□ 聶蓬勃 劉炎艷 莫仁湘 李 凡 康寶萊蕾碩（湖南）天然產(chǎn)物有限公司

GeneQuence試劑盒與國家標(biāo)準(zhǔn)法檢測食品中沙門菌的比較

□ 聶蓬勃 劉炎艷 莫仁湘 李 凡 康寶萊蕾碩（湖南）天然產(chǎn)物有限公司

本文采用美國Neogen公司生產(chǎn)的沙門檢測試劑盒GeneQuence結(jié)合DS2全自動酶標(biāo)免疫分析儀對植物提取物進行沙門菌的檢測，與傳統(tǒng)檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)法進行對比。結(jié)果表明，該方法進行沙門菌的檢測，與傳統(tǒng)檢測方法所得結(jié)果一致性達(dá)到99%。且該方法操作較傳統(tǒng)方法簡便，檢測時間比傳統(tǒng)方法縮短了2 f。

沙門菌；快速檢測；GeneQuence

沙門菌(Salmonella spp.)是一種常見的食源性致病菌，引發(fā)人和動物的疾病，出現(xiàn)腹瀉，急性腸胃炎等疾病。因此控制食品及其原料中的沙門氏菌尤為重要[1]。目前食品中沙門菌的檢測主要采用GB4789.4－2010，該方法需經(jīng)過五個步驟：①預(yù)增菌；②選擇性增菌；③選擇性平板分離；④生化鑒定；⑤血清學(xué)鑒定。該方法工作量大，檢測時間長（需4～7天），易受檢測人員的專業(yè)、經(jīng)驗等多種因素的影響，出現(xiàn)誤判。因此，需尋求一種快速、有效、準(zhǔn)確、簡便的檢測技術(shù)。

Neogen公司生產(chǎn)的沙門試劑盒GeneQuence是基于DNA分子雜交技術(shù)設(shè)計的。該法針對沙門菌核糖體RNA設(shè)計一段寡核苷酸探針，該探針用于與目標(biāo)rRNA結(jié)合，結(jié)合后有顯色反應(yīng)，再經(jīng)過Dynex設(shè)備的光路系統(tǒng)進行讀數(shù)判定結(jié)果[2]。

Dynex DS2?全自動酶標(biāo)免疫吸附（ELISA）分析儀是一款由電腦控制的微孔板處理系統(tǒng)[3]，本文使用該分析儀配套Neogen?沙門菌檢測試劑盒用于沙門菌的快速檢測，該方法具有操作簡單，靈敏度高，檢測時間短的特點，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法進行平行比對，結(jié)果顯示，該方法與GB方法檢測結(jié)果一致。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 樣品

樣品共100批，涵蓋康寶萊蕾碩公司大部分類型的產(chǎn)品，測試樣品及分類清單如下。

樣品類型：綠茶提取物、紅茶提取物、玉米須提取物、生姜提取物、瓜拉那果粉、洋蔥粉、迷迭香提取物和蘋果纖維粉各提取10份的數(shù)量；薄荷葉粉、葛根提取物、小茴香粉和人參提取物各提取5份的數(shù)量；樣品編號分別為1-10、11-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-80、81-85、86-90、91-95、96-100。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

阿伯尼沙門菌（Salmonella abony, NCTC 6017）

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基

BPW緩沖蛋白胨水（陸橋）；SC增菌液（陸橋）；TTB增菌液（陸橋）；XLDA平板（BD）；HE平板（陸橋）；BS平板（陸橋）；TSI斜面（陸橋）。

1.2 儀器設(shè)備

二級生物安全柜：美國Labconco公司；恒溫水浴鍋：德國Julabo公司；Dynex系統(tǒng)：美國Dynex公司；恒溫培養(yǎng)箱：德國Memmert公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 4789.4－2010）

以無菌操作稱取25 g(或25 mL)樣品，置于225 mL的緩沖蛋白胨水中，于（36±1）℃培養(yǎng)8～18 h。輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mLTTB內(nèi)，于（42±1）℃培養(yǎng)18～24 h。同時，另取1 mL,轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于36±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。分別用接種環(huán)取增菌液1 環(huán), 劃線接種于一個BS 瓊脂平板和一個 XLD 瓊脂平板。于36±1 ℃分別培養(yǎng)18 h～24 h，觀察各個平板上菌落生長情況，疑似菌落用API鑒定試劑條進行進一步鑒定[4]。

1.3.2 Dynex方法

第一步：以無菌操作稱取25 g(或25 mL)樣品，置于225 mL的緩沖蛋白胨水中，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h，為待測增菌液。

第二步：按照沙門試劑盒的說明書，分別配制：①裂解試劑：用于目標(biāo)致病菌的裂解，釋放出目標(biāo)待測物rRNA（核糖體RNA）。②雜交溶液：用于目標(biāo)的rRNA捕獲或結(jié)合。③探針溶液：用于與目標(biāo)rRNA結(jié)合與檢測。④洗液：用于清洗微孔。⑤底物溶液,用于顯色反應(yīng)（加入微孔后，與溶液3中標(biāo)記的HRP反應(yīng)顯色）。⑥終止液。

第三步：分別加入100 μL裂解溶液和400 μL待測增菌液至小試管中，混勻后置于（65±2.5）℃水浴中裂解5 min。

第四步：將第二步中配置的溶液和第三步配置的待測樣品裂解液放置在Dynex儀器指定的位置上。

第五步：開啟軟件，按照軟件提示進行自檢，儀器自檢完成后，將自動執(zhí)行加樣，加試劑，孵化，測定等操作，最終自動形成檢測報告。

1.3.3 自然樣品的檢測

對以上共100個自然樣品，分別使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法和Dynex方法進行檢測。

1.3.4 人工污染樣品的檢測

在經(jīng)1.3.3步驟檢測沙門氏菌為陰性的樣品中，選擇12個(每種類型樣品1個)，在其增菌液中添加阿伯尼沙門氏菌（Salmonella abony, NCTC 6017）標(biāo)準(zhǔn)菌株，加入量為10～100 CFU/mL。分別使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法和Dynex方法進行檢測。

表1 國家標(biāo)準(zhǔn)方法和Dynex方法檢測結(jié)果

表2 兩種方法對阿伯尼沙門菌的檢測結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 自然樣品的檢測分析

對100批樣品中12個品種分別使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法和Dynex方法進行檢測，結(jié)果見表1。

由表1可知，100個樣品中，只有72號樣品用Dynex檢測為陽性，而經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)方法確認(rèn)后，為陰性。因此可得知，用Dynex方法和GB方法對比，一致性可達(dá)99%。

2.2 污染樣品的檢測分析

對12個(每種類型樣品1個)添加阿伯尼沙門菌（Salmonella abony, NCTC 6017）標(biāo)準(zhǔn)菌株的污染樣品，分別使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法和Dynex方法進行檢測，結(jié)果見表2。試驗結(jié)果表明，Dynex方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法都能夠有效檢出經(jīng)濃度為10～100 CFU/mL阿伯尼沙門氏菌污染的樣品。兩種方法一致性達(dá)100%，且無假陰性結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

Dynex方法比國家標(biāo)準(zhǔn)方法操作簡便，只需要配置一種培養(yǎng)基—緩沖蛋白胨水。而國家標(biāo)準(zhǔn)方法則需要配制很多種培養(yǎng)基。Dynex方法只需30 h左右即可出結(jié)果，而國家標(biāo)準(zhǔn)方法至少需要4 d。因此Dynex至少可縮短2 d的檢測時間。Dynex方法結(jié)果判讀由機器完成，而國家標(biāo)準(zhǔn)方法需有經(jīng)驗的人員進行判讀。因此Dynex方法可減少由人員造成的誤差。通過對112個樣品進行檢測方法比對，發(fā)現(xiàn)兩種方法的符合率超過99%，因此可證實用Dynex方法進行沙門氏菌的檢測是可靠的。

[1]SG Wilson, S Chan, M Deroo, et al. Development of a Colorimetric, Second Generation Nucleic Acid Hybridization Method for Detection of Salmonella in Foods and a Comparison with Conventional Culture procedure[J].Journal of food science, 1990, 55(5):1394-1398.

[2]袁辰剛，韓偉，謝小鈺，等.沙門氏菌快速測試片在食品檢測中的初步應(yīng)用研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015,6(1):293-298.

[3]田銀芳,王翌明.ELISA方法與國標(biāo)法在檢測鮮奶中沙門氏菌的比較研究[J].中國乳品工業(yè),1998,26(5):32-33.

[4]文其乙,焦新安,劉秀梵.酶免疫方法快速檢測沙門氏菌的研究進展[J].肉品衛(wèi)生,1995(7):27-29.