舒冬梅，王德良，宋緒磊，尚柯

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015)

常壓室溫等離子體誘變(ARTP)及高通量篩選高產(chǎn)蛋白酶米曲霉的初探

舒冬梅1，王德良2*，宋緒磊2，尚柯1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015)

為提高醬油發(fā)酵菌種米曲霉的蛋白酶活力，采用實(shí)驗(yàn)室保藏菌種H0米曲霉為誘變出發(fā)菌株，對H0菌株進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變(ARTP)，誘變條件：功率120 W；氣流量10 L/min；10個時間梯度處理。結(jié)果表明：當(dāng)誘變時間為140 s時，致死率接近90%，此時為最佳誘變時間。利用大豆球蛋白作為選擇培養(yǎng)基關(guān)鍵因子進(jìn)行初篩和96孔板高通量復(fù)篩，選出3株高蛋白酶活力菌株H5，H12，H15，并且經(jīng)過福林酚法驗(yàn)證。最終篩選出米曲霉菌株H15具有高蛋白酶活力：酸性、中性、堿性蛋白酶活力分別為192.35，1816.31，3774.82 U/g，比出發(fā)菌株H0分別提高17.49%，19.08%，10.66%。

常壓室溫等離子體誘變(ARTP)；高通量篩選；蛋白酶活力

醬油的釀造是以微生物為動力，將原料中的蛋白質(zhì)、糖類、脂類等經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，生成多糖、單糖、氨基酸、多肽、酯類、風(fēng)味物質(zhì)等的一系列過程。目前醬油微生物中研究較多的微生物是米曲霉，主要是因?yàn)槊浊巩a(chǎn)生的酶系豐富并且各種酶系綜合作用對醬油風(fēng)味的形成起重要作用，其中起關(guān)鍵作用的是蛋白酶，米曲霉分泌的蛋白酶使原料中的蛋白質(zhì)降解生成氨基酸，提高醬油氨基酸含量[1]。目前我國大多數(shù)醬油廠采用滬釀3.042以及經(jīng)過誘變后選育的新菌株，但是其蛋白酶活力依然不夠高，導(dǎo)致我國醬油原料蛋白利用率在80%左右，而日式醬油這個指標(biāo)已經(jīng)達(dá)到90%[2]。

米曲霉菌種的誘變方法包括物理、化學(xué)方法，前人對于米曲霉菌種誘變方法有多種[3-7]。袁艷玲等人以米曲霉Y0為出發(fā)菌株，通過紫外線與DES復(fù)合誘變，0.4%干酪素培養(yǎng)基初步篩選，獲得1株高產(chǎn)中性蛋白酶菌株H2-5，其中性酶活力為2158 U/g，經(jīng)10代培養(yǎng)，菌株中性蛋白酶活力具有良好的遺傳穩(wěn)定性[8]。另外，近幾年ARTP(常壓室溫等離子體)誘變方法應(yīng)用的興起為微生物誘變選育提供了新的方法和思路。由于ARTP誘變產(chǎn)生等離子體均勻，射流溫度低，需氦氣裝置，操作簡便，對細(xì)胞與生物大分子作用明顯等優(yōu)勢[9,10]，此方法應(yīng)用廣泛，如化學(xué)凈化劑、熱敏感性醫(yī)療儀器消毒以及生物方面[11]。研究已報道其應(yīng)用于酵母、大腸桿菌、刺糖多孢菌、米曲霉等微生物誘變并取得良好效果[12-15]。本試驗(yàn)在參考各種文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐創(chuàng)新試驗(yàn)方法，利用新型ARTP誘變育種方法誘變米曲霉，采用透明圈法和96孔板法建立高通量篩選突變菌株的方法，并獲得高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉突變株，提高米曲霉分解蛋白的能力，從而提高醬油中氨基酸含量，提高醬油質(zhì)量和國際競爭力。

1 材料和方法

1.1 菌株

米曲霉(Aspergillusoryzae)H0菌株為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑與儀器

大豆球蛋白 百靈威公司；實(shí)驗(yàn)室制麥汁、茚三酮、果糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、碘酸鉀、福林酚試劑(均為分析純) Bitopped 公司。

恒溫生化培養(yǎng)箱，水浴鍋(控溫精度±0.1 ℃) 北京天林恒泰科技有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ARTP-II型ARTP誘變育種機(jī) 無錫源清天木生物科技有限公司；渦旋儀MVS-1 北京東方開物科學(xué)器材有限公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1700可見分光光度計 島津公司；PHS-3C pH計 雷磁有限公司；恒溫電子天平AL204 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制和滅菌

菌種保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基。

大豆球蛋白篩選培養(yǎng)基[16]：大豆球蛋白1 g，磷酸二氫鈉1.07 g，磷酸氫二鈉1 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌30 min。

0.1%干酪素培養(yǎng)基：干酪素1 g，磷酸二氫鈉1.07 g，磷酸氫二鉀0.36 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.002 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌 30 min。

麩曲培養(yǎng)基：250 mL的三角瓶，裝料量為麩皮15 g,水15 mL，自然pH，121 ℃滅菌30 min。

1.4 氨基氮測量試劑盒溶液

顯色劑：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)20 g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)12 g，超聲溶解，加入茚三酮1.0 g和果糖0.6 g(精確至0.01 g)，混勻，用水溶解并定容至200 mL。將溶液貯藏在棕色瓶中，放置4 ℃冰箱保存，1周內(nèi)使用有效。

稀釋溶液：稱取碘酸鉀(KIO3)2 g(精確至0.01 g)溶于620 mL水中，超聲溶解，加入99.7%乙醇380 mL，混勻，于4 ℃貯存。

甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.072 g/L)：稱取甘氨酸0.1072 g，用水溶解并定容至100 mL，于0～5 ℃貯存。

甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，用水稀釋至100 mL。該標(biāo)準(zhǔn)使用液含游離氨基氮2 mg/L，使用時現(xiàn)配制。

1.5 生長曲線繪制

將米曲霉從試管斜面轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h。將活化好的米曲霉用接種環(huán)接3環(huán)到裝有已滅菌12°麥汁的三角瓶中，自保藏斜面中挑取3環(huán)米曲霉孢子接入裝有10 mL無菌麥汁培養(yǎng)基的試管中，搖勻，制成孢子懸液，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化24 h。將10 mL菌懸液倒入裝有300 mL無菌麥汁培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻，制成孢子懸液，于28 ℃培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)。

取14個2 mL的離心管，稱重并分別記錄離心管的重量，精確到0.0001 g。吸取1 mL的12°麥汁和200 μL的1.5×105的活化菌液，置于28 ℃搖床培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的第0，4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，48，52，56 h取出相應(yīng)標(biāo)號的離心管，置于4 ℃冰箱保存。待全部離心管取出，統(tǒng)一8000 r/min，離心15 min。60 ℃烘干3 h，稱量重量，精確到0.0001 g。

1.6 ARTP誘變

1.6.1 菌懸液制作

將活化好的米曲霉菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)18～24 h是對數(shù)期，本試驗(yàn)采用對數(shù)期36 h時的米曲霉，將對數(shù)期的米曲霉用0.8%生理鹽水調(diào)其濃度，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，將菌濃度調(diào)至1×106～1×108cfu/mL。本試驗(yàn)最終米曲霉菌孢子濃度為2×106cfu/mL。將配制的2×106cfu/mL孢子懸浮液取95 μL，取50%甘油5 μL，兩者均勻混合，以保護(hù)米曲霉孢子。

1.6.2 ARTP照射劑量的確定

采用氦氣為工作氣體，使載片與等離子體發(fā)生器射流出口間距約為2 mm，功率為120 W，氣流量10 L/min，對10 μL孢子(106cfu/mL)懸液進(jìn)行誘變，處理時間設(shè)置為0，20，60，80，100，120，150，180，210，240 cfu/mL，稀釋孢子懸液為2×104，2×103，2×102cfu/mL，取 100 μL各稀釋倍數(shù)孢子懸浮液涂布選擇培養(yǎng)皿，28 ℃培養(yǎng)3天計數(shù)，計算致死率(3個重復(fù)的平均值)。

1.7 初篩方法

挑選ARTP誘變140 s的平板上的菌落點(diǎn)種于大豆球蛋白初篩選培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h觀察記錄透明圈和菌落大小，計算出K值。挑取K值較大并且孢子數(shù)較多的菌落接種于馬鈴薯試管斜面培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)72 h，試管內(nèi)布滿淡綠色米曲霉菌絲停止，然后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 高通量復(fù)篩菌種

1.8.1 高通量復(fù)篩菌種的培養(yǎng)

將初選的15個于菌株P(guān)DA平板上培養(yǎng)72 h，制備每個菌株的菌懸液，菌濃度為2.5×106cfu/mL。采用18 cm×18 mm的試管加入1～15號誘變菌株菌懸液1 mL和1 mL 0.1%干酪素培養(yǎng)基，以試管中加入2 mL為對照試驗(yàn)，每個處理重復(fù)3次。

于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱搖床培養(yǎng)36 h后，從每個試管中取出40 μL液體置于96孔板中，加入10 μL發(fā)色劑，100 ℃水浴準(zhǔn)確加熱16 min，在(20±0.1) ℃水浴中冷卻20 min。再各加入稀釋溶液50 μL，充分混勻。用空白試管水調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，于波長570 nm下測量吸光度，測量應(yīng)在30 min內(nèi)完成。

樣品中的α-氨基氮含量按下式計算：

式中：X為麥芽汁的α-氨基氮含量，mg/L；A1為樣液的平均吸光度；A2為甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的平均吸光度；2為甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液中α-氨基氮的含量，mg/L；n為樣液的稀釋倍數(shù)。

1.8.2 高通量復(fù)篩方法的驗(yàn)證

采用福林酚法對高通量復(fù)篩出的H5，H12，H15 3個菌株進(jìn)行蛋白酶活力測定[17]。

1.9 突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將總酶活力高的突變菌株在麩曲培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)9次，培養(yǎng)條件為30 ℃，60 h。依次稱取一定質(zhì)量的第1，3，5，7，9代種曲的酸性、中性、堿性蛋白酶活力進(jìn)行測定，檢測突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉生長曲線繪制

圖1 米曲霉菌絲Fig.1 Aspergillus oryzae hypha

圖2 米曲霉菌株的生長曲線Fig.2 Growth curve of Aspergillus oryzae

由圖2可知，0～12 h米曲霉生長處于遲緩期(停滯期)；16～48 h菌體生長迅速，處于對數(shù)生長期；52～60 h 處于平衡期。

微生物生長曲線是以微生物數(shù)量(活細(xì)菌個數(shù)或細(xì)菌重量)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制的曲線。典型的微生物生長曲線包括四個時期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。一般來說，大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速度都很快，它的生長曲線是以細(xì)菌數(shù)目為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)。然而霉菌在液體培養(yǎng)時(150 r/min)大量菌絲生長會相互交織成球或塊狀，從而統(tǒng)計微生物個數(shù)或測定OD值不能反映霉菌的各個生長時期，因此，霉菌的生長曲線制作采用其生長量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)。

2.2 致死率曲線

采用平板活菌計數(shù)法繪制米曲霉菌株的ARTP誘變致死率曲線，ARTP誘變時間與致死率的關(guān)系曲線見圖3。

圖3 ARTP誘變時間與致死率的關(guān)系曲線Fig.3 Relation between ARTP mutation time and lethality

由圖3可知，等離子體對米曲霉菌株的致死率有明顯劑量效應(yīng)關(guān)系，隨時間延長，在1～100 s范圍內(nèi)致死率迅速增加；誘變時間為100 s時，致死率達(dá)到89.12%；140 s時致死率達(dá)到91.22%；200 s時其接近100%。為獲取較高的正突變率、較高蛋白酶活力菌株，本試驗(yàn)將致死率設(shè)定為90%以上[18]，因此，選取140 s為ARTP誘變時間。

2.3 初篩結(jié)果

誘變前后米曲霉在初選培養(yǎng)基上生長見圖4和圖5。

圖4 誘變前米曲霉在初選培養(yǎng)基上生長 Fig.4 Growth of Aspergillus oryzae on initial screening culture medium before mutation

圖5 誘變后米曲霉在初選培養(yǎng)基上生長Fig.5 Growth of Aspergillus oryzae on initial screening culture medium after mutation

測量值D(cm)d(cm)K對照0.90.81.13H11.21.11.09H20.60.51.20H30.80.71.14H41.10.91.22H51.40.72.00H60.60.51.20H710.91.11H80.90.81.13H91.40.81.75H101.50.91.67H111.30.81.63H121.50.81.88H131.10.61.83H141.20.91.33H151.50.72.14

ARTP誘變后菌種有正突變，菌落長勢好并且K值比對照值大；有負(fù)突變，菌落生長速度慢且K值比對照值小，將負(fù)突變的菌株舍棄，正突變菌株測量其菌落直徑和透明圈直徑并且計算K值。由表1可知，突變菌株H5，H12，H15 3個菌株的K值較大，分別為2.00，1.88，2.14，其中菌株H15的K值為2.14，最大。僅僅依據(jù)初篩培養(yǎng)基的K值不能最終確定米曲霉蛋白酶活的高低，還需進(jìn)一步采用蛋白酶活測定方法驗(yàn)證，確定蛋白酶活力高的菌種。

2.4 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of glycine

甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線是甘氨酸不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儀器與試劑體系響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。建立甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線是為了推導(dǎo)待測物的濃度。在分析食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行物質(zhì)定量分析，一般情況下標(biāo)準(zhǔn)工作曲線呈直線分布。只有標(biāo)準(zhǔn)曲線與校正曲線重合度越好的條件下，測量結(jié)果越準(zhǔn)確，這樣才可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線來代替校正曲線。由圖6可知，甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1677x+0.0643，R2=0.992，甘氨酸含量與吸光值的關(guān)系幾乎呈線性關(guān)系，并且相關(guān)性較好，可以用此標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定待測物的α-氨基酸含量。

2.5 復(fù)篩結(jié)果

圖7 菌株高通量復(fù)篩Fig.7 High-throughput for secondary screening of strain

菌株酸性蛋白酶活中性蛋白酶活堿性蛋白酶活H0163.721525.283411.19H5197.481536.943486.25H12169.421603.593724.56H15208.431792.793825.36

由圖7可知，采用吸光度法測定α-氨基氮含量，根據(jù)甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到α-氨基氮含量在0～10 mg/L的范圍內(nèi)，吸光值在0～1.6范圍內(nèi)，吸光度隨其濃度增大而增大，并且遵循y=0.1677x+0.0643(R2=0.992)直線關(guān)系。米曲霉蛋白酶活越高，分解酪蛋白變成α-氨基酸的含量就越高，α-氨基酸與茚三酮反應(yīng)。所以，可以依據(jù)米曲霉與酪蛋白反應(yīng)后測得的吸光值來判斷米曲霉的綜合蛋白酶活力。由表2可知，ARTP誘變后菌H5，H12，H15菌株總蛋白酶活力明顯高于出發(fā)菌株H0菌株。菌株H5的酸性、中性和堿性蛋白酶活力分別為197.48，1536.94，3486.25 U/g；H12的三種蛋白酶活分別為169.42，1603.59，3724.56 U/g；H15的3種蛋白酶活分別為208.43，1792.79，3825.36 U/g。根據(jù)米曲霉酶活力測定，最終3個菌株的蛋白酶活與采用96孔板篩選結(jié)果一致，即H5，H12，H15菌株總蛋白酶活力明顯高于出發(fā)菌株H0并且高于其他菌株。

2.6 米曲霉遺傳穩(wěn)定性檢測

經(jīng)過1～9代傳代培養(yǎng)，種曲制備和福林酚法測定蛋白酶活力等步驟來考察菌株的遺傳穩(wěn)定性。

圖8 H5菌株遺傳穩(wěn)定性Fig.8 Genetic stability of strain H5

由圖8可知，菌株H5的酸性蛋白酶活力從197.48 U/g降至185.12 U/g；中性蛋白酶活力從1536.94 U/g降至1247.52 U/g；堿性蛋白酶活力從3486.25 U/g降至3317.22 U/g。

圖9 H12菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.9 Genetic stability of strain H12

由圖9可知，菌株H12的酸性蛋白酶活力從169.42 U/g升至175.89 U/g；中性蛋白酶活力從1603.59 U/g降至1580.42 U/g；堿性蛋白酶活力從3524.56 U/g降至3527.98 U/g。

圖10 H15菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.10 Genetic stability of strain H15

由圖10可知，菌株H15的酸性蛋白酶活力從208.43 U/g升至192.35 U/g；中性蛋白酶活力從1792.79 U/g升至1816.31 U/g；堿性蛋白酶活力從3825.36 U/g升至3774.82 U/g。

綜合3個菌株的3種蛋白酶活的變化趨勢可知，H5菌株的3種蛋白酶活力都有下降的趨勢，并且中性和堿性蛋白酶力下降大，分別下降289.42，169.03 U/g；H12菌株的3種蛋白酶活力相對較穩(wěn)定，酸性和堿性蛋白酶活力下降，中性蛋白酶活下降，但數(shù)值變化都不大(<40 U/g)；H15菌株的3種蛋白酶活都比較高，并且傳代培養(yǎng)后，蛋白酶活力穩(wěn)定性較好，波動范圍在51 U/g之內(nèi)，并且H15菌株的酸性蛋白酶活力最終為192.35 U/g，增長率為17.49%；中性蛋白酶活力1816.31 U/g，增長率為19.08%；堿性蛋白酶活力3774.82 U/g，增長率為10.66%。3種蛋白酶活力遺傳穩(wěn)定性較好，波動范圍較小且綜合蛋白酶活力高于菌株H5和H12，所以，最終篩選出菌株H15為實(shí)驗(yàn)室出發(fā)菌株發(fā)酵醬油，進(jìn)一步探索菌株的其他特性。

3 結(jié)論

采用96孔板高通量篩選蛋白酶活力較高菌株的方法與國家標(biāo)準(zhǔn)采用的福林酚法測定蛋白酶活力結(jié)果一致，96孔板高通量篩選蛋白酶活力可作為一種復(fù)篩方法，為高蛋白酶活力米曲霉篩選提供了一種簡便、快速、相對準(zhǔn)確的方法。

ARTP誘變米曲霉菌株H0具有良好效果，時間為140 s時其致死率接近90%。

通過初篩和復(fù)篩，選育出米曲霉菌種H15，其酸性蛋白酶活力最終為192.35 U/g，中性蛋白酶活力為1816.31 U/g，堿性蛋白酶活力為3774.82 U/g，分別比出發(fā)菌株H0增長17.49%，19.08%，10.66%，為后續(xù)醬油生產(chǎn)提供了較高蛋白酶活力米曲霉菌種。本試驗(yàn)為米曲霉菌種誘變選育提供了新方法的理論參考，并且構(gòu)建了高蛋白酶活力菌株高通量篩選方法，為醬油釀造提供具有高蛋白酶活力的菌種。

[1]陳紅梅,潘力.米曲霉3.042種曲蛋白酶特性研究[J].中國調(diào)味品,2009,34(3):63-71.

[2]徐德峰,趙謀明.中國醬油菌株 AS 3.951的改良現(xiàn)狀與思考[J].中國調(diào)味品,2009,34(5):32-38.

[3]Yasuhara A, Ogawa A,Tanaka T,et al.Production of neutral protease fromAspergillusoryzaeby a novel cultivation method on a microporous membrane[J].Biotechnology Techniques, 1994,8(4):249-254.

[4]鄧靜,吳華昌,吳明霞,等.米曲霉產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化[J].中國釀造,2008,27(12):51-53.

[5]孫春華.米曲霉菌株的誘變選育及其制劑的應(yīng)用研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[6]唐潔.利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行米曲霉新菌株的選育[D].成都：西華大學(xué),2007.

[7]韓志雙,劉軍,郇阿梅,等.應(yīng)用基因組改組技術(shù)選育米曲霉酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株[J].中國調(diào)味品,2015,40(1):18-22.

[8]袁艷玲,楊生玉,錢深,等.米曲霉中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的復(fù)合誘變選育[J].科技信息,2013,15(1):69-58.

[9]Li H P, Li G, Sun W T. Radio-frequency,atmospheric-pressure glow discharges:producing methods,characteristics and applicationsin bio-medical fields[C].Complex Systems: 5th International Workshop on Complex Systems. AIP Conference Proceedings, 2008,98(2):584-591.

[10]Li G, Li H P, Wang L Y, et al. Genetic effects ofradio-atmospheric pressure glow discharges with helium[J].Appl Phys Lett, 2008, 92(22):221504.

[11]Laroussi M. Nonthermal decontamination of biological media by atmospheric-pressure plasmas: review,analysis, and prospects[J].IEEE Transactions on Plasma Science, 2002, 30(4): 1409-1415.

[12]王方方,孫沛勇,銀會娟,等.常壓室溫等離子體快速誘變酒精酵母及其突變株的特性研究[J].中國釀造,2013,10(8):117-119

[13]Liu Rongming, Liang Liya, Ma Jiangfeng, et al. An engineeringEscherichiacoli mutant with high succinic acid production in the defined medium obtained by the atmospheric and room temperature plasma[J].ProcessBiochemistry, 2013, 48(11): 1603-1609.

[14]萬青,曹偉佳,張常青,等.常壓室溫等離子體誘變高效利用木糖產(chǎn)丁二酸菌株[J].生物工程學(xué)報,2013,29(11):1692-1695.

[15]陳錫劍,陳建華.常壓室溫等離子體誘變選育高產(chǎn)曲酸米曲霉[J].化學(xué)與生物工程,2015,32(5):52-60.

[16]高獻(xiàn)禮,趙斯薇,孫鵬飛,等.醬油渣蛋白質(zhì)的分離、鑒定和氨基酸組成特征研究[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(10):2512-2516.

[17]SB/T 10317-1999，蛋白酶活力測定法[S].

[18]范新蕾,肖成建,顧秋亞,等.ARTP誘變選育葡萄糖氧化酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].工業(yè)微生物,2015,45(1):15-19.

Initial Study on High Proteinase-producing Aspergillus oryzae with ARTP Mutation and High-throughput Screening

SHU Dong-mei1, WANG De-liang2*, SONG Xu-lei2, SHANG Ke1

(1.College of Food Science and Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China)

To increase the proteinase activity ofAspergillusoryzaeduring the brewing of sauce, takeAspergillusoryzaestrain H0 from laboratory as the starting strain, and then ARTP mutation of strain H0 is carried out. The process conditions are as follows: power is 120 W, air flow volume is 10 L/min, 10 time gradient. The results show that the lethality is about 90% as the mutation time is 140 s, and it is the best time. Three strains such as H5, H12, H15 are selected by initial screening(take glycinin as the key factor in the selectivity culture medium) and high-throughput secondary screening (by 96 hole plate), and checked by Folin-phenol method. Eventually,Aspergillusoryzaestrain H15 with high proteinase activity is selected; its acidic, neutral and alkaline proteinase activity is 192.35, 1816.31,3774.82 U/g respectively, which is increased by 17.49%, 19.08%,10.66% respectively compared with the starting strain H0.

ARTP; high-throughput screening; proteinase activity

2016-06-08 *通訊作者

科技部科研院所基金項(xiàng)目(2014EG111217)

舒冬梅(1988-)，女，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.014

1000-9973(2016)12-0067-07