劉鶴媛，周 銘，岳進華，張洪杰，陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

山羊IFN-γ免疫血清制備及抗體ELISA檢測方法的建立

劉鶴媛，周 銘，岳進華，張洪杰，陳德坤*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為制備山羊干擾素-γ(IFN-γ)免疫血清并建立山羊IFN-γ抗體ELISA檢測方法，以原核表達的山羊γIFN重組蛋白(rIFN-γ)為材料，免疫小鼠制備免疫血清；通過對測定不同的抗原包被濃度及包被時間，酶標(biāo)抗體稀釋度，免疫血清的孵育時間等條件的優(yōu)化建立檢測抗體效價的ELISA檢測方法，并采用建立的方法測定免疫血清的抗體效價。結(jié)果顯示，rIFN-γ抗原包被濃度為10 μg/mL，4 ℃包被12 h；酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶5 000；免疫血清孵育時間為60 min，可以得到最佳ELISA的檢測結(jié)果。重復(fù)試驗顯示該方法變異系數(shù)(CV)在1.5%～5%之間。采用建立的方法測得免疫小鼠免疫血清效價為107。該ELISA檢測方法靈敏高，穩(wěn)定性好，為山羊IFN-γ抗體檢測提供了技術(shù)支持。

山羊；rIFN-γ；免疫血清；酶聯(lián)免疫吸附試驗

γ干擾素(IFN-γ)是一種重要的細胞因子，主要參與細胞免疫[1]。病毒、細胞內(nèi)寄生菌等病原體入侵機體[2]，或腫瘤細胞的產(chǎn)生[3]，都會刺激機體產(chǎn)生IFN-γ，誘導(dǎo)巨噬細胞、T細胞、B細胞等細胞MHCⅡ類分子的表達，提高抗原遞呈能力；IFN-γ也能活化巨噬細胞、NK細胞等，提高其對病原體的殺傷能力[4]，可以反映機體的細胞免疫狀態(tài)。 近年來，隨著山羊集約化養(yǎng)殖的擴大，山羊疫病大規(guī)模暴發(fā)的現(xiàn)象日益突出，疫病防控工作也變得尤為重要。以IFN-γ為評估指標(biāo)，可以評估機體細胞免疫水平，為疫病防控工作提供參考。目前，已見有關(guān)于其他動物IFN-γ的ELISA檢測方法[5-6]，但尚未見有關(guān)山羊IFN-γ的檢測方法。本試驗擬建立抗IFN-γ抗體ELISA檢測方法，為后續(xù)制備抗山羊IFN-γ單克隆抗體，建立山羊IFN-γ的ELISA檢測方法打下基礎(chǔ)，也為臨床監(jiān)測評估山羊免疫狀態(tài)提供有效的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性Balb/c小鼠，6周齡～8周齡，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 未除鹽的純化山羊rIFN-γ凍干粉，為西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室保存；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體為北京博奧森生物公司產(chǎn)品；TMB顯色液為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；酶標(biāo)板為Castor公司產(chǎn)品；其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備 將純化的山羊rIFN-γ凍干粉溶于蒸餾水，配制成1 mg/mL的液體，取弗氏完全佐劑與rIFN-γ等量混勻，用三通管進行乳化，乳化約1 h后，取1滴乳化物置于靜止水面，乳化物1 min內(nèi)不散開，表明乳化達到目的，此免疫原供小鼠首次免疫使用。按照同樣的方法制備rIFN-γ與弗氏不完全佐劑乳化的免疫原，供第2次免疫使用。rIFN-γ水劑抗原直接用蒸餾水溶解，制備成1 mg/mL即可。上述3種免疫原制備完成后，4℃保存，供1周內(nèi)小鼠免疫使用。

1.2.2 小鼠免疫及免疫血清制備 第1次免疫小鼠，按照100 μL/只，腹部皮下多點注射(50 μL/點)；首免后14 d，進行第2次免疫，免疫劑量同第1次，免疫部位選擇第1次未注射抗原的腹部皮下位點(50 μL/點)；2免后第14天，用水劑抗原免疫小鼠，免疫劑量為100 μL/只，腹腔注射。之后每隔1周，用水劑抗原加強免疫小鼠1次，免疫劑量和途徑同第3次免疫。末次免疫后10 d左右，摘眼球法采集免疫小鼠血液并分離血清，此為免疫血清(陽性血清)。另采集未免小鼠血液并分離血清，作為陰性血清。血清置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 間接ELISA操作方法 用pH9.6 、0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋包被抗原(山羊rIFN-γ)，100 μL/孔，4 ℃包被過夜；次日棄去孔內(nèi)液體，用pH7.4 含0.5 mL/L的Tween-20的PBS(PBST)洗滌2～3遍(以下簡稱洗滌)，加入50 g/L脫脂奶粉，100 μL/孔，37℃封閉1 h；棄去封閉液，洗滌，加入pH7.4的PBST稀釋的小鼠抗血清，并設(shè)陰性對照(陰性血清)，100 μL/孔，37℃孵育1 h；棄去小鼠血清，洗滌，加入羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；棄去酶標(biāo)二抗，洗滌，加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光孵育15 min；加入2 mol/L硫酸，100 μL/孔，終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀，讀取OD450 nm值。待測孔OD450 nm值(P)比陰性對照孔OD450 nm值(N)大于或等于2.1(即P/N≥2.1)時，待測孔判為陽性孔。

1.2.4 羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體最佳稀釋比例的確定 用PBST稀釋羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體，按照1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000、1∶10 000的比例稀釋，每一稀釋度做3個重復(fù)，100 μL/孔，37 ℃包被2 h；棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，以50 g/L脫脂奶粉作為封閉液，100 μL/孔，37℃封閉1 h；棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光孵育15 min；加入2 mol/L的硫酸，100 μL/孔，終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀，取OD450 nm值最接近1.0的孔對應(yīng)的羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體稀釋比例為最佳稀釋比例。

1.2.5 抗原包被濃度及包被時間的確定 用pH 9.6、0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液10倍連續(xù)稀釋山羊rIFN-γ為100.00、10.00、1.00、0.100 μg/mL，每一濃度的抗原分別與陽性、陰性血清反應(yīng)，按照上述間接ELISA操作方法，檢測不同濃度包被抗原所對應(yīng)的OD450 nm值。以P/N值最大的孔所對應(yīng)的抗原包被濃度為最佳抗原包被濃度。 以最佳抗原包被濃度將抗原包被10、11、12、13、14 h，并按照上述間接ELISA操作方法，檢測不同包被時間所對應(yīng)的OD450 nm值，以O(shè)D450 nm值趨于穩(wěn)定后對應(yīng)的最短包被時間為最佳包被時間。

1.2.6 血清孵育時間的確定 取小鼠陽性血清，用PBST以1∶1 000稀釋，按照上述ELISA操作方法，分別孵育30 、45、60、75、90 min，檢測不同孵育時間對應(yīng)的OD450 nm值，以O(shè)D450 nm值穩(wěn)定后對應(yīng)的最短孵育時間為最佳孵育時間。

1.2.7 重復(fù)試驗 取一份小鼠陽性血清分為A、B、C 3等份，分別在3個不同時間段，按照優(yōu)化條件，進行間接ELISA操作，檢測不同時間所得OD450 nm值，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果計算變異系數(shù)(CV)。

1.2.8 抗山羊rIFN-γ免疫血清效價的測定 用PBST稀釋陽性血清(抗rIFN-γ抗體)及陰性血清，均按照1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010的比例稀釋，并按照優(yōu)化條件進行ELISA操作，檢測陰、陽性血清按照不同比例稀釋時所得OD450 nm值，以P/N≥2.1為陽性結(jié)果，測免疫血清抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體稀釋度優(yōu)化結(jié)果

將羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體按照不同比例稀釋后，經(jīng)ELISA檢測，OD450 nm值見表1，酶標(biāo)抗體的稀釋度為1∶5 000時，OD450 nm值最接近1.0，為最佳稀釋度。

2.2 山羊 rIFN-γ包被濃度優(yōu)化結(jié)果

山羊rIFN-γ作為包被抗原，稀釋為不同濃度后，經(jīng)ELISA檢測，當(dāng)包被抗原濃度為10 μg/mL時，所得P/N值最大，因此，抗原的最佳包被濃度為10 μg/mL(表2)。

2.3 山羊rIFN-γ包被時間優(yōu)化結(jié)果

當(dāng)包被時間超過12 h(包括12 h)后，OD450 nm值趨于穩(wěn)定，因此，山羊rIFN-γ的最佳包被時間為12 h(表3)。

2.4 免疫血清孵育時間

小鼠陽性血清不同孵育時間所對應(yīng)的OD450 nm值見表4，當(dāng)孵育時間超過60 min(包括60 min)后，OD450 nm值趨于穩(wěn)定，因此，小鼠血清的最佳孵育時間為60 min。

2.5 重復(fù)性試驗

根據(jù)公式，變異系數(shù)(CV)=(標(biāo)準(zhǔn)差SD/平均值Mean)×100%，計算不同時間同一小鼠陽性血清ELISA檢測結(jié)果的變異系數(shù)(表5)，ELISA檢測結(jié)果的變異系數(shù)(CV)在1.5%～5%，說明該間接ELISA檢測方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 抗山羊rIFN-γ免疫血清抗體效價檢測結(jié)果

將陰、陽性血清按照不同比例稀釋后，所得OD450 nm及P/N值見表6，根據(jù)P/N值可知抗山羊IFN-γ免疫血清抗體效價為107。

表1 羊抗小鼠IgG酶標(biāo)抗體稀釋度檢測結(jié)果

Table 1 The determinition result of goat anti-mouse IgG-HRP dilutions

項目Item酶標(biāo)抗體稀釋度IgG-HRPdilution1∶10001∶30001∶50001∶70001∶10000OD450nm1.453±0.0741.209±0.0531.034±0.0430.892±0.0320.783±0.017

表 2 山羊rIFN-γ包被濃度優(yōu)化結(jié)果

Table 2 The optimization result of coating concentration of goat rIFN-γ

rIFN-γ濃度/(μg·mL-1)rIFN-γconcentrationOD450nm陽性血清(P)Positiveserum陰性血清(N)NegativeserumP/N100.001.446±0.0220.076±0.01319.0310.001.267±0.0320.063±0.00920.111.001.203±0.0180.074±0.01116.260.100.412±0.0130.056±0.0087.36

表3 山羊rIFN-γ包被時間

Table 3 The coating time of goat rIFN-γ

項目Item包被時間/hCoatingtime1011121314OD450nm0.842±0.0730.937±0.0831.032±0.0381.041±0.0221.037±0.019

表4 免疫血清孵育時間

Table 4 The incubation time of immune serum

項目Item孵育時間/minIncubationtime3045607590OD450nm0.768±0.0920.896±0.0431.043±0.0381.037±0.0231.041±0.016

表5 間接ELISA檢測方法的重復(fù)性試驗結(jié)果

Table 5 Repetitive test results of indirect ELISA method

樣品SamplesOD450nm檢測次數(shù)Testtimes123平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)差SD變異系數(shù)/%CVA1.0260.9970.9961.0060.01391.38B1.2101.1031.1171.1430.04754.15C1.1031.1331.1021.1130.01441.29

表6 抗山羊rIFN-γ抗體效價測定結(jié)果

Table 6 Potency test results of antibody against goat rIFN-γ

項目Item血清稀釋倍數(shù)及對應(yīng)的OD450nm值SerumdilutionsanditscorrespondingOD450nmvalues1031041051061071081091010陽性血清Positiveserum0.9390.7220.6320.4800.1340.1020.0820.071陰性血清Negativeserum0.0790.0690.0710.0620.0580.0560.0570.054P/N11.910.58.97.72.31.81.41.3

3 討論

IFN-γ由天然免疫系統(tǒng)的NK細胞分泌，在特異性免疫反應(yīng)中主要由活化的Th1、CTL分泌。NK細胞、活化Th1和CTL數(shù)量越多，IFN-γ分泌量就越多，體內(nèi)IFN-γ水平就越高，機體抗病毒等免疫功能就越強。準(zhǔn)確測定IFN-γ含量，對于評估機體細胞免疫功能狀態(tài)極為重要。通常測定IFN-γ水平，主要應(yīng)用抗IFN-γ單抗試劑盒[8-9]。目前市面未見山羊IFN-γ檢測試劑盒，主要原因是未有山羊IFN-γ單抗研制成功，這極大地限制了山羊免疫學(xué)基礎(chǔ)研究，以及相關(guān)的疫苗免疫效果評估等工作。本研究建立的山羊IFN-γ抗體ELISA檢測方法，對于實驗室后續(xù)研制山羊單抗工作奠定了基礎(chǔ)。

無論是制備山羊IFN-γ免疫血清還是山羊IFN-γ單抗，對IFN-γ都具有特別要求。純化的天然IFN-γ無論是用于免疫原還是包被抗原，都是最理想的抗原，但實際工作中這一思路的可行性較差。實驗室研發(fā)細胞因子單抗，首選免疫原通常考慮原核表達產(chǎn)物，主要基于其易于純化并且可大量獲得[10]，但要求原核表達的細胞因子必須和天然分子之間具有相同的功能性B細胞表位。本實驗室前期已成功獲得了純化的具有免疫活性的山羊IFN-γ原核表達產(chǎn)物[7]，該產(chǎn)物能夠抑制羊口瘡病毒(ORFV)感染山羊胎兒成纖維細胞，具有良好的抗病毒生物學(xué)活性，表明該產(chǎn)物具有與山羊天然IFN-γ相同免疫活性，二者在活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)部位可能存在相同的功能性B細胞表位。以此為基礎(chǔ)所制備的免疫血清和建立的IFN-γ抗體ELISA檢測方法，無疑具有識別山羊IFN-γ活力，為山羊IFN-γ研究和水平測定提供了可行的技術(shù)手段。影響ELISA測定結(jié)果的因素較多，關(guān)鍵因素包括抗原包被濃度及時間、酶標(biāo)抗體稀釋度、免疫血清孵育時間等，這些因素中的任何一個因素優(yōu)化條件不到位，都會對測定結(jié)果的特異性和靈敏度產(chǎn)生影響。本研究優(yōu)化結(jié)果顯示包被抗原濃度為10 μg/mL。無論包被抗原濃度高于還是低于這一濃度，P/N值均會降低，偏離此包被濃度愈遠，靈敏度愈低；在確定酶標(biāo)抗體稀釋度時，參考稀釋范圍為1∶1 000～1∶10 000，本研究設(shè)計5個不同的稀釋比例，優(yōu)化的稀釋比例為1∶5 000。這一優(yōu)化結(jié)果既避免了酶標(biāo)抗體的浪費，又保證了所得結(jié)果的可靠性；當(dāng)抗原包被時間為12 h，小鼠血清孵育時間為60 min時，OD450 nm值不再隨時間的延長而增加，表明此時各自的反應(yīng)充分。按照以上優(yōu)化條件重復(fù)ELISA操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)保持在1.5%～5%之間，且利用該ELISA方法所測得的小鼠陽性血清的穩(wěn)定效價為107，表明本研究建立的方法具有良好的穩(wěn)定性。

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Preparation of Goat IFN-γ Immune Serum and Establishment of an ELISA for Detecting Antibodies

LIU He-yuan，ZHOU Ming，YUE Jin-hua，ZHANG Hong-jie，CHEN De-kun

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China)

In order to prepare immune serum against goat IFN-γ and develop a method of ELISA, Balb/c mice were immunized with recombinant goat IFN-γ (rIFN-γ) expressed prokaryotically to produce immune serum, and then the coating concentration and time of rIFN-γ, the HRP-IgG dilution, and incubation time of the immune serum were all determined to optimize the ELISA method. And the potency of immune serum was also detected. The results suggested that an optimized ELISA result could be acquired when rIFN-γ was coated at 4℃ for 12 h in a concentration of 10 μg/mL, HRP-IgG was diluted at 1∶5 000, and the immune serum was incubated for 60 min. The repeated experiments suggested that the coefficient of variation (CV) varied between 1.5% and 5%. The immune serum potency was proved to be 107. This ELISA method with high sensitivity and stability could provide a strong requirement for goat IFN-γ detection.

goat; rIFN-γ; immune serum; ELISA

2016-04-12

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTTSNY04-04)

劉鶴媛(1989-)，女，河南周口人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病原學(xué)與免疫學(xué)研究。 *通訊作者

S852.4

A

1007-5038(2016)12-0024-04