主動(dòng)外排機(jī)制和膜蛋白缺失在陰溝腸桿菌耐藥中的研究

扈會(huì)整，蘇庚詢，張曄婷，任偉娟，文 杏，任超杰，王 嬋

(陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院，陜西 西安712000)

主動(dòng)外排機(jī)制和膜蛋白缺失在陰溝腸桿菌耐藥中的研究

扈會(huì)整，蘇庚詢，張曄婷，任偉娟，文 杏，任超杰，王 嬋

(陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院，陜西 西安712000)

陰溝腸桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，由于頭孢菌素等廣譜抗菌藥物的廣泛使用，陰溝腸桿菌的耐藥水平不斷增加，此菌具有染色體介導(dǎo)的bush I(AmpC)[1]型β-內(nèi)酰胺酶(又稱誘導(dǎo)酶或C類頭孢菌素酶)，常在治療過程中產(chǎn)生多重耐藥[2，3]，多重耐藥的陰溝腸桿菌引起的菌血癥有很高的病死率。給臨床治療和院內(nèi)感染控制帶來了極大的挑戰(zhàn)[4]。陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制，是否與細(xì)胞內(nèi)存在主動(dòng)外排機(jī)制和膜蛋白缺失有關(guān)，我們對(duì)此作了相應(yīng)的試驗(yàn)和基因分型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與質(zhì)控菌株 2012年6月至2013年5月從我院臨床各種感染患者的標(biāo)本中共分離獲得不重復(fù)的100株陰溝腸桿菌，其中耐碳青霉烯酶的菌株20株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，ATCC13047。

1.1.2 試劑和設(shè)備 M-H培養(yǎng)基(杭州天和)；菌種及藥敏鑒定使用VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌藥敏鑒定系統(tǒng)及配套試劑(購(gòu)于法國(guó)生物梅里埃公司)；PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)于上海生物工程有限公司；100 bp DNA梯帶標(biāo)志物(大連寶生物)，Eppendorf centrifuge5417R低溫離心機(jī)，MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)，Bio-Rad電泳儀，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)，氰氯苯腙(CCCP)終濃度5 mg/L(Sigma)，IMP Etest試條(0.002-32tlg/m1)(瑞典AB Biodisk)，瓊脂糖(英國(guó)Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCCP(氰氯苯腙)抑制作用 CCCP對(duì)主動(dòng)外排泵表型特征的影響配制水解酪蛋白(M-H)瓊脂和含CCCP(終濃度5 mg/L，該濃度對(duì)外排泵有較好抑制作用，而對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)影響)的M—H瓊脂平皿，挑取2-3個(gè)過夜培養(yǎng)的菌落，用生理鹽水調(diào)至0．5麥?zhǔn)蠁挝唬凑誎-B法標(biāo)準(zhǔn)操作程序涂布菌懸液和貼Etest試條，放35℃培養(yǎng)24 h，觀察CCCP對(duì)IMP和MPM的MIC的逆轉(zhuǎn)作用。當(dāng)存在CCCP時(shí)IMP和MPM的MIC值比缺乏時(shí)相應(yīng)的MIC下降至原值的1/3，說明提示主動(dòng)外排機(jī)制存在。

1.2.2 基因檢測(cè)方法 acrAB的循環(huán)條件：預(yù)變性94℃-5 min、變性94℃-30sec、退火58℃(54℃)-30sec、延伸72℃-40sec、再延伸72℃-10 min,共循環(huán)35周。純水為陰性對(duì)照。耐藥基因檢測(cè)試劑盒由上海生物工程公司提供。應(yīng)用PCR方法，并用瓊脂糖凝膠電泳成像，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并采集圖像。引物序列見下表1。

表1 基因引物序列

1.2.3 外膜蛋白分析 收集200 ml過夜培養(yǎng)的菌液，超聲波破碎細(xì)菌3000轉(zhuǎn)4℃離心10 min去除未破碎的細(xì)菌，離心10000轉(zhuǎn)90 min收集沉淀物。用含十二烷基硫酸鈉緩沖液重新沉淀，室溫放置1 h，重復(fù)該兩步驟得到沉淀物備用。緩沖液與外膜蛋白混勻后煮沸10 min，在電泳儀上進(jìn)行尿素十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果

2.1 CCCP存在與否對(duì)IMP體外抗茵活性的影響 20株亞胺培南和美羅培南耐藥的陰溝腸桿菌中，20均表現(xiàn)為外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，CCCP存在使IMP MIC下降至4個(gè)濃度梯度的菌株有15株，下降至3個(gè)濃度梯度的菌株有5株，CCCP存在使MPM MIC下降至4個(gè)濃度梯度的菌株有12株，其中有12株菌同時(shí)對(duì)兩種藥物有明顯的外排作用。

2.2 外排泵基因擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果 18株同時(shí)檢測(cè)出acrA和acrB基因，目標(biāo)片段為1 194 bp和800 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1。

注：1.acrB 2.acrA 3.陰性對(duì)照 4.Marker(2 000 bp) DNA梯帶

2.3 外膜蛋白分析 外膜蛋白凝膠電泳分析如圖2，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13047有四種蛋白，37 kDa條帶為OmpA、38 kDa條帶為OmpF、41 kDa條帶為OmpC、47 kDa條帶為L(zhǎng)amB，其中38 kDa和41 kDa的條帶與大腸埃希菌的OmpF和OmpC相對(duì)應(yīng)，他們都是與耐藥有關(guān)的膜蛋白。所測(cè)20株陰溝腸桿菌中，有5株38 kDa條帶缺失，7株41 kDa條帶缺失，同時(shí)缺失的有3株。如圖2。

注：1.陰溝腸桿菌膜缺失標(biāo)本 2.陰溝腸桿菌ATCC13047 3.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖2 外膜蛋白凝膠電泳分析

3 討論

主動(dòng)外排是一種特殊的能量依賴系統(tǒng)，能使進(jìn)入體內(nèi)的藥物蹦出體外，從而使體內(nèi)的藥物濃度不足而導(dǎo)致耐藥。其中AcrAB-TolC[5]的外排系統(tǒng)在革蘭陰性菌多重耐藥過程中發(fā)揮著重要作用，能排出多種結(jié)構(gòu)上不相同的化合物。其他的外排泵也可能有此功能，但是大多數(shù)是不表達(dá)的，Astrid Perez[6]等對(duì)這個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)acrA，acrB和acrR基因的序列和銅綠假單胞菌有很高的同源性，所以外排泵AcrAB-TolC這個(gè)系統(tǒng)在臨床分離菌株多重耐藥中起著重要的作用。S.Pournaras[7]等研究，外排泵表達(dá)在銅綠假單胞菌美羅培南和亞胺培南耐藥中的作用。CCCP為質(zhì)子泵抑制劑的代表制劑，能破壞細(xì)菌跨胞漿膜的質(zhì)子梯度，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失去能量供應(yīng)而起作用。一般認(rèn)為CCCP作用使陰溝腸桿菌對(duì)IMP的MIC下降至1/3，表明細(xì)菌可能存在泵出機(jī)制，我們研究的20株陰溝腸桿菌外排泵表型試驗(yàn)陽(yáng)性，此系統(tǒng)可以將已進(jìn)入細(xì)菌胞質(zhì)的抗菌藥物排出菌體外，使之治療失敗 。說明主動(dòng)外排系統(tǒng)是我們研究本地區(qū)陰溝腸桿菌耐藥的主要機(jī)制。

細(xì)菌的膜蛋白及形成管道是細(xì)菌與外界進(jìn)行交流的路徑，也是抗生素透過細(xì)菌細(xì)胞膜的重要通道，細(xì)菌膜蛋白的缺失可阻止抗生素進(jìn)入細(xì)菌，從而引起細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥。研究發(fā)現(xiàn)與亞胺培南耐藥有關(guān)的為外膜孔蛋白(OprD2)，外膜蛋白孔道是小分子的亞胺培南選擇性快速進(jìn)入菌體的特異性通道，也允許帶有陽(yáng)性電子基團(tuán)的各種糖類及堿性氨基酸非特異擴(kuò)散。不僅能形成亞胺培南的特異結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸為亞胺培南的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。外膜通透性下降 ，外膜蛋白的改變或減少 ，使抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌的通道減少或缺失，本研究20株耐碳青霉烯類藥物的陰溝腸桿菌有9株膜蛋白缺失，其中有5株38 kDa條帶缺失，7株41 kDa條帶缺失，同時(shí)缺失的有3株，oprD2 基因缺乏無(wú)，提示蛋白基因缺失不是本組耐藥的主要原因，但不排除因基因突變或基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致陰溝腸桿菌對(duì)IMP耐藥。

總之，陰溝腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物耐藥情況及對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥性機(jī)制復(fù)雜，主動(dòng)外排機(jī)制存在是其重要的耐藥基理。膜孔蛋白基因缺失也與其有重要的關(guān)系。

[1]Jacoby GA.AmpC beta-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2009,22(1)：161.

[2]洪秀華.臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2004.224.

[3]扈會(huì)整，劉 婧,劉漢芳.對(duì)多重耐藥黏質(zhì)沙雷菌的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用模式的初步研究[M].臨床檢驗(yàn)雜志，2012，5(30)390.

[4]Jean SS,Hsueh PR.High burden of antimicrobial resistance in Asia[J].Int J Antimicrob Agents,2011,37(4):291.

[5]Doi Y,Yokoyama K.Yamane K，et al．Plasmid-mediated 16S rRNA methylasein Serratia marcescens conferring high-level resistanceto aminog1ycosides[J]．Antimicrob Agents Chemother，2004，48(2)：491．

[6]Astrid perez,Delia Canle,Cristina Latasa,et al.Cloning,nucleotide sequencing,and analysis of the AcrAB-ToLC efflux pump of Enterobscter cloacae and determination of its involvement in antibiotic resistance in a clinical isolate[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2007,51(9):3247.

[7]Poumaras S,Manaati M, Spanakis N,et al.Spread of efflux pump overexpressing,non-metallo-B-lactamase-producing,meropenem-resistant but ceftazidime suscepyible Pseudomonas aeruginosa in a region with blaVIM[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2005,56:(4):761.

1007-4287(2016)12-2097-03

扈會(huì)整(1972-),女，副主任技師，檢驗(yàn)科主任，研究方向:臨床微生物檢驗(yàn)與分子診斷。

2016-03-12)