid were found to inhibit the activities of diphenolase withIC50value of 4.3, 12.7 mmol/L respectively; however, feruloylated oligosaccharides showed no inhibitory effect on diphenolase activity.p-Coumaric acid increased the lag time of monophenolase activity, but ferulic acid showed little effect; while feruloylated oligosaccharides reduced the lag time of monophenolase activity. Enzyme kinetics analysis indicated thatp-coumaric acid is a competitive inhibitor of the monophenolase, while ferulic acid and feruloylated oligosaccharides showed a mixed inhibitory effect.

p-coumaric acid; ferulic acid; feruloylated oligosaccharides; tyrosinase

國家自然科學(xué)基金(編號：31371745)

易晶晶，女，暨南大學(xué)在讀碩士研究生。

歐仕益(1963-)，男，暨南大學(xué)教授，博士。 E-mail: tosy@jnu.edu.cn

2016-08-10

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.002