裴仁治， 吳靜怡， 張丕勝， 劉旭輝， 杜小紅， 陳 冬， 沙科婭， 李雙月， 曹俊杰， 陳列光， 莊賢栩， 葉佩佩， 范 崢， 林 麗， 唐善浩， 張碧波， 史曉薇

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州人民醫(yī)院血液科，浙江 寧波 315000)

急性早幼粒細(xì)胞患者治療前后循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的變化及其影響因素的分析*

裴仁治， 吳靜怡△， 張丕勝， 劉旭輝， 杜小紅， 陳 冬， 沙科婭， 李雙月， 曹俊杰， 陳列光， 莊賢栩， 葉佩佩， 范 崢， 林 麗， 唐善浩， 張碧波， 史曉薇

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄞州人民醫(yī)院血液科，浙江 寧波 315000)

目的： 探討急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)患者治療前后循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cells，CECs)數(shù)量、表面抗原及生物學(xué)特性的變化，并分析其與臨床指標(biāo)的關(guān)系。方法:免疫磁珠結(jié)合三色流式細(xì)胞儀分選計(jì)數(shù)APL患者初診及治療后CECs的數(shù)量；免疫熒光染色檢測(cè)APL患者初診及治療后CECs表面CD146、CD31、CD144、VEGFR-2、CD45及CD133的表達(dá)水平。體外培養(yǎng)CECs進(jìn)行血管生成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞集落形成率的測(cè)定。結(jié)果:APL患者 CECs在外周血白細(xì)胞>10×109/L及CD34陽(yáng)性患者中數(shù)量明顯增多(P<0．05)，高危、低危及中危3組患者的CECs數(shù)量也呈現(xiàn)明顯的差異(P<0．05)。32例APL患者誘導(dǎo)化療后均獲得完全緩解，治療后CECs數(shù)量及其表面CD133表達(dá)水平均明顯下降(P<0．05)。同時(shí)治療后APL患者CECs體外形成血管數(shù)目及細(xì)胞的集落形成率均明顯減少(P<0．05)。APL患者CECs數(shù)量治療后/治療前的比值與As2O3治療1周后的尿砷濃度呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)性(P<0．05)。結(jié)論:精確計(jì)數(shù)并深入了解CECs生物學(xué)特性可能有助于評(píng)價(jià)APL的預(yù)后及設(shè)計(jì)治療策略。

急性早幼粒細(xì)胞白血病； 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞； 尿砷濃度

近年來(lái)多項(xiàng)研究顯示腫瘤循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cells，CECs)數(shù)量明顯增多，在腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用[1]。而血液惡性腫瘤中這種聯(lián)系則更為緊密[2]。國(guó)外學(xué)者在急性髓系白血病和慢性髓系白血病患者中均觀察到CECs數(shù)量增多且與疾病進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)的現(xiàn)象[3-4]。維甲酸及As2O3治療白血病的機(jī)制也包括對(duì)血管生成的抑制[5-6]，本研究旨在分離并精確計(jì)數(shù)急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)患者的CECs，對(duì)比治療前后CECs數(shù)量、表面抗原及生物學(xué)特性的變化，分析其與臨床指標(biāo)的關(guān)系，探究CECs在腫瘤侵襲發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 病例選擇

收集2012年7月～2015年12月來(lái)我院初診的APL患者32例， 男性18 例， 女性14例， 年齡 16～62歲，診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)均符合張之南等主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。所有患者根據(jù)臨床特征及骨髓形態(tài)學(xué)特點(diǎn)高度提示APL時(shí)，立即予維甲酸25 mg/d(分3次口服)，As2O3注射液10 mg/d (購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)責(zé)任有限公司)靜脈滴注治療，直至骨髓完全緩解(bone complete remission，BCR)。治療中若白細(xì)胞(WBC)≥10×109/L，加用高三尖杉酯堿1～4 mg/d，WBC降至10×109/L以下停藥?；颊連CR后序貫實(shí)施化療、維甲酸和As2O3交替治療。以上研究方案獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者在受試前知情同意并簽署知情同意書。

2 試劑和儀器

人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所；添加各種生長(zhǎng)因子和胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(EGMTM-2MV SingleQuotsTM)和胰蛋白酶為Becton Dickinson產(chǎn)品； VEGFR-2鼠抗人單抗購(gòu)自R&D；CD31鼠抗人單抗購(gòu)自上海長(zhǎng)島公司；羊抗鼠FITC標(biāo)記的 II 抗購(gòu)自Sigma；PE標(biāo)記的CD144鼠抗人單抗購(gòu)自Beckman Coulter；FITC標(biāo)記的CD133、FITC標(biāo)記的CD45和PE標(biāo)記的CD146鼠抗人單抗均購(gòu)自BD；CD146磁珠溶液購(gòu)自Miltenyi Biotec。FACSCantoTMII型流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 外周血中分離并計(jì)數(shù)CECs 初治患者于無(wú)菌操作下取靜脈血(EDTA抗凝)5 mL，稀釋后加入紅細(xì)胞裂解液靜置10 min，洗滌后與Fc受體阻斷劑置于4 ℃上30 min，與CD146磁珠溶液室溫孵育25 min后上柱分選，富集的細(xì)胞洗滌后調(diào)整體積至300 μL，均分成2管，即樣品管(T2)和空白對(duì)照管(T1)，T1和T2管中均加入FIFC標(biāo)記的CD45單克隆抗體20 μL，T2管中加入PE標(biāo)記的CD146單克隆抗體20 μL，T1管中加入20 μL同型對(duì)照，調(diào)整溶液體積至200 μL。4 ℃保存至上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD146+、CD45-、PI+的有核細(xì)胞。具體方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

3.2 細(xì)胞表面抗原的免疫熒光檢測(cè) 將分選的細(xì)胞制成細(xì)胞滴片，用4%的多聚甲醛室溫下固定30 min，用小牛血清封閉30 min，加工作濃度的 I 抗及FITC標(biāo)記的 II 抗，嚴(yán)格按照說(shuō)明步驟進(jìn)行，結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。

3.3 體外血管生成實(shí)驗(yàn) 用完全培養(yǎng)重懸液分選得到的細(xì)胞，接種到2%明膠包被的25 mL塑料培養(yǎng)瓶中進(jìn)行體外培養(yǎng)。應(yīng)用纖維蛋白凝膠體外血管生成試劑盒行體外血管生成實(shí)驗(yàn)。96孔培養(yǎng)板每孔依次加入30 μL 人纖維蛋白原與20 μL凝血酶，晃均，37 ℃ 30 min成凝膠；加入5×106/L細(xì)胞懸液培養(yǎng)過(guò)夜；去除培養(yǎng)液，依次加入30 μL人纖維蛋白原與20 μL凝血酶，晃均，加100 μL培養(yǎng)液，24 h。顯微鏡下觀察管腔形成情況，隨機(jī)選取3個(gè)視野(×200)計(jì)血管數(shù)目，重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

3.4 細(xì)胞集落形成率測(cè)定 取接近融合細(xì)胞，洗滌消化后制成細(xì)胞懸液，按2×104/L的密度接種到6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，洗滌后加4%甲醛5 mL固定細(xì)胞15 min，加適量姬姆薩液染色30 min，計(jì)數(shù)孔中集落數(shù)，以含50個(gè)以上細(xì)胞團(tuán)為1個(gè)集落。每次培養(yǎng)6個(gè)孔，取平均值。

3.5 尿砷測(cè)定 于治療前、治療后1周及2周分別留取患者晨尿50 mL，將尿液樣品與2 mol/L NaOH等體積比混合，于100 ℃恒溫消化3 h，采用氫化物發(fā)生-冷井捕集-原子吸收光譜法檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)尿砷的含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示， 兩組均數(shù)間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，對(duì)CECs數(shù)量治療后/治療前比值與臨床治療指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 APL患者臨床特征及其與CECs數(shù)量的關(guān)系

32例APL患者具體臨床資料詳見(jiàn)表1，其中4例患者CD34免疫分型呈陽(yáng)性，其CECs數(shù)量與CD34陰性患者相比明顯增多(P<0．05)，外周血白細(xì)胞 >10×109/L患者的CECs數(shù)量明顯多于白細(xì)胞 ≤10×109/L的患者(P<0．05)。高危、低危及中危3組患者的CECs數(shù)量呈現(xiàn)明顯的差異(P<0．05)。

APL患者CECs的數(shù)量與患者初診時(shí)的年齡、性別、體力狀況評(píng)分、血小板計(jì)數(shù)、是否合并DIC、PML/RARa基因亞型等臨床指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)性。

2 APL患者治療前后CECs數(shù)量及表面抗原的變化

APL患者初診時(shí)CECs中位數(shù)為38 (0～152)/mL，治療后為11 (0～49)/mL，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0．05)。

APL患者CECs均高表達(dá)CD31、CD144、VEGFR-2和CD146，基本不表達(dá)白細(xì)胞共同抗原CD45，鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞。而CD133是內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)志物[4]。32例APL患者誘導(dǎo)化療后均獲完全緩解，CD133的陽(yáng)性率較初診時(shí)明顯下降(P<0．05)。而CD31、CD144、VEGFR-2和CD146的表達(dá)在治療前后并無(wú)明顯變化，見(jiàn)表2。

3 APL患者治療前后CECs體外血管形成及集落生成數(shù)的比較

APL患者(n=10)初診時(shí)CECs在纖維蛋白凝膠上形成的管腔結(jié)構(gòu)數(shù)目(3個(gè)隨機(jī)視野管腔數(shù)之和)為19.0±1.8，而治療后(8.6±3.2)則明顯減少(P<0.05)，且形成的管腔相對(duì)欠圓潤(rùn)(圖1)。初診時(shí)CECs集落生成率為(4.44±1.82)/108MNCs，與治療后[(0.89±1.17)/108MNCs]相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4 APL患者CECs數(shù)量治療后/治療前的比值與臨床治療指標(biāo)的相關(guān)性

32例APL患者誘導(dǎo)化療獲CR時(shí)間平均為(30.0±5.6) d，高三尖杉酯堿平均用量(13.80±4.54) mg，維甲酸平均用量(873.80±129.03) mg，

表1 APL患者CECs數(shù)量與臨床特征的關(guān)系

Table 1.CECs quantity and clinicopathologic features of the 32 APL patients (Mean±SD)

VariableCases(%)CECs(/mL)PvalueTotal3244.72±41.45Gender Male19(59.4)42.52±45.12>0.05 Female13(40.6)47.53±37.46Age(year) <5020(62.5)45.10±45.40>0.05 ≥5012(37.5)43.67±36.31ECOG 0～221(65.6)48.38±46.74>0.05 3～411(34.4)37.27±30.18WBC(×109/L) ≤1027(84.4)33.48±31.59<0.01 >105(15.6) 101.80±40.96Platelet(×109/L) ≤4026(81.3)50.73±43.29>0.05 >406(18.7)17.83±17.68WithDIC No15(46.9)36.87±35.69>0.05 Yes17(53.1)51.41±46.15PML/RARa S14(42.8)32.50±29.22>0.05 L18(56.2)54.00±47.80Riskfactor Low12(37.5)28.75±31.07<0.05 Medium15(46.9)37.27±32.57 High5(15.6)101.80±40.96WithCD34positive No28(87.5)38.67±37.30<0.05 Yes4(12.5)85.75±52.81

As2O3平均用量(236.3±25.6) mg，而APL患者CECs數(shù)量治療后/治療前的比值與達(dá)CR時(shí)間、高三尖杉酯堿、維甲酸及As2O3用量均無(wú)相關(guān)性。APL患者CECs數(shù)量治療后/治療前的比值與初診時(shí)及As2O3治療2周后的尿砷濃度無(wú)相關(guān)性，但與As2O3治療1周后的尿砷濃度呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

表2 APL患者治療前后CECs表面標(biāo)記的變化

*P<0．05vsbefore treatment.

Figure 1.The angiogenesis of CECs from APL patients before (A) and after (B) treatmentinvitro(×200).

圖1 APL患者治療前與治療后CECs體外血管生成的比較

Figure 2.The colony-forming rates of CECs from APL patients before and after treatment. Mean±SD.n=10.*P<0．05vsbefore treatment.

圖2 APL患者治療前與治療后CECs集落形成率的比較

Figure 3.Correlation between the ratio of CECs counts from APL patients after therapy to that before therapy and arsenic concentration in urine on day 7 during As2O3treatment.

圖3 APL患者CECs數(shù)量治療后/治療前的比值與As2O3治療1周后的尿砷濃度的相關(guān)性分析

討 論

為解決CECs數(shù)量極少難以計(jì)數(shù)的困難，將免疫磁珠富集細(xì)胞后鏡下計(jì)數(shù)過(guò)程轉(zhuǎn)接給流式細(xì)胞儀，不僅可以精確計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞，還能有效避免紅細(xì)胞碎片、血小板及白細(xì)胞的污染。實(shí)驗(yàn)中分離的細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣的典型血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)高表達(dá)CECs的表面抗原CD31、CD144和VEGFR-2[8]。

實(shí)驗(yàn)中APL患者初診時(shí)CECs數(shù)量在高白細(xì)胞及CD34陽(yáng)性患者中明顯增多，在危險(xiǎn)度分組中有差異。而臨床上高白細(xì)胞及CD34+的患者早期死亡率高，治療反應(yīng)差[9]，說(shuō)明血管生成與疾病預(yù)后密切相關(guān)。而腫瘤患者CECs數(shù)量是反映腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)[10]。APL患者完全緩解后CECs數(shù)量明顯減少，提示CECs數(shù)量與腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)。與國(guó)外學(xué)者在實(shí)體腫瘤中觀察到的現(xiàn)象一致[11]。

同時(shí)APL患者CECs的生物學(xué)特性在治療后也發(fā)生變化，CD133的陽(yáng)性率明顯下降，在體外形成血管的能力下降。集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，治療后APL患者CECs的集落形成也減少，提示治療后CECs更多的表現(xiàn)出成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特征。

國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道維甲酸及As2O3對(duì)血管生成有抑制作用，但實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)CECs數(shù)量下降與維甲酸、As2O3用量的相關(guān)性，可能與治療過(guò)程中影響因素較多及藥物體內(nèi)代謝的復(fù)雜性有關(guān)。多項(xiàng)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明[12-13]，As2O3在體內(nèi)代謝的個(gè)體差異極大，用藥1周后患者的尿砷濃度趨于穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此時(shí)的尿砷濃度越高，CECs數(shù)量下降越明顯，說(shuō)明尿砷濃度的監(jiān)測(cè)能為個(gè)體化精準(zhǔn)用藥提供幫助。

綜上所述，精確計(jì)數(shù)CECs在白血病臨床診療中能發(fā)揮判斷治療反應(yīng)及評(píng)價(jià)預(yù)后的重要作用，并有助于白血病治療機(jī)制及個(gè)體化精準(zhǔn)治療方案的探索。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Alteration of circulating endothelial cells from acute promyelocytic leukemia patients before and after treatment and its influential factors

PEI Ren-zhi, WU Jing-yi, ZHANG Pi-sheng, LIU Xu-hui, DU Xiao-hong, CHEN Dong, SHA Ke-ya, LI Shuang-yue, CAO Jun-jie, CHEN Lie-guang, ZHUANG Xian-xu, YE Pei-pei, FAN Zheng, LIN Li, TANG Shan-hao, ZHANG Bi-bo, SHI Xiao-wei

(DepartmentofHematology,YinzhouPeople’sHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNingboUniversity,Ningbo315000,China.E-mail:smiles100@126.com)

AIM: To determine the biological feature of circulating endothelial cells (CECs) in acute promyelocytic leukemia (APL) patients before and after treatment, and to analyze the relationship between CECs and the clinical characteristics. METHODS: The CECs were sorted from peripheral blood by magnetic-activated cell sorting and then counted by 3-color flow cytometry. The cells were identified by immunofluorescence staining for the expression of CD146, CD31, CD144, VEGFR-2, CD45 and CD133. The CECs were culturedinvitro, and the tube formation and colony-forming rate were determined.RESULTS: Increased quantity of CECs was observed in CD34 positive group and group with WBC>10×109/L (P<0.05). The quantity of CECs had a significant difference among low risk, medium risk and high risk groups (P<0.05). The positive rate of CD133 and quantity of CECs significantly reduced in 32 APL patients when they gain complete remission after treatment (P<0.05). The amount of tube formation and colony-forming rate were significantly reduced after treatment (P<0.05). The ratio of CECs quantity from APL patients after treatment to that before treatment had a negative correlation with arsenic concentration in urine on day 7 during As2O3treatment (P<0．05). CONCLUSION: Accurately counting CECs may be helpful for evaluating prognosis and designing treatment strategy.

Acute promyelocytic leukemia; Circulating endothelial cells; Arsenic concentration in urine

1000- 4718(2016)12- 2282- 05

2016- 06- 20

2016- 10- 19

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LQ12H08001)；浙江省衛(wèi)生廳一般研究項(xiàng)目資助(No. 201235256)；寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2012A610236)；寧波市醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2011B23)

R730.23； R733.71

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.027

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△通訊作者 Tel: 0574-87016871； E-mail: smiles100@126.com