鄭 璇

黃 瑾1

林 潔1,2

李 菊1,2

韋曉群1,2

蔡 純1

陳燕芬1,2

馮婕莉1,2

郭慶園1,2

(1. 廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2. 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

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氣相色譜—質譜法測定奶粉中香蘭素含量的方法建立

鄭 璇1

黃 瑾1

林 潔1,2

李 菊1,2

韋曉群1,2

蔡 純1

陳燕芬1,2

馮婕莉1,2

郭慶園1,2

(1. 廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623；2. 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

建立了自動頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜測定奶粉中香蘭素和乙基香蘭素的方法，并考察了萃取柱、吸附溫度和時間、解吸附溫度和時間等因素對方法回收率、精密度的影響。結果表明，該方法檢測低限為0.5 mg/kg，樣品加標回收率為90.0%～100%，平均相對標準偏差為1.9%～4.1%(n=6)。該法可消除奶粉中復雜基質的干擾，樣品預處理簡便快速、靈敏度高、準確可靠，適用于奶粉中香蘭素和乙基香蘭素的快速測定。

香蘭素；乙基香蘭素；奶粉；氣相色譜—質譜；

香蘭素是食品行業(yè)重要的香精香料添加劑，主要包括香蘭素(3-甲氧基-4-羥基苯甲醛)和乙基香蘭素(3-乙氧基-4-羥基苯甲醛)，因其具有香莢蘭香氣以及濃烈的奶香味，廣泛用作食品增香劑。GB 2760—2014規(guī)定了“較大嬰兒和幼兒配方食品中可以使用香蘭素、乙基香蘭素和香莢蘭豆浸膏，最大使用量分別為5，5 mg/100 mL和按照生產需要適量使用，其中100 mL以即食食品計，生產企業(yè)應按照沖調比例折算成配方食品中的使用量；嬰兒谷類輔助食品中可以使用香蘭素，最大使用量為7 mg/100 g，其中100 g以即食食品計，生產企業(yè)應按照沖調比例折算成谷類食品中的使用量；凡使用范圍涵蓋0至6個月嬰幼兒配方食品不得添加任何食品用香料”。自2016年4月6日起，歐亞經濟委員會決定禁止在兒童食品中使用乙基香蘭素[1]。因此需要建立相關檢測方法對奶粉中的香蘭素進行檢測。

目前，國內外測定香蘭素的方法主要有伏安法[2]、毛細管電泳法[3]、分光光度法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、液相色譜—質譜聯用法[8]、氣相色譜法[9-10]、氣相色譜—質譜法[11-12]等。但上述方法存在需要使用大量的有機溶劑進行提取，步驟繁瑣，回收率低，精密度低等缺點。頂空固相微萃取法可專一性收集樣品中的易揮發(fā)性成分，既可避免在除去溶劑時引起揮發(fā)物的損失，又可降低共提物引起的噪音，常被應用于揮發(fā)性成分的指紋圖譜檢測[13-14]，少見于定量檢測。本研究擬采用頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜法定量測定奶粉中的香蘭素和乙基香蘭素，解決香蘭素提取難和回收率低的問題，探索頂空固相微萃取法在定量檢測香蘭素中的適用性，具有廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

氣相色譜—質譜聯用儀(帶EI源，配CTC三合一自動進樣器)：Agilent7890A-5975C型，美國Agilent科技公司；

渦旋混合器：MS3 basic型，德國IKA集團；

固相微萃取裝置：包括100 μm聚二甲基硅烷涂層纖維(PDMS)，30 μm聚二甲基硅烷涂層纖維(PDMS)，7 μm 聚二甲基硅烷涂層纖維(PDMS)，65 μm聚二甲基硅烷/二乙烯苯涂層纖維(PDMS/DVB)，85 μm聚丙烯酸酯涂層纖維(PA)以及85 μm碳分子篩/聚二甲基硅烷涂層纖維(CAR/PDMS)，30 μm二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅烷涂層纖維(DVB /CAR/PDMS) ，美國SUPLECO公司。

1.1.2 試劑

氯化鈉：分析純，廣州化學試劑廠，400 ℃烘烤2 h，在干燥器內冷卻至室溫備用；

乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；

香蘭素標準品，純度 ≥99%，法國Extrasynthese公司；

乙基香蘭素標準品：純度≥99.0%，法國Extrasynthese公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配置

(1) 香蘭素、乙基香蘭素標準儲備溶液(500 mg/L)：準確稱取0.050 g標準品，分別用乙醇溶解并定容至100 mL。

(2) 香蘭素、乙基香蘭素中間混合液(50 mg/L)：分別準確移取10 mL香蘭素、乙基香蘭素標準儲備溶液乙腈定容至100 mL。

(3) 香蘭素、乙基香蘭素標準工作液：根據需要用空白樣品基質稀釋。

1.2.2 基質標準曲線配制 用空白基質奶粉逐級稀釋混合標準中間液，配制成一系列的基質混合標準工作溶液，現配現用。按儀器工作條件測定后，以質量濃度對相應的峰面積繪制基質標準曲線。

1.2.3 樣品測定 稱取1.0 g奶粉(精確到0.001 g)于20 mL頂空瓶中，加入2 g氯化鈉，加入5 mL去離子水。渦旋3 min混勻樣品，待分析。如果檢測結果超出檢測范圍，可通過增加或者減少奶粉用量使之落在檢測范圍之內。

1.2.4 固相微萃取條件

(1) 吸附時間試驗：固定參數為振蕩器溫度80 ℃，轉速2 000 r/min，平衡50 min，進樣口溫度280 ℃，脫附5 min，萃取柱位65 μm PDMS/DVB萃取柱；變量為吸附時間，分別設為20，30，40，50 min，評價指標為總離子色譜圖中的響應面積。

(2) 脫附時間試驗：固定參數為振蕩器溫度80 ℃，轉速2 000 r/min，平衡50 min，萃取柱為65 μm PDMS/DVB，吸附50 min，進樣口溫度280 ℃；變量為脫附時間，分別設為2，3，4，5，6 min，評價指標為總離子色譜圖中的響應面積。

(3) 吸附溫度試驗：固定參數為平衡時間50 min，萃取柱為65 μm PDMS/DVB，吸附時間50 min，進樣口溫度280 ℃，解吸時間5 min，轉速2 000 r/min；變量為振蕩器溫度，分別設為40，50，60，70，80，90 ℃，評價指標為總離子色譜圖中的響應面積。

(4) 脫附溫度試驗：固定參數為振蕩器溫度80 ℃，轉速2 000 r/min，平衡50 min，萃取柱為65 μm PDMS/DVB，吸附50 min，分別解吸時間5 min；變量為進樣口溫度分別設為230，240，250，260，270，280 ℃，評價指標為總離子色譜圖中的響應面積。

1.2.5 色譜質譜條件 色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；色譜柱溫度：初溫80 ℃，停留2 min，以15 ℃/min升至280 ℃，停留2 min；進樣口溫度：60 ℃；接口溫度：275 ℃；載氣：氦氣，純度大于99.999%，線速度35 cm/s；進樣量：1 μL，不分流進樣；電離模式：EI；選擇離子：m/z152，151，123，109，81(香蘭素)，m/z166，137，109，81(乙基香蘭素)；定量離子：m/z151(香蘭素)，m/z166(乙基香蘭素)；溶劑延遲：5 min。

2 結果與討論

2.1 香蘭素在GC—MS上的分離與響應

香蘭素在GC—MS上有較好的分離響應。在該試驗條件下，香蘭素和乙基香蘭素有較好的分離度，如圖1所示，香蘭素的氣相色譜保留時間為7.613 min，特征離子的質核比分別為151.0，81.0，109.0，123.0，其中以151.0的豐度比最大，因而選擇其為定量離子。乙基香蘭素的氣相色譜保留時間為8.129 min，特征離子的質核比分別為137.0，166.0，109.0，其中137.0的豐度比最大，因而選擇其為定量離子。

圖1 香蘭素和乙基香蘭素的色譜質譜圖Figure 1 Mass spectra and Chromatogram of vanillin and ethyl vanillin

2.2 影響因素

2.2.1 萃取纖維類型的影響 根據相似相溶原理, 非極性纖維涂層對非極性化合物具有較高的萃取效率，而極性纖維涂層對極性化合物具有較高的萃取效率。試驗在70 ℃、振蕩器轉速500 r/min、平衡10 min、頂空固相微萃取20 min 的條件下，考察了7種不同類型的萃取纖維分別對基質標準混合液的萃取效果，結果見圖2。從萃取出的香蘭素和乙基香蘭素的量(以峰面積表示)色譜峰分離度及峰形3個方面比較7種萃取纖維的萃取能力。結果表明：7種纖維萃取材料得到目標成分的峰都能基線分離；85 μm PA、85 μm DVB/CAR/PDMS和100 μm PDMS萃取頭的萃取能力較差；30 μm PDMS、85 μm CAR/PDMS和7 μm PDMS對待測化合物的吸附能力有較大的提高，而65 μm PDMS/DVB的萃取能力最強。香蘭素含酚羥基、羰基、苯環(huán)以及醚基，聚硅氧烷萃取頭(PDMS)適用于非極性化合物的萃取，而且粒徑越小萃取能力越大，因而針對香蘭素的萃取能力是7 μm PDMS>30 μm PDMS>100 μm PDMS；碳分子篩萃取頭(CAR)一般針對痕量物質如VOC，而乳品中的揮發(fā)成分包括相對較多，在吸附過程中容易出現拖尾、過飽和情況；聚二乙烯基苯萃取頭(DVB)對極性揮發(fā)物有較強的吸附，因而PDMS/DVB萃取頭對香蘭素具有較強的吸附。故試驗選擇65 μm PDMS/DVB作為固相微萃取柱。

圖2 不同固相微萃取柱對香蘭素和乙基香蘭素的萃取效果Figure 2 Extraction efficiency of different fiber

2.2.2 吸附時間和脫附時間的影響 固相微萃取柱達到吸附平衡需要一定的時間。試驗采用65 μm PDMS/DVB萃取柱并在70 ℃下進行吸附，然后在260 ℃的溫度下脫附5.5 min后檢測，考察吸附時間，結果發(fā)現當在70 ℃進行吸附時，香蘭素和乙基香蘭素的色譜峰隨著吸附時間的延長而增大，并且在40 min后達到平衡(見圖3)。故選擇45 min作為優(yōu)化的平衡時間。

同樣的被吸附到萃取柱上的目標化合物需要一定的時長才能完全釋放出來。通過試驗發(fā)現(圖4)，隨著脫附時間的延長，目標化合物的峰面積增加，在5 min后基本不在變化,考慮到高溫會縮短萃取纖維的使用壽命，故選取5.5 min作為解吸時間。

圖3 香蘭素和乙基香蘭素色譜峰面積隨吸附時間變化

Figure 3 The change of adsorption time on vanillin and ethyl vanillin chromatographic peak area

圖4 香蘭素和乙基香蘭素色譜峰面積隨脫附時間變化

Figure 4 The change of desorption time on vanillin and ethyl vanillin chromatographic peak area

2.2.3 吸附和脫附溫度的影響 萃取溫度對萃取時間和萃取容量都有重要影響。通過試驗發(fā)現，在高溫條件下應用65 μm PDMS/DVB在40 min內萃取奶粉中香蘭素，有利于目標化合物從基質中萃取出來，但同時也會降低萃取纖維的分配系數和萃取效率。由圖5可知，萃取溫度為80 ℃時，香蘭素和乙基香蘭素的峰面積達到最大值。

PDMS/DVB萃取纖維的最高使用溫度為270 ℃，由圖6可知，當解吸溫度為260 ℃時，香蘭素和乙基香蘭素的響應峰面積達到最大。因此，選取260 ℃作為解吸溫度。

2.3 方法線性范圍和回收率

在上述試驗條件下，以基線3倍噪聲值計算結果作為該方法檢測低限。該方法稀釋倍數為5倍，檢測低限為0.5 mg/kg；香蘭素和乙基香蘭素在0.5～30.0 mg/kg內有良好的線性，香蘭素的線性方程為：y=609.8x+168.2，r2=0.999 2，乙基香蘭素線性方程為y=1 010.1x+102.8，r2=0.999 1。當實際樣品中香蘭素和乙基香蘭素的限量超過方法的線性范圍時，可以減少稱樣量至0.1 g，使檢測結果在線性范圍之內。

圖5 香蘭素和乙基香蘭素色譜峰面積隨吸附溫度變化

Figure 5 The change of adsorption temperature on vanillin and ethyl vanillin chromatographic peak area

圖6 香蘭素和乙基香蘭素色譜峰面積隨脫附時間變化

Figure 6 The change of desorption temperature on vanillin and ethyl vanillin chromatographic peak area

應用實際奶粉樣品作為基質，進行3水平6平行添加回收試驗。稱取空白樣品6份，每份1 g，分別添加香蘭素以及乙基香蘭素標準品0.2，0.4，1.0 mg/kg，按1.2.2處理后，進行測定，結果發(fā)現樣品中香蘭素的加標回收率為90.0%～99.0%，平均相對標準偏差(RSD)為2.3%～4.1%(n=6)，乙基香蘭素的加標回收率為97.5%～100%，平均相對標準偏差(RSD)為1.9%～4.0%(n=6)。

2.4 樣品測定

用所建立的方法測定市售奶粉中香蘭素和乙基香蘭素含量。結果表明(見表1)，其中0～6月嬰兒奶粉部分檢出香蘭素或者乙基香蘭素(合計)，最大值為1.5 mg/kg，違反GB 2760—2014標準中不得檢出的要求；6月以上嬰幼兒奶粉最大值為75.0 mg/kg，超過限量值；較大嬰兒喝幼兒配方食品最大值為200.0 mg/kg，未超出限量值。

表1 實際樣品測定結果Table 1 The results of milk powder sample

3 結論

建立了奶粉中香蘭素和乙基香蘭素的頂空固相微萃取—氣相色譜—質譜測定方法。該方法只需經過簡單的前處理步驟，極大消除了奶粉中復雜基質對測定結果的干擾，樣品的香蘭素和乙基香蘭素加標回收率范圍為90.0%～100%，平均相對標準偏差為1.9%～4.1%(n=6)，檢測低限均為0.5 mg/kg。香蘭素和乙基香蘭素在0.5～30.0 mg/kg濃度范圍內有良好的線性，標準曲線相關系數分別為0.999 2和0.999 1。該方法具有分析效率高、操作方便、線性范圍寬、檢出限低、選擇性好、干擾少、精密度和準確度好等優(yōu)點，適用于奶粉中香蘭素和乙基香蘭素的快速測定。本方法受限于頂空瓶的體積以及固相微萃取頭的吸附容量，檢測范圍受到一定的限制，此外本方法僅適用于外源性、游離態(tài)的有機揮發(fā)物。頂空固相微萃取技術還可以連接到GC—FID、GC—MS/MS等多種儀器上，獲得更大的應用。

[1] 駐哈薩克經商參處. 歐亞經濟聯盟國家禁止生產添加香蘭素的兒童食品[EB/OL]. (2016-04-08)[2016-06-02]. http://kz.mofcom.gov.cn/article/ddfg/intruduce/201604/20160401292678.shtml.

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Determination of vanillin and ethyl-vanillin in milk powder by gas chromatography-mass spectrometry

ZHENG Xuan1

HUANGJin1

LINJie1,2

LIJu1,2

WEIXiao-qun1,2

CAIChun1

CHENYan-fen1,2

FENGJie-li1,2

GUOQing-yuan1,2

(1.GuangdongInspectionandQuarantineTechnologyCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China; 2.GuangdongKeyLaboratoryofImportandExportTechnicalMeasuresofAnimal,PlantandFood,Guangzhou,Guangdong510623,China)

A method for determination of vanillin and ethyl-vanillin in milk powder was established by auto headspace solid-phase micro-extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC—MS), and the influence factor were also studied, such as solid phase micro-extraction head, time and temperature of adsorption and desorption. As a result, the limits of determination (LOD) of vanillin and ethyl-vanillin were 0.5 mg/kg. The spiked recovery was between 90.0% and 100%, and the RSD ranged from 1.9%～4.1%(n=6). This method could eliminate the interference of complicated matrix, conveniently, quickly and exactly, which was applicable for quick determination of vanillin and ethyl-vanillin content in milk powder.

vanillin; ethyl-vanillin; milk powder; GC—MS

國家質檢總局科技項目(編號：2015IK065)

鄭璇，女，廣東出入境檢驗檢疫局工程師，碩士。

韋曉群(1979-)，男，廣東出入境檢驗檢疫局高級工程師，博士。E-mail: weixq@iqtc.cn

2016-08-25

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.008