王健，顧兵，季珊維，吳瑜，劉季，王騰

(1常熟市第五人民醫(yī)院，江蘇常熟215500；2江南大學(xué)附屬醫(yī)院)

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乳腺癌組織中cyclin D1及MCT-1水平與患者化療療效、臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

王健1，顧兵1，季珊維1，吳瑜1，劉季1，王騰2

(1常熟市第五人民醫(yī)院，江蘇常熟215500；2江南大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 探討乳腺癌組織中細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)與單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT-1)與患者化療療效、臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法 回顧性分析112例晚期乳腺癌患者的臨床資料，免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中cyclin D1與MCT-1的表達(dá)水平，探討二者與化療療效、臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 細(xì)胞核cyclin D1、細(xì)胞膜MCT-1低表達(dá)患者化療后有反應(yīng)者所占比例高于二者同時(shí)高表達(dá)者(P<0.01)。細(xì)胞膜MCT-1表達(dá)與年齡有關(guān)(P=0.02)。二者同時(shí)高表達(dá)為影響化療后無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立不良預(yù)后因素(P<0.05)。結(jié)論 乳腺癌組織中細(xì)胞核cyclin D1與細(xì)胞膜MCT-1同時(shí)高表達(dá)提示化療耐藥及進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)高。

乳腺腫瘤；細(xì)胞周期蛋白D；單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1

乳腺癌是我國(guó)女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率分別居女性惡性腫瘤的第1位和第5位[1]?；熥鳛槿橄侔┑闹饕委熓侄危熜б恢辈荒芰钊藵M意，主要的原因是腫瘤對(duì)化療藥物的耐受。其具體機(jī)制目前尚不完全明晰。Wnt/β-catenin通路被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥有關(guān)，其異常激活伴有多個(gè)下游靶基因的表達(dá)上調(diào)，包括細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)等。最近有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)活化的Wnt/β-catenin通路可上調(diào)糖酵解水平，包括上調(diào)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT-1)的表達(dá)水平，后者被認(rèn)為與腫瘤的耐藥有關(guān)。本研究擬檢測(cè)晚期乳腺癌組織中cyclin D1及MCT-1的表達(dá)，分析二者水平變化的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2005年1月～2010年12月在常熟市第五人民醫(yī)院及無(wú)錫市第四人民醫(yī)院就診的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者112例，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，符合中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范(2015版)[2]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。年齡(68.3±6.7)歲，≤65歲73例、>65歲39例；低、未分化37例，中、高分化75例；雌激素/孕激素受體(ER/PR)陽(yáng)性79例，ER/PR陰性33例；人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陽(yáng)性23例，陰性89例。患者均有可評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移病灶(CT掃描示直徑至少1 cm)。所有病例預(yù)期生存期超過(guò)6個(gè)月。

1.2 治療方法 在接受粗針穿刺活檢后予蒽環(huán)類和(或)紫杉類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療2個(gè)周期，化療方案包括EC(表阿霉素+環(huán)磷酰胺)、TE(多西他賽+表阿霉素)、FEC(5-氟尿嘧啶+表阿霉素+環(huán)磷酰胺)。根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)，將化療療效分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)。其中PD者接受二線化療，CR、PR及SD者接受原方案化療直至PD或者出現(xiàn)不可耐受不良反應(yīng)。無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)定義為腫瘤診斷到CT確認(rèn)腫瘤進(jìn)展的時(shí)間間隔?；颊唠S訪2～12個(gè)月、中位隨訪6個(gè)月，其中化療有反應(yīng)(CR+PR)50例、無(wú)反應(yīng)(SD+PD)62例。

1.3 組織cyclin D1、MCT-1的檢測(cè)方法 選擇所有患者化療前的粗針穿刺石蠟標(biāo)本，切取4 μm厚切片，依次通過(guò)二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，檸檬酸鈉修復(fù)抗原，3% H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，胎牛血清封閉后，兔抗人cyclin D1一抗(1∶50)及鼠抗人MCT-1一抗孵育過(guò)夜，二抗(1∶500)37 ℃孵育30 min，DAB染色。兔抗人cyclin D1一抗(ab40754)及鼠抗人MCT-1一抗(ab90582)購(gòu)自美國(guó)ABCAM公司，羊抗兔二抗(A0208)及羊抗鼠二抗(A0216)購(gòu)自碧云天公司。根據(jù)染色強(qiáng)度分為3個(gè)等級(jí)(+、++、+++)，+為低表達(dá)，++、+++為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。cyclin D1、MCT-1的表達(dá)水平與臨床病理因素之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，單因素分析評(píng)價(jià)各因素與預(yù)后的關(guān)系，有預(yù)后價(jià)值的因素納入Cox多因素回歸分析，評(píng)估其對(duì)PFS的獨(dú)立影響。Kaplan-Meier方法繪制PFS生存曲線，log-rank法檢驗(yàn)曲線間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中cyclin D1及MCT-1的表達(dá)水平與化療療效的關(guān)系 112例乳腺癌患者的腫瘤組織中，細(xì)胞核內(nèi)cyclin D1呈高表達(dá)48例，細(xì)胞膜MCT-1高表達(dá)61例，其余為低表達(dá)(見表1)。化療后有反應(yīng)者50例，其中有同時(shí)存在胞核內(nèi)cyclin D1及細(xì)胞膜MCT-1高表達(dá)者7例；化療后無(wú)反應(yīng)者62例，其中同時(shí)存在細(xì)胞核內(nèi)cyclin D1及細(xì)胞膜MCT-1高表達(dá)者32例。在細(xì)胞核cyclin D1低表達(dá)和高表達(dá)的患者中，化療后有反應(yīng)者分別為36、14例，而化療后無(wú)反應(yīng)者分別為28、34例，兩者化療后有反應(yīng)者所占比例比較，P<0.01。在細(xì)胞膜MCT-1低表達(dá)和高表達(dá)的患者中，化療后有反應(yīng)者分別為33、17例，而化療后無(wú)反應(yīng)者分別為18、44例。兩者化療后有反應(yīng)者所占比例比較，P<0.01。

2.2 乳腺癌組織中細(xì)胞核cyclin D1、細(xì)胞膜MCT-1表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系 見表1。

表1 乳腺癌組織中細(xì)胞核cyclin D1、細(xì)胞膜MCT-1表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系(例)

2.3 腫瘤組織中細(xì)胞核cyclin D1及細(xì)胞膜MCT-1的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 單因素分析顯示，PFS與年齡[HR(95%CI) 1.295(0.795～1.741)，P=0.368]、分化程度[HR(95%CI) 0.685(0.498～1.311),P=0.187]、HER2[HR(95%CI) 2.364 (0.798～3.015),P=0.466]、細(xì)胞核cyclin D1水平[HR(95%CI) 1.258(0.865～2.145),P=0.362]、細(xì)胞膜MCT-1水平[HR(95%CI) 1.663(0.736～3.254),P=0.215]無(wú)關(guān)，與ER/PR及cyclin D1、MCT-1共同高表達(dá)有關(guān)[HR(95%CI) 1.657 (1.187～2.354),P=0.019;HR(95%CI)0.652(0.368～0.849),P<0.01]。進(jìn)一步Cox多因素分析顯示，二者的共同高表達(dá)是影響PFS的獨(dú)立不良預(yù)后因素[HR(95%CI) 0.598(0.457～0.921),P<0.05]。

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)葡萄糖攝取大量增加，即使在有氧條件下，仍選擇糖酵解作為主要的ATP生產(chǎn)方式(Warburg效應(yīng))，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的十大基本特征[3]，是近年腫瘤治療中的研究熱點(diǎn)。Warburg效應(yīng)伴隨著細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的乳酸，后者需要通過(guò)單羧基轉(zhuǎn)運(yùn)體(主要是MCT-1)排出細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MCT-1可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積，進(jìn)一步抑制糖酵解及葡萄糖攝入，并引起細(xì)胞死亡[4]。這些研究結(jié)果證實(shí)，抑制糖酵解能量代謝是富有前景的腫瘤治療手段。

腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制包括藥物外排、DNA損傷修復(fù)、生存相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)、抗凋亡和存活信號(hào)通路激活等[5]，而這一系列生命活動(dòng)均需要大量的持續(xù)的ATP供給[6]，后者主要來(lái)自糖酵解。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷糖酵解過(guò)程可提高耐藥細(xì)胞的化療敏感性[7]，而提高糖酵解水平可提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受[8]，Zhou等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與藥物敏感的腸癌細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞存在更高水平的糖酵解，而在抑制糖酵解、ATP耗盡后，化療敏感性升高，而藥物敏感的腸癌細(xì)胞在外源ATP補(bǔ)給的情況下化療耐藥性升高。關(guān)于乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，抑制糖酵解可逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥以及放療耐受[9]

腫瘤細(xì)胞異?；钴S的糖酵解是癌基因激活以及抑癌基因失活的結(jié)果[4,10]，涉及多個(gè)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的參與[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路激活后，可通過(guò)上調(diào)Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵基因MCT-1[4]和GLUT-1[12]的表達(dá)而促進(jìn)糖酵解。最近一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌的研究[13]證實(shí)，Wnt/β-catenin通路激活后可直接上調(diào)Warburg效應(yīng)另一關(guān)鍵基因PDK1的表達(dá)，這些研究結(jié)果證明了Wnt/β-catenin通路對(duì)糖酵解的關(guān)鍵促進(jìn)作用。

Wnt/β-catenin通路被認(rèn)為促進(jìn)多種腫瘤的化療耐藥，其機(jī)制尚未完全闡明。關(guān)于乳腺癌中Wnt/β-catenin通路與糖酵解之間的關(guān)系，目前尚未見明確的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中細(xì)胞核內(nèi)Wnt/β-catenin通路的cyclin D1水平及細(xì)胞膜MCT-1水平高表達(dá)與化療療效差有關(guān)，提示乳腺癌中可能存在Wnt/β-catenin通路對(duì)糖酵解的正向調(diào)控，而且對(duì)于Wnt/β-catenin通路所誘導(dǎo)的耐藥特性，糖酵解可能起著維持作用。另外，雖然單因素分析提示細(xì)胞核內(nèi)cyclin D1高水平與細(xì)胞膜MCT-1高水平均與PFS無(wú)關(guān)，但多因素分析顯示僅僅二者共同高表達(dá)才是化療失敗的獨(dú)立不良預(yù)后因素，其中可能的解釋除了腫瘤的異質(zhì)性，更可能是Wnt/β-catenin通路與糖酵解均分別涉及腫瘤的多個(gè)生物學(xué)特征，單個(gè)因素在不同水平及不同條件下的激活可能并未導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥，而二者的同時(shí)激活(細(xì)胞核cyclin D1與細(xì)胞膜MCT-1共同高水平表達(dá))更有可能是耐藥的特征，這也驗(yàn)證了Wnt/β-catenin通路對(duì)糖酵解的正向調(diào)控。

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常熟市衛(wèi)生局科技計(jì)劃項(xiàng)目(csws201217)。

王騰(E-mail:drwangteng@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.022

R737.9

B

1002-266X(2016)45-0067-03

2016-08-17)