宋 萍相法偉李 敏王麗華左小磊

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800）

2（濰坊市人民醫(yī)院 濰坊 261000）

基于DNA納米結(jié)構(gòu)的別構(gòu)效應(yīng)綜述

宋 萍1相法偉2李 敏1王麗華1左小磊1

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800）

2（濰坊市人民醫(yī)院 濰坊 261000）

綜述了DNA別構(gòu)效應(yīng)的模型以及影響DNA別構(gòu)效應(yīng)的pH值、DNA序列、離子以及輻射等相關(guān)因素，并對(duì)DNA別構(gòu)效應(yīng)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用做出了展望和總結(jié)。

別構(gòu)效應(yīng)，Hill系數(shù)，動(dòng)態(tài)范圍，綜述

對(duì)于生物體系來(lái)講，能夠靈敏感知小分子進(jìn)入帶來(lái)的微小變化是非常重要的一種能力，這種能力可以使生物體有效感知小分子的加入并做出復(fù)雜信號(hào)輸出[1-2]。有效控制自然界物質(zhì)結(jié)合曲線的形狀和中位點(diǎn)，對(duì)于優(yōu)化微循環(huán)過(guò)程有著非常重要的意義。而生物界調(diào)節(jié)物質(zhì)結(jié)合能力的一個(gè)關(guān)鍵因素就是別構(gòu)效應(yīng)，它可以有效調(diào)節(jié)配體和受體的結(jié)合能力。別構(gòu)最初是出現(xiàn)在酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)中，酶分子的非催化部分與某些化合物可逆的非共價(jià)結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而改變酶的活性狀態(tài)[3-10]。環(huán)境中輻射也會(huì)對(duì)酶的構(gòu)象造成改變，從而影響酶的活性[11-13]。

別構(gòu)調(diào)節(jié)普遍存在于生物界，許多代謝途徑關(guān)鍵酶利用別構(gòu)調(diào)節(jié)來(lái)控制代謝途徑之間平衡[14-16]。當(dāng)結(jié)合一分子底物后，酶的構(gòu)象發(fā)生改變，這種變化可以增進(jìn)后續(xù)分子和酶的親和力，促進(jìn)后續(xù)分子和酶結(jié)合，表現(xiàn)為正協(xié)同性，這種酶稱為具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶；反之，則稱為具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶；也有的酶同時(shí)具有正、負(fù)調(diào)節(jié)物[17]。一般來(lái)說(shuō)，大部分的別構(gòu)酶的初速度和底物濃度關(guān)系不符合經(jīng)典的米氏方程，而是呈S形曲線，這種S曲線反映了酶的特殊動(dòng)力學(xué)過(guò)程。而關(guān)于DNA別構(gòu)效應(yīng)研究早在1979年耶魯大學(xué)的Hogan等[18]就有報(bào)道，配體和DNA的結(jié)合可以導(dǎo)致DNA遺傳信息發(fā)生改變，結(jié)合遠(yuǎn)霉素可以導(dǎo)致小牛胸腺DNA表現(xiàn)出對(duì)藥物更好的親和力和更好的結(jié)構(gòu)選擇性，而對(duì)于結(jié)合能力比較弱的大腸桿菌 DNA基本沒(méi)有影響。mRNAs也被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)結(jié)合其他的代謝產(chǎn)物從而導(dǎo)致其構(gòu)象的改變[19-21]，別構(gòu)的核酸酶也可以通過(guò)體外加入一段適配體序列從而改變其結(jié)構(gòu)[22-27]。

本文綜述了基于DNA納米結(jié)構(gòu)的別構(gòu)效應(yīng)，包括基于DNA納米結(jié)構(gòu)別構(gòu)效應(yīng)的基本模型及計(jì)算過(guò)程，以及基于不同響應(yīng)因子分類的別構(gòu)效應(yīng)，包括pH值、調(diào)節(jié)物和離子作用。

1 DNA別構(gòu)效應(yīng)的模型及相關(guān)計(jì)算

當(dāng)DNA納米結(jié)構(gòu)只有一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，其結(jié)合曲線符合米氏方程，它的協(xié)同指數(shù)又稱飽和比值(Rs)是81倍（結(jié)合位點(diǎn)被底物飽和90%和10%對(duì)應(yīng)濃度的比值），符合Langmuir等溫吸附模型[1]。而對(duì)于具有兩個(gè)及以上結(jié)合位點(diǎn)的DNA納米結(jié)構(gòu)，根據(jù)其第一個(gè)分子結(jié)合后，是否有利于促進(jìn)下一個(gè)分子結(jié)合或者抑制分為正協(xié)同效應(yīng)和負(fù)協(xié)同效應(yīng)。對(duì)于正協(xié)同來(lái)講，Rs<81，并且Rs越小，正協(xié)同效應(yīng)越明顯。對(duì)于負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶來(lái)講，Rs>81，并且Rs越大，負(fù)協(xié)同效應(yīng)越明顯[3]。在研究別構(gòu)效應(yīng)中經(jīng)常使用Hill系數(shù)(nH)來(lái)表征正負(fù)協(xié)同效應(yīng)，符合米氏方程，nH=11；表現(xiàn)為正協(xié)同作用，nH>1；表現(xiàn)為負(fù)協(xié)同作用，nH<1。這類計(jì)算中經(jīng)常采用如下的公式進(jìn)行運(yùn)算[28-29]。

式中：C90為達(dá)到最大信號(hào)值 90%所對(duì)應(yīng)的底物濃度；C10為最大信號(hào)值 10%所對(duì)應(yīng)的底物濃度；Ks指什么是達(dá)到平衡時(shí)的平衡常數(shù)；RG指得是檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍[30-31]，也是檢測(cè)的有效范圍；KD1和KD2分別指當(dāng)DNA納米結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，第一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合時(shí)的平衡常數(shù)和第一個(gè)位點(diǎn)被配體結(jié)合之后第二個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的平衡常數(shù)。

DNA納米結(jié)構(gòu)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，當(dāng)作用的配體是同一種類型時(shí)稱為同型的別構(gòu)調(diào)節(jié)，當(dāng)作用的配體不是同種時(shí)則稱為異型的別構(gòu)調(diào)節(jié)[32]。同型別構(gòu)和異性別構(gòu)計(jì)算方法也是不一樣的。

式中：Occupancy代表百分?jǐn)?shù)，[Target] 為檢測(cè)靶標(biāo)分子的濃度，Khalf為達(dá)到飽和值一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的底物濃度，[complex]為雜交 target（檢測(cè)靶標(biāo)分子）和reporter（和靶標(biāo)特異結(jié)合的分子）之后的產(chǎn)物，[free receptor]為未雜交target的reporter濃度。

自然界經(jīng)常通過(guò)別構(gòu)來(lái)控制配體響應(yīng)曲線[33]，如圖1所示。在異相別構(gòu)中，一個(gè)配體結(jié)合會(huì)影響第二個(gè)配體結(jié)合，但是這種影響并不會(huì)使響應(yīng)曲線的形狀發(fā)生改變，只是導(dǎo)致了響應(yīng)曲線的左右平移。而對(duì)于同型的別構(gòu)來(lái)講，一個(gè)靶標(biāo)配體的結(jié)合將會(huì)影響第二個(gè)靶標(biāo)配體的結(jié)合能力，這將直接導(dǎo)致結(jié)合曲線的形狀發(fā)生改變。同型的別構(gòu)將會(huì)使配體響應(yīng)更靈敏或者更不靈敏。

2 不同調(diào)節(jié)因素對(duì)DNA別構(gòu)效應(yīng)的影響

2.1 pH值對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)別構(gòu)效應(yīng)的影響

DNA納米結(jié)構(gòu)對(duì)很多的刺激因子有所響應(yīng)，這跟DNA堿基本來(lái)的性質(zhì)有關(guān)。比如，富含C堿基的 DNA可靈敏地影響溶液中氫離子的變化[34-36]，復(fù)合T堿基的DNA序列可靈敏地感知溶液中的汞離子[37-42]，富含G堿基的DNA序列可靈敏感知溶液中的鉀離子[43-48]。刺激因子的改變可導(dǎo)致 DNA的納米結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其生物學(xué)性質(zhì)和離子再結(jié)合的能力。

如圖2所示，pH值響應(yīng)的DNA三鏈納米結(jié)構(gòu)是由堿基互補(bǔ)配對(duì)的對(duì)pH值不敏感的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和通過(guò)氫鍵形成的對(duì)pH敏感的發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成。胞嘧啶上的N3需要質(zhì)子化，所以CGC結(jié)構(gòu)只有在酸性條件下才能夠穩(wěn)定存在。而只含有T?A?T結(jié)構(gòu)的三鏈只有在更高的pH值下才能穩(wěn)定存在。

Nesterova 等[49]利用對(duì)pH值敏感的i-motif結(jié)構(gòu)構(gòu)建了可對(duì)不同pH值都具有比較好響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。i-motif結(jié)構(gòu)是含有大量胞嘧啶的納米結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以對(duì)pH值具有敏感性響應(yīng)。作者主要通過(guò)將i-motif結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)并在Motif結(jié)構(gòu)的不同位置修飾一段DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為別構(gòu)調(diào)節(jié)的元素，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引入可有效控制Motif結(jié)構(gòu)對(duì)pH 值的敏感程度，從而實(shí)現(xiàn)利用別構(gòu)作用將響應(yīng)區(qū)間控制在0.1個(gè)pH值范圍，最大調(diào)節(jié)范圍在0.2個(gè)pH值區(qū)間。

Idili 等[50]在之前DNA三鏈結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，通過(guò)三鏈的末端標(biāo)記亞甲基藍(lán)實(shí)現(xiàn)用電化學(xué)方法對(duì)特異性的靶標(biāo)DNA序列進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，作者研究了不同的pH值對(duì)DNA構(gòu)象的影響，從而有效地調(diào)節(jié)檢測(cè)有限范圍。

Fu等[51]利用團(tuán)聚淬滅效應(yīng)構(gòu)建了一種基于i-motif結(jié)構(gòu)的免標(biāo)記的傳感器用來(lái)感知pH值的變化。DNA單鏈由于靜電吸附作用可以促進(jìn)熒光復(fù)合物的團(tuán)聚，熒光物質(zhì)的團(tuán)聚導(dǎo)致熒光的淬滅。當(dāng)在酸性條件下，i-motif基團(tuán)折疊，導(dǎo)致團(tuán)聚的熒光基團(tuán)分散，熒光恢復(fù)，就可以使用熒光分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)pH值的變化，同樣是利用DNA構(gòu)象改變來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)pH值的敏感感知。

2.2DNA序列對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)別構(gòu)效應(yīng)的影響

Simon等[32]構(gòu)建了一系列DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，通過(guò)調(diào)節(jié)靶序列DNA和頸環(huán)不同位置的雜交，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列DNA檢測(cè)響應(yīng)范圍的變化，如圖3所示。首先，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)頸環(huán)結(jié)構(gòu)，在頸環(huán)的莖上的兩條DNA末端標(biāo)記熒光分子和淬滅分子，當(dāng)靶序列DNA可以和頸環(huán)的Loop序列完全雜交時(shí)，頸環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，就可以檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖3(a)）。

另外，作者也在頸環(huán)的 Stem序列的末端延伸出一段DNA序列，這樣就構(gòu)建了兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的頸環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3(b)），或者直接在頸環(huán)的Loop序列再延伸一段可以和DNA靶序列雜交的DNA片段，同樣構(gòu)建了頸環(huán)結(jié)構(gòu)可以和靶序列DNA結(jié)合的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖3(c)）。通過(guò)研究，作者發(fā)現(xiàn)靶序列和第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合有利于第二個(gè)靶DNA和第二個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了正向協(xié)同作用。

Porchetta 等[52]將可卡因的適配體進(jìn)行改造，在適配體末端加堿基序列或者縮短非活性中心的堿基序列，可以使適配體和可卡因的結(jié)合能力發(fā)生改變。適配體在和可卡因結(jié)合的時(shí)候先經(jīng)過(guò)一個(gè)從無(wú)序DNA到有序的適配體結(jié)構(gòu)過(guò)程，作者加入一段可以和適配體結(jié)合的序列，當(dāng)有可卡因存在時(shí)，可卡因競(jìng)爭(zhēng)掉適配體上DNA序列，再和適配體進(jìn)行結(jié)合。

Vallée-Bélisle 等[53]設(shè)計(jì)了一系列頸環(huán)結(jié)構(gòu)，通過(guò)改變Stem上GC堿基含量的不同，調(diào)節(jié)靶序列DNA和頸環(huán)結(jié)合的能力，從而調(diào)控檢測(cè)的靈敏范圍。作者加入一段和靶序列DNA類似的DNA作為競(jìng)爭(zhēng)鏈，競(jìng)爭(zhēng)鏈的加入使得靶序列結(jié)合變?nèi)?，檢測(cè)曲線向右平移，檢測(cè)變得更加不靈敏，這樣操作更有利于精準(zhǔn)檢測(cè)高濃度的靶序列。

Idili 等[54]設(shè)計(jì)了DNA三鏈的鉗子結(jié)構(gòu)，當(dāng)靶序列DNA遇到DNA鉗子結(jié)構(gòu)時(shí)，可以首先和DNA序列的一段以堿基互補(bǔ)配對(duì)方式結(jié)合，另一端就會(huì)折回和靶序列以氫鍵形式作用，這樣就形成了DNA三鏈的鉗子結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證明，DNA鉗子結(jié)構(gòu)比單鏈DNA和靶序列具有更好的親和力，并且鉗子結(jié)構(gòu)可以用來(lái)很好地區(qū)分單堿基錯(cuò)配，單堿基錯(cuò)配的序列和DNA鉗子的結(jié)合力明顯比完全互補(bǔ)要強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了特異性區(qū)分單堿基錯(cuò)配。

2.3 離子對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)別構(gòu)效應(yīng)的影響

Alessandro等[37]利用 DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一種對(duì)重金屬離子敏感影響的傳感器。首先作者設(shè)計(jì)了一個(gè)頸環(huán)結(jié)構(gòu)，在頸環(huán)的 Loop序列兩端標(biāo)記了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，然后在 Stem段延伸一段可以和頸環(huán)的Loop序列完全互補(bǔ)雜交的DNA序列，雜交之后的序列富含胸腺嘧啶，可以和重金屬汞離子結(jié)合，用來(lái)檢測(cè)汞離子。并且重新形成的 Stem序列有多個(gè)汞離子結(jié)合位點(diǎn)，使得汞離子的結(jié)合符合正協(xié)同作用。作者也設(shè)計(jì)了類似頸環(huán)結(jié)構(gòu)用來(lái)檢測(cè)銀離子，并且設(shè)計(jì)可以和頸環(huán)的 Stem序列雜交的激活鏈，激活鏈雜交頸環(huán)結(jié)構(gòu)的 Stem序列，有利于頸環(huán)結(jié)構(gòu)的打開(kāi)，重新形成可以和銀離子結(jié)合的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，有利于銀離子的檢測(cè)，使檢測(cè)曲線形狀不變，解離常數(shù)Kd值變小。作者還設(shè)計(jì)了一段可以和 Stem兩端部分互補(bǔ)的序列，這使得頸環(huán)結(jié)構(gòu)的打開(kāi)變的困難，不利于銀離子的檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)曲線的形狀不變，Kd值變大。Kd值的變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同金屬離子檢測(cè)限的要求，可以通過(guò)加入激活鏈或者抑制鏈實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度金屬離子或者高濃度金屬離子的靈敏檢測(cè)。

2.4 輻射對(duì)別構(gòu)效應(yīng)的影響

謝麗華等[55]研究了γ射線照射對(duì)人體外周血血清中血清鐵濃度變化的影響。γ射線照射引起血清中銅藍(lán)蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，這種改變使得蛋白的活性隨劑量的增加而增加，同時(shí)可以導(dǎo)致溶液中的Fe2+變?yōu)镕e3+，進(jìn)而導(dǎo)致溶液中的血清鐵含量升高。作者發(fā)現(xiàn)可以利用血清鐵的含量來(lái)估算γ射線的吸收劑量。輻射引起蛋白別構(gòu)效應(yīng)的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致DNA的構(gòu)象發(fā)生改變，同樣可以利用輻射來(lái)研究DNA的別構(gòu)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)更廣闊的應(yīng)用。低劑量輻射往往難以被檢測(cè)到，但是有文獻(xiàn)報(bào)道輻射可以誘發(fā)DNA雙鏈發(fā)生斷裂[56-58]，因此，可以利用DNA納米結(jié)構(gòu)中雙鏈的斷裂導(dǎo)致的構(gòu)象改變來(lái)設(shè)計(jì)生物計(jì)量計(jì)來(lái)檢測(cè)環(huán)境中微量輻射的存在。

楊晨等[59]研究了具有不同卵巢癌差異表達(dá)基因2 相互作用蛋白(Disabled homolog 2 interaction protein, DAB2IP)的前列腺癌細(xì)胞對(duì)不同射線照射引起的耐受力的不同，射線照射會(huì)引起細(xì)胞中的毛細(xì)血管擴(kuò)張癥基因突變(Ataxia-telangiectasia mutated, ATM)的mRNA升高，總的ATM升高，從而得出ATM可能與DAB2IP表達(dá)抑制引起腫瘤細(xì)胞輻射耐受能力有關(guān)，提示可利用ATM作為靶點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)藥物，利用輻射引起蛋白結(jié)構(gòu)變換，從而導(dǎo)致DNA突變進(jìn)而分析出作用靶點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)靶向藥物治療。

3 小結(jié)與展望

綜述了DNA納米結(jié)構(gòu)別構(gòu)效應(yīng)的研究相關(guān)工作，包括別構(gòu)效應(yīng)的模型和不同模型的相關(guān)計(jì)算，以及不同的刺激因子導(dǎo)致別構(gòu)效應(yīng)發(fā)生改變。別構(gòu)效應(yīng)不僅可以實(shí)現(xiàn)酶的活性改變，也可以成功將這一概念應(yīng)用到DNA納米結(jié)構(gòu)中，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)精準(zhǔn)的可控檢測(cè)。別構(gòu)效應(yīng)可通過(guò)簡(jiǎn)單地加入一個(gè)刺激因子實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性靶標(biāo)分子的精準(zhǔn)檢測(cè)，并能夠可控地調(diào)節(jié)檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍，使得在可檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)變得更加精準(zhǔn)。DNA別構(gòu)效應(yīng)的調(diào)節(jié)也可能被應(yīng)用到輻射防護(hù)以及輻射調(diào)控領(lǐng)域，通過(guò)輻照來(lái)調(diào)控不同構(gòu)象的改變從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)。

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Review of dynamic allosteric control based on DNA nanostructure

SONG Ping1XIANG Fawei2LI Min1WANG Lihua1ZUO Xiaolei1
1(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)
2(Weifang people’s Hospital, Weifang 261000, China)

We summary the models of DNA allosteric control and possible effects (pH value, DNA effector, ion, radio) of DNA dynamic allosteric. And a bio-medical possible application of DNA allosteric is proposed.

Allosteric, Hill coefficient, Dynamic range, Review

SONG Ping (female) was born in December 1986, and received her master degree from Shanghai Normal University in 2010. Now she is a doctor candidate in Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of sciences

Ph.D. ZUO Xiaolei, professor, E-mail: zuoxiaolei@sinap.ac.cn

O644.22

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.060102

CLCO644.22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21422508)資助

宋萍，女，1986年12月出生，2010年于上海師范大學(xué)獲得碩士學(xué)位，現(xiàn)為中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所在讀博士研究生

左小磊，博士，研究員， E-mail: zuoxiaolei@sinap.ac.cn

初稿2016-03-23；修回2016-04-19

Supported by the National Natural Science Foundation of China (21422508)

Received 23 March 2016; accepted 19 April 2016