蔣慶科，鄒品田，羅勇為，陸海南，覃江克，鄒華紅

(1.廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004；2. 省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國家重點實驗室，廣西桂林541004；3. 桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林541100)

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QuEChERS-LC-MS/MS法測定黃皮果中30種常用農(nóng)藥殘留

蔣慶科1，2，鄒品田3，羅勇為3，陸海南1，2，覃江克1，2，鄒華紅1，2

(1.廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004；2. 省部共建藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國家重點實驗室，廣西桂林541004；3. 桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林541100)

利用QuEChERS-LC-MS/MS法快速測定黃皮果中30種常用農(nóng)藥殘留。該法先采用乙腈從黃皮果中振蕩提取的各殘留農(nóng)藥，經(jīng)過PSA、無水MgSO4吸附凈化后，再利用LC-MS/MS檢測。結(jié)果表明：待測定的30種農(nóng)藥在5.0、10.0和20.0 μg/kg 3個加標水平下，平均回收率56.3%～109.0%，相對標準偏差1.0%～10.7%，線性方程的相關(guān)系數(shù)R2達到0.996 7～0.999 9。該方法具有簡便快捷、成本低、效率高等優(yōu)點，可為當前黃皮果中農(nóng)藥多殘留檢測試驗提供參考依據(jù)。

QuEChERS; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；黃皮果；農(nóng)藥殘留

0 引言

黃皮果Clausenalansium(Lour.) Skeels屬于蕓香科黃皮屬植物，因皮呈黃色而得名，又稱黃彈、黃枇等，主要分布于我國廣西、廣東、云南、海南等地區(qū)[1]。作為我國南方的一種特色水果，黃皮果色、香、味俱佳，與荔枝齊名，食用不但有助于消化，而且具有消積去滯、祛痰化氣、疏通腸胃等功效，深受廣大群眾喜愛[2]。在黃皮果種植過程中，不可避免地施用各種農(nóng)藥，這給人們的健康帶來潛在的危害。因此，黃皮果中農(nóng)藥殘留的檢測不但對于市場上黃皮果的質(zhì)量控制，而且對于人們的健康保障具有重要現(xiàn)實意義。

目前，農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)有很多，如氣相色譜法(GC)[3-4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[7]等。單一的高效液相色譜法與氣相色譜法在靈敏度和精確度上比較低，通過與質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS、LC-MS)很大地提升了檢測的靈敏度和準確度。而近年來出現(xiàn)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)不但在靈敏度、精確度、選擇性上進一步超越了原有農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)，而且在復(fù)雜基質(zhì)、熱敏性物質(zhì)、農(nóng)藥多殘留檢測上具有顯著優(yōu)勢[8-10]。同時，在樣品檢測前處理的凈化技術(shù)上主要有QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)[11]、固相萃取(SPE)和凝膠色譜(GPC)等方法，而QuEChERS法相對于固相萃取(SPE)和凝膠色譜法(GPC)而言，操作快速、環(huán)保、簡便，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，有關(guān)黃皮果中農(nóng)藥殘留檢測方法的研究很少，2006年呂岱竹等[12]報道了固相萃取-高效液相色譜法測定黃皮果中的異菌脲殘留量，而黃皮果中多農(nóng)藥殘留的檢測未見報道。本實驗采用QuEChERS法結(jié)合LC-MS/MS測定黃皮果中30種常用農(nóng)藥殘留，操作簡便，成本低，靈敏度高，適用于大量樣品快速分析，旨在為當前黃皮果農(nóng)藥多殘留體系的進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Agilent 6495三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；Milli-Q-Gard 1超純水儀(美國MILLIPORE公司)；梅特勒XS205分析天平，感量0.000 01 g(瑞士梅特勒)；TD5A臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；HERMLE Z383K高速型離心機(萊比信科技發(fā)展有限公司)；超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

黃皮果(野生，廣西桂林市山區(qū)采摘)。

標準物質(zhì)：纈霉威、異丙甲草胺、毒死蜱、吡蟲啉、殺撲磷、甲基硫菌靈、乙酰甲胺磷、三唑酮、甲霜靈、多菌靈、乙霉威、三唑醇、戊唑醇、霜霉威、多效唑、烯唑醇、三環(huán)唑、啶蟲脒、嘧霉胺、丙環(huán)唑、己唑醇、烯酰嗎啉、惡霜靈、腈菌唑、氟苯脲、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、莠滅凈、嘧菌酯、異丙威，濃度均為100 mg/L(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)?；旌蠘藴嗜芤海悍謩e移取各濃度為100 mg/L農(nóng)藥標準溶液至容量瓶中，用乙腈定容稀釋至1.0 mg/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的處理

樣品提?。簩悠犯咚賱驖{30 s，稱取20.00 g置于150 mL錐形瓶中，加入超純水10 mL，混勻震蕩1 min后，分別加入20 mL乙腈、8.00 g NaCl、2.00 g無水MgSO4，震蕩1 min后，離心。

樣品凈化：取上清液4 mL，移入裝有無水硫酸鎂1.00 g、N-丙基乙二胺 (PSA) 0.15 g的凈化離心管中，以1 000 r/min 旋混2 min (或以手劇烈振蕩提取1 min)，以4 000 r/min離心5 min，離心后取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動相A：體積分數(shù)為0.1%甲酸、0.1 mmol/L甲酸胺水溶液；流動相B：體積分數(shù)為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.4 mL/min。洗脫梯度：B初始體積分數(shù)為10%；0～10 min，B體積分數(shù)線性增加至95%；10～12 min，B保持體積分數(shù)95%；12～15 min，回到初始狀態(tài)，并保持3 min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電離模式：電子轟擊離子源(EI)；激活電壓：1.5 V；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：2.757 9×105Pa；毛細管電壓：3 500 V；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流速：12 L/min。數(shù)據(jù)采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

選擇QI全掃描，結(jié)果顯示在正離子(ESI+)掃描模式下，所有組分的響應(yīng)值優(yōu)于負離子(ESI-)掃描模式，靈敏度較高。為避免某些組分色譜峰重疊的干擾，選取化合物的2個離子對分別用于定性和定量。

2.2 色譜條件的確定

采用LC-MS/MS法進行農(nóng)藥檢測，流動相考察了甲醇/水體系、乙腈/水體系、甲醇/甲酸銨-甲酸水體系、乙腈/甲酸銨-甲酸水體系，通過實驗發(fā)現(xiàn)，加入甲酸銨-甲酸可以使農(nóng)藥在正離子模式下得到更好的電離，乙腈/甲酸銨-甲酸水體系的分離效果優(yōu)于甲醇/甲酸銨-甲酸水體系，且提取過程采用的是乙腈做提取劑，所以本研究最終采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，以含體積分數(shù)0.1%甲酸、0.1 mmol/L甲酸銨的水溶液(A)與含體積分數(shù)0.1%的甲酸的乙腈溶液(B)為流動相，具體梯度設(shè)置見1.2.2。

表1 30種農(nóng)藥的LC-MS/MS檢測條件

2.3 前處理優(yōu)化

2.3.1 萃取溶劑的選擇

一般農(nóng)藥殘留檢測提取溶劑為正己烷、丙酮、乙腈。通過實驗觀察，使用丙酮時分層不明顯；正己烷對一些極性較大的農(nóng)藥組分的溶解性差，致使回收率降低，同時，需置換溶劑，步驟繁瑣，不能達到快速檢測的目的；而乙腈的穿透性強，對極性大的與極性小的農(nóng)藥溶解性均強，對多種殘留農(nóng)藥都能較完全提取。通過對比，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 氯化鈉的用量

加入過量氯化鈉，溶液達到飽和，可以使乙腈相與水相具有較好的分層效果，同時能使樣品中的膠體聚沉。實驗結(jié)果表明，前處理加入10 mL水時，加入8 g氯化鈉較為適宜。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

大量研究表明，不同植物體內(nèi)的基質(zhì)對分析物的離子化有著增強或者抑制效應(yīng)，為此，采用空白基質(zhì)加標的方法減弱基質(zhì)效應(yīng)，溶劑匹配混合標液和基質(zhì)匹配混合標液的總離子流圖見圖1、圖2。由圖可以看出，基質(zhì)對分析物的離子化具有一定影響。

圖1 MRM模式下乙腈溶劑混合標液的總離子流圖Fig.1 The total ion flow diagram of acetonitrile mixed standard solution under MRM mode

圖2 MRM模式下黃皮果基質(zhì)匹配混合標液的總離子流圖Fig.2 The total ion flow diagram of chinese wampee matching mixed standard solution under MRM mode

2.5 線性關(guān)系和檢出限

在優(yōu)化的條件下進行方法學(xué)考察。用空白樣品的提取液稀釋標準溶液，將目標化合物的混合標準溶液依次稀釋為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0及50.0 μg/kg，進樣2 μL，以MRM定量離子的色譜面積為縱坐標(Y)，以目標化合物濃度為橫坐標(X)，建立標準曲線，以3倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)，結(jié)果如表2所示?？梢?，在0.5～50.0 μg/kg，各組分的峰面積與質(zhì)量濃度成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.995，可用于定量檢測。

2.6 回收率和精密度

農(nóng)藥殘留檢測中的回收率和變異系數(shù)(相對標準偏差)用于考察方法的準確度和精密度，一般采用標準加入法測定。取已制備均勻的空白樣品，準確加入多種農(nóng)藥的混合標準溶液，制備加標水平分別為5.0、

表2 30種常用農(nóng)藥的線性關(guān)系

10.0、20.0 μg/kg的樣品各5份，按上述優(yōu)化后的方法提取、凈化樣品，并進行LC-MS/MS分析，基質(zhì)匹配外標法定量，計算平均回收率和變異系數(shù)，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，30種常用農(nóng)藥的平均回收率為56.3%～109.0%，相對偏差為1.0%～10.7%，均在可允許范圍內(nèi)。乙酰甲胺磷在3個水平的回收率分別為57.7%、57.2%和56.3%，回收率偏低，可能是由于其極性偏大，在水中的溶解度大，難以萃取至乙腈相中，但其相對偏差在2.6%～6.6%的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

表3 3個水平下的農(nóng)藥的回收率和相對標準偏差

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)建立了黃皮果中30種農(nóng)藥殘留檢測的方法，不但實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)一次提取、快速凈化，而且具有簡便、準確、高效等優(yōu)點。經(jīng)檢測，30種常用農(nóng)藥在3個添加水平下的平均回收率為56.3%～109.0%，相對偏差為1.0%～10.7%，檢測結(jié)果穩(wěn)定，線性方程的相關(guān)系數(shù)R2達到0.996 7～0.999 9，適用于黃皮果中多種農(nóng)藥殘留的檢測。

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(責任編輯 王龍杰)

Determination of 30 Kinds of Pesticide Residues in Fruit of Chinese Wampee by QuEChERS-LC-MS/MS Method

JIANG Qingke1，2， ZOU Pintian3， LUO Yongwei3，LU Hainan1，2， QIN Jiangke1，2， ZOU Huahong1，2

(1. School of Chemistry and Pharmacy， Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541004， China; 2. State Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources， Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541004， China; 3. Guilin Layn Natural Ingredients Corp， Guilin Guangxi 541100， China)

30 kinds of pesticide residues in wampee were determined rapidly by the method of QuEChERS-LC-MS/MS. In this method， the pesticide residues were extracted from the fruits of Chinese Wampee by shaking with acetonitrile firstly， and then purified by PSA and anhydrous MgSO4， finally the sample solvents were detected by LC-MS/MS. The results showed： the average recovery of 30 pesticides ranged from 56.3% to 109% in the spiked level of 5， 10， 20 μg/kg， with relative standard deviation from 1.0% to 10.7%， and the correlation coefficient of the linear equation can reach 0.996 7 to 0.999 9. This method is simple but with low cost and high efficiency， and can provide reference for multiple pesticides residue in wampee detection tests.

QuEChERS; LC-MS/MS;Clausenalansium(Lour.) Skeels; pesticide residue

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.03.015

2016-04-20

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科攻12118008-10)；桂林市科技計劃項目(20140111-2)

覃江克(1977—)，男，廣西大化人，廣西師范大學(xué)教授，博士。E-mail: jiangkeq@sina.com

O641

A

1001-6600(2016)03-0109-07