■ 王金和 雷連成

(1.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062；2.河南牧業(yè)經濟學院動物醫(yī)學院，河南鄭州 450046)

近年來，用微生物作為載體富集動物所必需微量元素是新型飼料添加劑研發(fā)方向之一。如以微生物為載體，可以富集鐵、鋅、硒、鍺、鉻等微量元素，使其具備益生菌和微量元素雙重功效。研究表明，乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌均具有一定的微量元素轉化能力[1-3]。本試驗通過選擇產朊假絲酵母、凝結芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌做為制備富鋅益生素的菌種，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，生產活菌數(shù)和鋅轉化率較高的富鋅益生素產品，能夠將益生菌、有機鋅雙重功效相結合，有助于動物對鋅的攝取，可以提高動物對微量元素鋅的吸收利用率，為臨床開發(fā)和應用生物轉化無機鋅，形成具有活菌及有機鋅的新型飼料添加劑提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 菌種

產朊假絲酵母（Candida utilis）：河南牧業(yè)經濟學院微生物實驗室保存菌種；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus Acidophilus）：購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，菌株編號BNCC338074；凝結芽孢桿菌（Bacillus coag?ulans）：購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，菌株編號BNCC168437。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基

產朊假絲酵母活化培養(yǎng)基：蛋白胨 5.0 g、葡萄糖 10.0 g、酵母膏 3.0 g、麥芽浸膏 3.0 g、瓊脂 20.0 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然；產朊假絲酵母種子培養(yǎng)基[4]：蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

嗜酸乳桿菌活化培養(yǎng)基：10%的脫脂乳培養(yǎng)基，pH值自然，115℃、15 min滅菌；嗜酸乳桿菌種子培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基（購自上海易利生物科技有限公司）。

凝結芽孢桿菌活化培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（購自青島海博生物技術有限公司）；凝結芽孢桿菌種子培養(yǎng)基[5]：葡萄糖60 g、蛋白胨 10 g、酵母膏 5 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.5。

1.2.2 復合菌發(fā)酵培養(yǎng)基

參照孫楊（2015）方法[6]確定以上三種復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成：麥麩18 g、玉米皮粉7.5 g、豆粕4.5 g、麥芽糖 0.45 g、紅糖0.74 g、NH4Cl 0.3 g、(NH4)2SO40.3 g、CaCO30.15 g、KH2PO40.29 g、MnSO40.08 g、MgSO40.15 g，pH值自然，含水量（即干物料質量∶水的體積）為1∶0.8。流通蒸汽滅菌。

1.2.3 計數(shù)培養(yǎng)基

嗜酸乳桿菌計數(shù)培養(yǎng)基：GYP白亞瓊脂培養(yǎng)基；產朊假絲酵母計數(shù)培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基；凝結芽孢桿菌計數(shù)培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。均購自青島海博生物技術有限公司。

1.3 主要儀器

Qyc-211全溫空氣搖床（上海?，攲嶒炘O備有限公司生產），F(xiàn)A1104N電子天平（上海精密科學儀器有限公司生產），DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司生產）、UV754紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司生產），低溫粉碎機（江陰市金科粉碎機械有限公司）。

1.4 菌種活化與種子液獲得

將產朊假絲酵母菌菌種接種于斜面活化培養(yǎng)基上，30℃、培養(yǎng)40 h；連續(xù)活化2～3次，再按照3%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、160 r∕min搖床培養(yǎng)13 h，獲得產朊假絲酵母的液體種子液[7]。將嗜酸乳桿菌菌種接種于斜面活化培養(yǎng)基上，35℃、培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2～3次，再3%的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r∕min搖床培養(yǎng)24 h，獲得嗜酸乳桿菌種子液。將凝結芽孢桿菌菌種接種于斜面活化培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2～3次，再接種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r∕min搖床培養(yǎng)24 h，獲得凝結芽孢桿菌種子液。將產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌種子液分別計數(shù)，活菌數(shù)均達到109以上再按照1∶1∶1比例配置成生產用混合種子液。

1.5 富鋅益生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.5.1 硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基配比對益生菌生長和鋅轉化率的影響

配置鋅濃度為 50 mg∕ml的硫酸鋅溶液[8]，121 ℃高壓滅菌30 min后備用。將硫酸鋅溶液加入復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基比例分別為 1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300。將混合種子液5%接種于復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻后裝入淺盤35℃培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結束后分別進行產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌活菌計數(shù)，同時測定有機鋅轉化率。

1.5.2 益生菌接種量對益生菌生長和鋅轉化率的影響

將混合種子液分別按照1%、2%、5%、7.5%、10%接種于復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基比例為1∶200；攪拌均勻后裝入淺盤35℃培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結束后分別進行產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌活菌計數(shù)，同時測定有機鋅轉化率。

1.5.3 培養(yǎng)溫度對益生菌生長和鋅轉化率的影響

將50 mg∕ml硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)(基培養(yǎng)基比例按照1∶200)加入復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，將混合種子液5%接種于復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻后裝入淺盤分別以20、25、30、35、37、45 ℃培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結束后分別進行產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌活菌計數(shù)，同時測定有機鋅轉化率。

1.5.4 培養(yǎng)時間對益生菌生長和鋅轉化率的影響

將50 mg∕ml硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基1∶200的比例加入復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，將混合種子液5%接種于復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻后裝入淺盤以35℃分別培養(yǎng)30、36、48、72 h。培養(yǎng)結束后分別進行產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌活菌計數(shù)，同時測定有機鋅轉化率。

1.5.5 烘干溫度的對益生菌活菌數(shù)的影響

發(fā)酵結束后，稱取等質量的發(fā)酵物料于托盤（托盤內部放一張濾紙）中，將托盤置于真空干燥箱內烘干。并設置4個溫度梯度50、60、70、80 ℃，處理1 h后，每個變量三個平行，處理完畢后計數(shù)活菌數(shù)。

1.6 富鋅益生素制備

1.6.1 富鋅益生素獲得

將濃度為50 mg∕ml硫酸鋅溶液加入復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中（硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基比例為1∶200），將混合種子液按照5%接種量接種于復合菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻后裝入淺盤35℃培養(yǎng)36 h，淺盤表面及內層長滿菌體后溫度提高至60℃，加大風量，干燥后低溫粉粹，得到富鋅益生素飼料添加劑。同時檢測富鋅益生素活菌數(shù)及有機鋅轉化率。

1.6.2 富鋅益生素安全性試驗

取健康1日齡雛雞60只，隨機分為試驗組和對照組2組，每組30只。試驗組按照常規(guī)日糧試驗設計劑量最高量的10倍添加富鋅益生菌（2 000 g∕t），常規(guī)飼養(yǎng)管理。連喂5周，每天觀察一次，觀察雛雞生長和發(fā)病，5周后每組隨機抽取6只剖檢，檢查雛雞內臟器官有無病理變化。

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 活菌數(shù)檢測

嗜酸乳桿菌活菌、產朊假絲酵母活菌、凝結芽孢桿菌活菌數(shù)測定分別按照文獻[9-11]進行。富鋅益生素活菌數(shù)檢測：取10 g富鋅益生素，用滅菌生理鹽水做10倍梯度稀釋，分別取不同稀釋度益生素稀釋液0.1 ml，均勻涂布于不同菌種固體培養(yǎng)基，每個稀釋度3個重復，以每個平板上生長30～300個菌落作為計數(shù)標準，培養(yǎng)后活菌計數(shù)。

1.7.2 有機鋅轉化率測定

參照高永慧(1998)[12]的方法，采用原子吸收分光光度法測定鋅含量，富鋅益生素1∶5稀釋后，3 000 r∕min離心8 min，分別測定沉淀物和上清液鋅含量，有機鋅轉化率(%)=沉淀物鋅含量∕總鋅含量×100(總鋅含量為沉淀物和上清液含鋅量之和)。

2 結果

2.1 硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基配比對益生菌生長和鋅轉化率的影響（見表1）

表1 硫酸鋅溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基配比對益生菌生長和鋅轉化率的影響

由表1可知，當硫酸鋅溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基配比1∶200時，發(fā)酵物中產朊假絲酵母數(shù)量4.83×108CFU∕g，達到最大；當硫酸鋅溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基配比1∶100時，嗜酸乳桿菌數(shù)量5.67×108CFU∕g，達到最大；當硫酸鋅溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基配比1∶200時，發(fā)酵物中凝結芽孢桿菌數(shù)量6.61×109CFU∕g，達到最大。當硫酸鋅溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基配比1∶200時，鋅的轉化率是76.47%，達到最大。因此，綜合考慮，確定硫酸鋅溶液與發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配比1∶200。

2.2 益生菌不同接種量對益生菌生長和鋅轉化率的影響（見表2）

表2 益生菌接種量對益生菌生長和鋅轉化率的影響

當接種量是5%時，發(fā)酵物中產朊假絲酵母數(shù)量4.91×108CFU∕g，嗜酸乳桿菌數(shù)量5.79×108CFU∕g，達到最大；當接種量是7.5%時,發(fā)酵物中凝結芽孢桿菌數(shù)量6.86×109CFU∕g，達到最大；當接種量是5%時，鋅的轉化率是76.58%，達到最大。因此，綜合考慮確定種子混合菌液在發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳總接種量為5%。

2.3 不同的培養(yǎng)溫度對益生菌生長和鋅轉化率的影響（見表3

當培養(yǎng)溫度25℃時，產朊假絲酵母數(shù)量4.81×108CFU∕g，達到最大；當培養(yǎng)溫度35℃時，嗜酸乳桿菌數(shù)量是 5.68×108CFU∕g，達到最大；當培養(yǎng)溫度37 ℃時，凝結芽孢桿菌數(shù)量6.88×109CFU∕g，達到最大。當培養(yǎng)溫度25℃時，鋅的轉化率是76.82%，達到最大。綜合考慮，生產富鋅益生素必須保持足夠的益生菌數(shù)量和鋅轉化率，確定益生菌適宜培養(yǎng)溫度為35℃。

2.4 不同培養(yǎng)時間對益生菌生長和鋅轉化率的影響（見表4）

表3 不同的培養(yǎng)溫度對益生菌生長和鋅轉化率的影響

表4 培養(yǎng)時間對益生菌生長和鋅轉化率的影響

當培養(yǎng)時間為36 h，產朊假絲酵母和嗜酸乳桿菌的生長量達到最大，分別為4.86×108、5.67×108CFU∕g；培養(yǎng)時間為36 h時，凝結芽孢桿菌數(shù)量為5.88×109CFU∕g，也相對也較高；鋅的轉化率在培養(yǎng)36 h

后，鋅的轉化率達到76.82%，36 h后，雖有一定的增長，但不十分明顯。因此，綜合考慮三種益生菌的生長情況和鋅的轉化率，確定適宜培養(yǎng)時間為36 h。

2.5 不同烘干溫度對益生菌活菌數(shù)的影響(見表5)

表5 烘干溫度對益生菌活菌數(shù)的影響

隨著烘干溫度的升高，三種益生菌的活菌數(shù)均在減少，凝結芽孢桿菌活菌數(shù)下降最小。當烘干溫度從50℃升高到60℃時，產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌活菌數(shù)分別下降了5.89%、7.29%、2.73%；當烘干溫度從50℃升高到70℃時，產朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌活菌數(shù)分別下降了39.16%、42.17%、11.79%；綜上所述，發(fā)酵后烘干工藝的溫度選擇60℃。

2.6 富鋅益生素的制備

按照上述優(yōu)化的工藝條件制備得到富鋅益生素，活菌數(shù)和鋅轉化率見表6。富鋅益生素產朊假絲酵母含活菌數(shù)5.2×108CFU∕g；嗜酸乳桿菌含活菌數(shù)6.4×108CFU∕g；凝結芽孢桿菌含活菌數(shù)7.91×109CFU∕g。富鋅益生素的總活菌數(shù)為9.07×109CFU∕g，有機鋅轉化率為79.82%。

表6 富鋅益生素活菌數(shù)及鋅轉化率

2.7 富鋅益生素安全性試驗結果

用10倍劑量的富鋅益生菌，連續(xù)飼喂5周后的安全性試驗結果表明，試驗組和對照組的雛雞存活率均為100%；試驗組和對照組采食情況正常，精神狀態(tài)均良好，試驗組糞便顏色蓬松，均未有異常狀況；每組隨機剖檢6只雞檢查結果發(fā)現(xiàn)，雛雞肌胃、腺胃、腸道及內臟均正常，病理學檢查未見異常變化。

3 討論

微量元素生物學利用率一直是動物飼料添加劑研究的重要課題，對無機微量元素進行有機轉化，提高其生物學利用率，是有效的手段。目前研究比較多的是鋅和硒元素。有益菌轉化有機硒制備的產品或研究比較多。目前文獻報道微生物對鋅的轉化主要使用酵母菌，如富鋅酵母的研制。本試驗同時利用三種有益菌轉化無機鋅，此方面的文獻報道不多，但單個菌種對無機鋅的轉化和利用，均有報道。文獻研究表明，酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌均具有一定的富集及轉化微量元素的能力，尤其以酵母菌對微量元素的轉化能力強[13]。胡振英等（1997）[8]研制了富鋅酵母，獲得了具有較高產率的富鋅酵母菌株，其含鋅量達15 000 μg∕g?？琢值?2006)[14]研制了富鋅酵母的制備工藝，酵母菌的富鋅總量可達到130 mg∕l。乳酸菌也具有將無機鋅轉化為有機鋅的能力。陳健凱(2005)[15]研制了富鋅酸奶，其含鋅量達到500.06 mg∕g。陳瑤等（2009）[16]從發(fā)酵酸菜、酸奶中分離出6株具富鋅能力的乳酸菌，并研究了富鋅乳酸菌培養(yǎng)基優(yōu)化。芽孢桿菌具有和微量元素相互促進的作用，連賓等（1990）[17]研究了微量元素鋅、錳對地衣芽孢桿菌的影響，結果表明鋅、錳具有促進地衣芽孢桿菌生長和芽孢形成的作用，適當濃度的Zn、Mn離子能夠維持地衣芽孢桿菌高溫下的生長。陳美娜等（2013）[18]研究結果表明，微量元素錳可以影響地衣芽孢桿菌的生長曲線，促進其芽孢的形成和菌體活性。

產朊假絲酵母及枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)條件較低，而嗜酸乳桿菌能利用酵母培養(yǎng)物進行生長，因此它們是互利共生的[19]，故本試驗選擇了三種益生菌的接種比例為1∶1∶1。益生菌接種量直接關系到發(fā)酵后活菌數(shù)的多少，發(fā)酵效果的優(yōu)劣，接種量過低導致微生物生長量不足，發(fā)酵周期延長和發(fā)酵不徹底；而接種量過高，容易造成微生物生長過度導致底物缺氧，微生物活性產物(如酶)的分泌受到抑制，同時也會過快地消耗養(yǎng)分，從而發(fā)酵效果變差[20]。從本試驗結果來看，當接種量達到5%，益生菌接種量對益生菌生長和鋅轉化的影響最佳。硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基配比關系，對益生菌生長和鋅轉化率有一定影響，硫酸鋅溶液添加量越大時，對益生菌生長有抑制作用，活菌數(shù)和鋅轉化率越低，當培養(yǎng)基中鋅濃度較高時抑制作用越明顯，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量鋅，不但能夠對益生菌的生長繁殖無抑制作用，反而能有一定的促進作用[21]。

本試驗結果顯示了硫酸鋅溶液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基配比為1∶200時，活菌數(shù)及鋅轉化率可以達到最佳平衡。溫度過高或過低均影響發(fā)酵效果，本試驗中酵母菌適宜的培養(yǎng)溫度較低，酵母菌培養(yǎng)在25℃以后，活菌數(shù)逐漸下降，但在35℃,下降幅度不大，嗜酸乳桿菌及凝結芽孢桿菌適宜的培養(yǎng)溫度較稍高，所以35℃或37℃，對其活菌數(shù)影響不大，綜合考慮，選擇35℃做為培養(yǎng)溫度。