李均，陳雨思，鄒朝霞

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東珠海519000)

丹酚酸A、B組分配伍對HK-2細(xì)胞CCL2、CXCL10及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

李均，陳雨思，鄒朝霞

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東珠海519000)

目的 觀察丹酚酸A、B組分配伍對HK-2腎小管上皮細(xì)胞腎纖維化模型炎癥趨化因子2(CCL2)、CXC趨化因子配體 10(CXCL10)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探討丹酚酸A、B組分配伍對腎纖維化的治療作用機(jī)制。方法 培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，分為正常組、模型組、丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組。模型組、丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組均制備腎纖維化細(xì)胞模型。丹酚酸A組加入丹酚酸A 20 μmol/L，丹酚酸B組加入丹酚酸B 20 μmol/L，丹酚酸A+B組加入丹酚酸A、B各10 μmol/L，模型組及正常組不干預(yù)。各組均分別培養(yǎng)24、48、72 h。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測上清液CCL2、CXCL10水平，應(yīng)用水溶性四唑鹽法、二硫代二硝基苯甲酸法檢測上清液SOD、GSH水平，應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA水平。結(jié)果 模型組各時點上清液CCL2、CXCL10、GSH、MDA水平均高于正常組，SOD水平均低于正常組(P均<0.05)。丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組各時點上清液CCL2、CXCL10、GSH、MDA水平均低于模型組，SOD水平均高于模型組(P均<0.05)。丹酚酸A+B組各時點上清液CCL2、CXCL10、GSH、MDA水平均低于丹酚酸A組及丹酚酸B組，SOD水平均高于丹酚酸A組及丹酚酸B組(P均<0.05)。結(jié)論 丹酚酸A、B組分配伍可抑制HK-2細(xì)胞炎癥趨化因子CCL2、CXCL10的表達(dá)，在抗炎及抗氧化方面的效果優(yōu)于單一組分應(yīng)用，二者配伍應(yīng)用對腎纖維化具有協(xié)同治療作用。

腎小管上皮細(xì)胞；腎纖維化；丹酚酸；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；炎癥趨化因子；超氧化物歧化酶；丙二醛

腎纖維化是不同類型的慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎病(ESRD)時的病理表現(xiàn)，最終將導(dǎo)致腎單位發(fā)生不可逆的破壞。由于腎臟受到損傷、感染、免疫復(fù)合物的沉積及血液循環(huán)障礙等各種致病因素的刺激，促使腎固有細(xì)胞釋放炎癥趨化因子2(CCL2)、單核細(xì)胞趨化蛋白3 (CCL7)、CXC趨化因子配體 10(CXCL10)等，發(fā)生趨化炎癥細(xì)胞的浸潤，引起腎臟炎癥損傷，促進(jìn)促纖維化因子的釋放，最終導(dǎo)致腎纖維化[1,2]。丹參總酚酸是從唇形科植物丹參的干燥根及根莖中經(jīng)加工制成的提取物，具有增加腎血流量、抑制Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子(JAS/STATs)通路、清除氧自由基、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等作用。丹參提取成分包括脂溶性成分和水溶性成分，其中水溶性成分主要包括丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸C。研究表明，丹酚酸A具有改善腎血流量、降低尿白蛋白的作用；丹酚酸B具有很強(qiáng)的抗氧化及抑制炎癥反應(yīng)的作用，在抗肝腎纖維化方面有重要作用[3]。本課題組前期研究證實，丹酚酸A、B組分配伍能顯著抑制大鼠腎組織 CTGF的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞極性蛋白3(Par-3)的表達(dá)，其效果優(yōu)于丹酚酸A和丹酚酸B單獨應(yīng)用。但是，丹酚酸 A、B組分配伍應(yīng)用對腎臟炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響尚不明確。2015年，我們觀察了丹酚酸A、B組分配伍對人腎小管上皮細(xì)胞CCL2、CXCL10的調(diào)節(jié)及抗氧化作用，探討丹酚酸A、B組分配伍對腎纖維化的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人腎小管上皮HK-2細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物有限公司。丹酚酸A、B(上海融禾醫(yī)藥公司)；人血清白蛋白(美國Sigma合肥博美生物科技有限公司)；人CCL2、CXCL10酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R&D廣州杰特偉生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、細(xì)胞丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 在含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，每1～2天換液1次，每3～5天細(xì)胞傳代1次。在顯微鏡下觀察細(xì)胞長到80%～90%時，用無血清培養(yǎng)基同步化24 h后，隨機(jī)分為正常組、模型組、丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 造模及干預(yù)方法 模型組、丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組均加入含40 mg/mL人血清白蛋白的10%胎牛血清培養(yǎng)基制備腎纖維化細(xì)胞模型，正常組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。丹酚酸A組加入丹酚酸A 20 μmol/L，丹酚酸B組加入丹酚酸B 20 μmol/L，丹酚酸A+B組加入丹酚酸A、B各10 μmol/L，模型組及正常組不干預(yù)。各組均分別培養(yǎng)24、48、72 h。

1.4 細(xì)胞上清液CCL2、CXCL10、SOD、GSH及細(xì)胞內(nèi)MDA水平檢測 收集24、48、72 h時各組的上清液及細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定上清液CCL2、CXCL10水平，應(yīng)用水溶性四唑鹽法、二硫代二硝基苯甲酸法檢測上清液SOD、GSH水平，應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA水平。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞上清液CCL2水平比較 模型組各時點上清液CCL2水平均高于正常組(P均<0.05)。丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組各時點上清液CCL2水平均低于模型組(P均<0.05)，丹酚酸A+B組各時點上清液CCL2水平均低于丹酚酸A組及丹酚酸B組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液CCL2水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與丹酚酸A+B組比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞上清液CXCL10水平比較 模型組各時點上清液CXCL10水平均高于正常組(P均<0.05)。丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組各時點上清液CXCL10水平均低于模型組，丹酚酸A+B組各時點上清液CXCL10水平均低于丹酚酸A組及丹酚酸B組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液CXCL10水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與丹酚酸A+B組比較，#P<0.05。

2.3 各組上清液GSH水平比較 模型組各時點上清液GSH水平均低于正常組(P均<0.05)。丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組各時點上清液GSH水平均高于模型組(P均<0.05)，丹酚酸A+B組各時點上清液GSH水平均高于丹酚酸A組及丹酚酸B組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組上清液GSH水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與丹酚酸A+B組比較，#P<0.05。

2.4 各組上清液SOD水平比較 模型組各時點上清液SOD水平均低于正常組(P均<0.05)。丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組各時點上清液SOD水平均高于模型組(P均<0.05)。丹酚酸A+B組各時點上清液SOD水平均高于丹酚酸A組及丹酚酸B組(P均<0.05)。見表4。

表4 各組上清液SOD水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與丹酚酸A+B組比較，#P<0.05。

2.5 各組細(xì)胞內(nèi)MDA水平比較 模型組各時點上細(xì)胞MDA水平均高于正常組(P均<0.05)。丹酚酸A組、丹酚酸B組、丹酚酸A+B組各時點細(xì)胞MDA水平均低于模型組(P均<0.05)。丹酚酸A+B組各時點細(xì)胞MDA水平均低于丹酚酸A組及丹酚酸B組(P均<0.05)。見表5。

表5 各組細(xì)胞內(nèi)MDA水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與丹酚酸A+B組比較，#P<0.05。

3 討論

腎纖維化是各種慢性腎臟病發(fā)展為ESRD的病理表現(xiàn)，其病理機(jī)制的形成可分為四個階段，首先是細(xì)胞被激活、受損階段，單核細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等被激活并在間質(zhì)釋放促炎因子；第二階段以釋放促纖維化因子為特征；第三階段為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多并降解減少，在間質(zhì)堆積；第四階段為腎單位被破壞，數(shù)量逐漸下降，腎功能持續(xù)降低[2]。彭暉等[4]在體外用人血清白蛋白對近端腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)趨化因子和炎癥細(xì)胞在腎小管聚集，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞進(jìn)一步損傷和破壞，最后進(jìn)展為腎纖維化。因此，炎癥趨化因子的釋放是腎纖維化發(fā)展必不可少的階段，減少炎癥趨化因子的釋放對于防治腎纖維化進(jìn)展具有重要意義。

炎癥趨化因子是一類功能相似、具有趨化作用的分泌性促炎因子，根據(jù)其N端半胱氨酸(Cys)位置的不同，可分為四種：C、CC、CXC、CX3C。其中CCL2屬于CC類，CXCL10屬于CXC類。CC類趨化因子主要由巨噬細(xì)胞核和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，其主要作用是誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的遷移和活化，參與炎癥反應(yīng)。CXC類趨化因子主要參與中性粒細(xì)胞的活化[5]。在腎纖維化的發(fā)展過程中，炎癥趨化因子如CCL2、IL-6等大量產(chǎn)生，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移到損傷部位，大量釋放促纖維化因子，使腎臟固有細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，合成大量的Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積，加重腎小管的破壞[6]。Kashyap等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腎血管高血壓模型中，阻斷CCL2/CCR2通路中的CCR2可以減少巨噬細(xì)胞的浸潤，延緩慢性腎損害的發(fā)展[10]。趙艷等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過p38 MAPK/核因子κB(NF-κB)途徑下調(diào)CCL2的表達(dá)后，可通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用。Furuichi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10在腎缺血-再灌注損傷模型中可促進(jìn)腎小管細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組24、48、72 h時細(xì)胞上清液CCL2、CXCL10水平均高于正常組，提示腎纖維化過程中趨化因子CCL2、CXCL10表達(dá)增加，可能參與了腎纖維化過程。

氧化應(yīng)激在腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用?；钚匝醮?ROS)可使腎單位毛細(xì)血管基底膜脂質(zhì)過氧化增加血管通透性，破壞腎單位的結(jié)構(gòu)屏障和電荷屏障，導(dǎo)致腎損傷。研究發(fā)現(xiàn)，ROS 可以作為第二信使激活NF-κB信號途徑，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤與活化，釋放炎性趨化因子如CCL2、IL-1等，炎癥趨化因子又進(jìn)一步吸引單核巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞趨化遷移到損傷部位，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)腎纖維化的形成[10,11]。SOD、GSH是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，SOD參與O2-轉(zhuǎn)換成H2O2的反應(yīng)，GSH參與H2O2轉(zhuǎn)化成H2O的反應(yīng)，從而發(fā)揮清除體內(nèi)氧自由基的作用。當(dāng)SOD活性下降時，可使脂質(zhì)過氧化生成的MDA增加，MDA能使膜蛋白與磷脂產(chǎn)生交聯(lián)聚合，直接破壞細(xì)胞質(zhì)膜的磷脂雙層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜蛋白的失活，細(xì)胞膜喪失功能，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。付碧瓊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，通過增加SOD活性、減少MDA含量可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)激性衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組 24、48、72 h時SOD、GSH水平均降低，MDA水平均升高，提示腎纖維化過程中能清除自由基的SOD、GSH水平降低，具有細(xì)胞毒性的MDA水平升高，可能與炎性趨化因子共同參與了腎纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

丹參為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。丹參及其復(fù)方制劑在臨床上廣泛用于治療各種心腦血管疾病。丹參的化學(xué)成分包括水溶性成分酚酸類和脂溶性成分二萜醌類，其中水溶性成分均具有酚酸性結(jié)構(gòu)，有抗氧化、改善腦缺血再灌注損傷、抗凝血、抗腫瘤等作用。范華英等[14]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A能減少阿霉素腎病患者腎組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤，降低炎癥因子如血管細(xì)胞黏附分子、CCL2 、IL-6水平，抑制NF-κB表達(dá)。王巍巍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能通過下調(diào)TGF-β的表達(dá)抑制p-p38 MAPK的過表達(dá)，從而減輕馬兜鈴酸誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化及炎細(xì)胞浸潤等病變。

與單一組分應(yīng)用相比，組分配伍在減少炎癥趨化因子的釋放及增加SOD活力的效果優(yōu)于單一成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B、C組分配伍應(yīng)用可降低大鼠CCL2、CCL3蛋白的表達(dá)，改善大鼠腎功能和腎臟病理改變，對腎臟有一定的保護(hù)作用。但目前對丹酚酸A、B組分配伍對腎纖維化的治療作用機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A組、丹酚酸B組各時點上清液CCL2、CXCL10水平均低于模型組，GSH、SOD水平均高于模型組，細(xì)胞MDA水平低于模型組，提示丹酚酸A、B可能通過減少抑制炎癥趨化因子CCL2、CXCL10的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用，從而促進(jìn)抗氧化作用，發(fā)揮腎保護(hù)作用；丹酚酸A+B組各時點上清液CCL2、CXCL10水平、細(xì)胞MDA水平均低于丹酚酸A組及丹酚酸B組，GSH、SOD水平均高于丹酚酸A組及丹酚酸B組，提示丹酚酸A及丹酚酸B組分配伍應(yīng)用可協(xié)同抑制炎癥趨化因子CCL2、CXCL10的表達(dá)，在抗炎及抗氧化方面的效果優(yōu)于單一組分應(yīng)用，丹酚酸A、B組分配伍應(yīng)用對腎纖維化可能具有協(xié)同治療作用。

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Effect of compatibility of salvianolic acid A, B on CCL2, CXCL10 expression and oxidative stress reaction of HK-2 cells

LIJun,CHENYusi,ZOUZhaoxia

(ZhuhaiCampusofZunyiMedicalUniversity,Zhuhai519000,China)

Objective To observe the effect of compatibility of salvianolic acid A and B on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 (CCL2), CXC chemokine ligand 10 (CXCL10) and oxidative stress reaction in renal fibrosis model cells HK-2, and to explore the protective effect of salvianolic acid A and B on renal fibrosis. Methods HK-2 cells were cultured and then were divided into the normal group, model group, salvianolic acid A group, salvianolic acid B group, and salvianolic acid A + B group. The renal fibrosis cell models were all prepared in the model group, salvianolic acid A group, salvianolic acid B group, and salvianolic acid A + B group. The salvianolic acid A group was added with 20 μmol/L salvianolic acid A, the salvianolic acid B group with 20 μmol/L salvianolic acid B, the salvianolic acid A+B group with 10 μmol/L salvianolic acid A, B, and the model group and normal group were not interfered. Each group was cultured for 24, 48, and 72 h. The levels of CCL2 and CXCL10 in the supernatant was determined by enzyme linked immunosorbent assay, the levels of SOD and GSH in supernatant were detected by water WST-1 method and DTNB method, the intracellular MDA levels were detected by TBA.Results The CCL2, CCL10, MDA and GSH levels in the model group were all higher than those in the normal group, and the SOD level was lower than that in the normal group (allP<0.05). The levels of CCL2, CCL10, GSH, and MDA in the supernatant of salvianolic acid B group, salvianolic acid A group and salvianolic acid A+B group were all lower than those of the model group, and the SOD level was higher than that of the model group (allP<0.05). The levels of CCL2, CCL10, MDA and GSH at each time point in the supernatant of salvianolic acid A+B group were lower than those of the salvianolic acid A group and salvianolic acid B group. The levels of SOD were higher than those of the salvianolic acid A and salvianolic acid B group (allP<0.05). Conclusion The compatibility of salvianolic acid A and B can inhibit the expression of inflammatory chemokines CCL2 and CXCL10 in HK-2 cells, the effect of anti-inflammation and anti-oxidation is better than that of single component application, and the combination of the two components has synergistic protective effect on renal fibrosis.

renal tubular epithelial cells; renal fibrosis; salvianolic acid; monocyte chemoattractant protein; inflammatory chemokine; superoxide dismutase; malondialdehyde

國家自然科學(xué)基金資助項目(81260603)。

李均(1969-)，男，博士，教授，主要研究方向為中醫(yī)藥防治慢性腎臟病。E-mail: lijun69-1214@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.002

R285.5

A

1002-266X(2016)46-0007-04

2016-07-26)