高琴，宗凱，楊捷琳*， 潘良文

(1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，合肥 230022)

食品及調(diào)味品中罌粟成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法

高琴1，宗凱2，楊捷琳1*， 潘良文1

(1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，合肥 230022)

針對(duì)食品及調(diào)味品非法添加罌粟成分的檢測需求，針對(duì)罌粟小檗堿橋酶基因設(shè)計(jì)了TaqMan特異性引物和探針，并建立了食品及調(diào)味品樣品前處理和DNA提取方法，建立了食品及調(diào)味品中罌粟成分TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，方法檢出限為0.01%，靈敏度為10 pg。與普通 PCR法和SYBR Green等熒光染料法相比，TaqMan探針法具有更好的特異性，檢出限更低，結(jié)果判讀直觀無污染。方法的建立可作為食品及調(diào)味品中非法添加罌粟成分的檢測鑒定方法，也可為其他與罌粟相關(guān)的方法研究提供借鑒和參考。

罌粟；食品；調(diào)味品；TaqMan 實(shí)時(shí)熒光PCR

近年來，多地傳出火鍋底料中加入罌粟殼的報(bào)道，國家衛(wèi)計(jì)委及工商部雖已加強(qiáng)管理，但屢禁不止。仍有商家為了牟取利益，不惜違法亂紀(jì)，在調(diào)料中加入罌粟成分或是未經(jīng)滅活的罌粟種子，給消費(fèi)者的身體健康帶來極大危害。罌粟殼為罌粟科植物罌粟的干燥成熟果殼，具有斂肺止咳、澀腸、止痛的功效，包含嗎啡、可待因、罌粟堿等20多種生物堿。吸食罌粟殼及其制品，會(huì)使吸食者在心理、生理上成癮，對(duì)人體的肝臟、心臟等器官產(chǎn)生毒害作用。因此，罌粟殼在我國被列入麻醉藥品的范圍予以管制，作為非食用物質(zhì)，嚴(yán)格禁止在食品及調(diào)味品中添加使用。

目前罌粟成分的檢測方法主要集中在對(duì)于罌粟來源生物堿成分的檢測[1]，方法主要有薄層層析法、紫外分光光度法[2]、液相色譜法[3-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法[6]。這些方法適用范圍較廣，但僅能對(duì)食物中罌粟殼殘留的生物堿進(jìn)行間接檢測，不能對(duì)罌粟物種來源進(jìn)行準(zhǔn)確定性，不能充分滿足對(duì)罌粟違禁成分的執(zhí)法檢驗(yàn)和整治監(jiān)管的需要。

本試驗(yàn)建立了利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)檢測食品及調(diào)味品中罌粟成分的檢測方法[7]，針對(duì)罌粟特有基因小檗堿橋酶基因(Papaversomniferumberberine bridge enzyme bbe1)設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，提取調(diào)味品總DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，其檢出限和靈敏度分別達(dá)到0.01%和10 pg。同時(shí)，針對(duì)火鍋底料高油脂含量的特點(diǎn)建立優(yōu)化了DNA提取方法。本實(shí)驗(yàn)建立的TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法，相比于以往的普通PCR法和熒光染料法具有無污染，特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，檢出限更低的特點(diǎn)[8]。因此，該方法特別適用于各類調(diào)味品中非法添加罌粟成分的檢測，為食品及調(diào)味品中罌粟成分快速、準(zhǔn)確檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)，為相關(guān)產(chǎn)品的執(zhí)法監(jiān)管提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

桂皮、八角、香葉等7種調(diào)味品，海底撈清湯火鍋底料、燉肉料、排骨鮮味王等8種復(fù)合調(diào)味品均購自上海世紀(jì)聯(lián)華超市。魚腥草、金銀花、紫花地丁等36種藥材均由安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供，見表1。罌粟種子為實(shí)驗(yàn)室保存樣品。

表1 用于罌粟特異性檢測的樣品列表

續(xù) 表

TianGen DP-305植物基因組DNA提取試劑盒、TianGen DP-326深加工食品DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司(TianGen Biotech (Beijing)Co., Ltd., Beijing, China)；引物和探針由輝瑞公司合成(Pfizer, Inc. NYSE：PFE,USA)；TaqMan Gene Expression Master Mix(貨號(hào)：4369016)試劑均購自Applied Biosystems 公司(Applied Biosystems Inc., USA)。

試驗(yàn)相關(guān)儀器：有液氮冷凍研磨儀SPEX 6580 SPEX，USA；紫外分光光度計(jì)Nanovue Plus GE Healthcare，United Kingdom；實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABI Viia7，實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABI 7300 Applied Biosystems Inc.,USA；BP310S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；5415R冷凍離心機(jī) 上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 固體樣品

稱取25 g樣品，用液氮冷凍研磨儀研磨粉碎，稱取200 mg樣品至離心管中，按照1.2.2步驟提取DNA。

1.2.1.2 液體樣品(火鍋底料等油脂含量較多的樣品)

稱取250 g樣品，倒入500 mL的分液濾斗中(可以準(zhǔn)備2個(gè)分液濾斗)，靜置1～2 h，樣品會(huì)分為3層，上層是油脂，中間是水相，下層是固體殘?jiān)?/p>

殘?jiān)幚恚簩堅(jiān)蛛x到100 mL燒杯中，取部分殘?jiān)窖欣徎蛘哐心x中，研磨粉碎，取1～2 mL至離心管中。

水相處理：殘?jiān)蛛x后向分液濾斗中加入100 mL石油醚，震蕩5 min后靜置，收集下層水相，采用大體積濃縮儀(40～60 ℃+抽真空+低速離心)濃縮至1～5 mL，取1 mL至離心管(2 mL)中。

殘?jiān)蜐饪s后水相均采用1.2.2步驟繼續(xù)提取罌粟DNA。

1.2.2 罌粟及香辛料、藥材的DNA提取

采用TianGenDP-305植物基因組DNA提取試劑盒(TianGen DP305-02)提取桂皮、八角、香葉等7種香辛料和魚腥草、金銀花、紫花地丁等36種藥材的DNA。采用TianGen DP-326植物基因組DNA提取試劑盒提取海底撈清湯火鍋底料、燉肉料、排骨鮮味王等8種復(fù)合調(diào)味品中的DNA。提取的DNA采用紫外分光光度儀Nanovue Plus測定濃度和純度，模板量控制在30 ng/反應(yīng)以上。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和熒光PCR擴(kuò)增

針對(duì)罌粟小檗堿橋酶bbe1基因設(shè)計(jì)特異性引物探針，引物及探針序列見表2[9，10]。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表3。

表2 引物及探針序列

表3 SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，90 ℃ 10 s ，58 ℃ 1 min，58 ℃收集熒光，共45個(gè)循環(huán)。

1.2.4 方法特異性

選取常見的香辛調(diào)味料 7種，罌粟近緣植物虞美人，其他植物種類包括魚腥草、金銀花、紫花地丁等共36種，按照1.2.1的方法進(jìn)行前處理后，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測引物特異性。

1.2.5 方法靈敏度

將抽提得到的罌粟種子基因組DNA測定濃度，調(diào)整濃度為100 ng/μL，10倍梯度稀釋成10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/L，10 pg/L，1 pg/L共6個(gè)濃度梯度，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

1.2.6 方法檢出限

將罌粟種子樣品研磨粉碎后，按照重量比分別添加到不含罌粟成分的玉米淀粉基質(zhì)中，制備成100%，10%，5%，2%，1%，0.1%，0.01%，0.001%共8個(gè)梯度含量的樣品，進(jìn)行檢出限試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 引物特異性試驗(yàn)

將7種香辛調(diào)味料和36種常用藥材與罌粟種子一起抽提DNA并純化，抽提情況見表4，以罌粟種子DNA為陽性對(duì)照，以超純水為陰性對(duì)照，利用表2選取的擴(kuò)增體系對(duì)引物進(jìn)行特異性試驗(yàn)。擴(kuò)增結(jié)果見圖1?？梢娨锖吞结槂H對(duì)罌粟種子DNA擴(kuò)增陽性，有明顯S型擴(kuò)增曲線，對(duì)其余7種香辛調(diào)味料和36種常用藥材擴(kuò)增陰性，提示該引物和探針特異性好。

表4 7種香辛料和36種藥材中DNA抽提情況

圖1 實(shí)時(shí)熒光 PCR引物特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)

取10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/L，10 pg/L，1 pg/L 5個(gè)梯度稀釋的模板各1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增Ct值見表5，擴(kuò)增曲線見圖2?？芍S罌粟成分濃度的降低，擴(kuò)增Ct值呈梯度增大，在模板使用量為10 pg時(shí)，有明顯S型擴(kuò)增曲線，檢出靈敏度達(dá)到10 pg。

表5 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)Ct值

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢出限試驗(yàn)

抽提獲得罌粟含量分別為100%，10%，5%，2%，1%，0.1%，0.01%，0.001%共8個(gè)梯度的系列稀釋品，取每孔10 ng用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增Ct值見表6，擴(kuò)增曲線見圖3。

表6 實(shí)時(shí)熒光PCR檢出限試驗(yàn)Ct值

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢出限試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖

注：A:0.001%，B:100%，C:10%，D:5%，E:2%，F(xiàn):1%，G:0.1%，H:0.01%。

由圖3可知，隨著罌粟成分濃度的降低，擴(kuò)增Ct值呈梯度增大，0.01%的模板有明顯的S型擴(kuò)增曲線，檢出限達(dá)到0.01%。

2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR方法在市場樣品檢測中的應(yīng)用

在上海世紀(jì)聯(lián)華超市購買的8種調(diào)味品樣品，提取DNA后測定濃度并擴(kuò)增18S rRNA，見表7。其中1種未提取到可供檢測的DNA。隨后以罌粟種子DNA為陽性對(duì)照，各取100 ng進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，擴(kuò)增曲線見圖4。結(jié)果表明該批超市抽取樣品中未檢出陽性。

表7 8種調(diào)味料DNA抽提情況

圖4 8種調(diào)味料實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了罌粟成分的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法，針對(duì)罌粟物種特異基因設(shè)計(jì)引物和探針，僅需結(jié)合實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖，2 h就能準(zhǔn)確檢測到調(diào)味料中罌粟這一非法添加物的存在，靈敏度達(dá)到10 pg，檢出限達(dá)到0.01%。目前市面上用的香辛料原料或復(fù)配獲得的復(fù)合調(diào)味品品種繁多，其中含有大量的芳香類、色素類、油脂類物質(zhì)，成分復(fù)雜，本試驗(yàn)在樣品前處理上針對(duì)固體樣品(主要是粉狀、塊狀)和液體樣品(主要是油狀、膏狀、糊狀、汁狀)采取不同的前處理方法，以降低上述各類物質(zhì)對(duì)DNA提取的干擾，提高檢測的靈敏度。本試驗(yàn)在引物和探針的特異性試驗(yàn)中，除了選取常用的7種香辛料，還選取了與罌粟具有同源性的36種藥材，表現(xiàn)了引物和探針的良好特異性。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法直接針對(duì)罌粟物種特異DNA，具有較高的檢測靈敏度和準(zhǔn)確度，操作簡便，可作為復(fù)合調(diào)味品中非法添加罌粟成分鑒定的快速檢測方法。同時(shí)，該方法在食品添加劑和調(diào)味品安全領(lǐng)域的檢測把關(guān)上，具有較好的應(yīng)用前景。

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Detection of Papaver somniferum in Food and Condiment by Real-time PCR

GAO Qin1, ZONG Kai2,YANG Jie-lin1*, PAN Liang-wen1

(1.Technical Center for Animal, Plant and Food Inspection and Quarantine, Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135,China；2.Technical Center of Anhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei 230022,China)

A method of real-time PCR is established for detectingPapaversomniferumingredient in food and condiment. The TaqMan specific primers and probes are designed forPapaversomniferumberberine bridge enzyme bbe1. The pre-processing and DNA extraction method is set up for detecting food and condiment samples. The limit of detection (LOD) ofPapaversomniferumingredient in food and condiment for this method is 0.01%. The absolute sensitivity ofPapaversomniferumgenomic DNA detection is 10 pg. Compared with the conventional PCR and SYBR Greenfluorescent dye PCR such as SYBR Green, TaqMan probe method has better sensitivity and specificity, visible results and without pollution. This method could be applied for detectingPapaversomniferumin food and condiment. Meanwhile, it can provide references for otherPapaversomniferumdetection methods.

Papaversomniferum;food;condiment; TaqMan real-time PCR

2016-06-11 *通訊作者

高琴(1983-)，女，上海人，工程師，研究方向：食品及農(nóng)產(chǎn)品檢測。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.026

1000-9973(2016)12-0113-05