楊春梅 ，屈云慧，汪國鮮，單芹麗，吳麗芳，阮繼偉，蔣海玉

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所，云南省花卉育種重點實驗室，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 653200 ；3.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟信息研究所，云南 昆明 650205)

芒萁組織培養(yǎng)和快繁技術研究

楊春梅1，2，屈云慧1*，汪國鮮1，2，單芹麗1，2，吳麗芳1，2，阮繼偉1，2，蔣海玉3**

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所，云南省花卉育種重點實驗室，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 653200 ；3.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟信息研究所，云南 昆明 650205)

以孢子為外植體對芒萁進行組織培養(yǎng)。在基本培養(yǎng)基中添加不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對孢子萌發(fā)和孢子體進行誘導。結果表明，孢子體萌發(fā)階段最適培養(yǎng)基組合是1/2MS培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH值 5.8～6.0；原葉體增殖階段，最佳培養(yǎng)基組合為1/2MS + NAA 1.0 mg/L +6-BA 1.5 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L；孢子體的誘導最適培養(yǎng)基組合是1/2MS培養(yǎng)基+ NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L +瓊脂7 g/L。

芒萁；組織培養(yǎng)；快繁技術；孢子體誘導:

蕨類植物是觀葉植物中最具特色的一群，素有“無花之美”的稱號，其株、葉、根、莖、芽、孢子囊群均可觀賞[1]，可做盆景、切花配葉及園林綠化[2-3]。

芒萁[Dicranopterisdichotoma]又稱鐵狼萁，為里白科(Gleicheniaceae)芒萁屬(DicranopterisBernh.)多年生蕨類植物[4-5]。除可供觀賞外，其地上部分及根狀莖均可入藥，具有清熱利尿、解毒消腫、化瘀止血的功效[6]。芒萁植物耐旱、耐瘠薄，地下莖縱橫交錯，深入土層3 m以上，可栽培治理水土流失[7]。由此可見，芒萁具有廣闊的應用前景。

芒萁的繁殖有孢子自然繁殖、營養(yǎng)繁殖和組培快繁。孢子自然繁殖，生長地域受限，加之近年來自然環(huán)境的破壞，孢子自然繁殖很難滿足人們的需要；營養(yǎng)繁殖包括根狀莖、株芽、肥厚的葉耳等營養(yǎng)器官進行繁殖。營養(yǎng)繁殖周期長、系數(shù)低；組織培養(yǎng)繁殖，只需采集少量孢子或一小部分營養(yǎng)器官，就能培育出大量的幼苗，具有所需原材料少、繁殖系數(shù)大的特點，是種苗的有效途徑[8-9]。但芒萁組織培養(yǎng)和快繁技術尚未見報道。

正交試驗不僅可以大大減少工作量，而且還可通過對正交試驗結果進行科學的極差分析和方差分析，得到最優(yōu)組合，這在植物組織培養(yǎng)中有著重要的應用價值[10]。本試驗以孢子為外植體對芒萁進行組織培養(yǎng)，建立快繁體系，為芒萁資源更好地利用提供理論參考。

表1 原葉體增殖階段的L9 (34)因素水平

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試芒萁，取自云南省農(nóng)科院花卉所九溪盆花試驗基地。

試驗于2013年5-11月在云南省農(nóng)科院花卉研究所組培中心(玉溪基地)進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子的收集、消毒 ①孢子的收集：將成熟的孢子連同葉片自植物體上一起剪下，放入潔凈的硫酸紙內(nèi)，放在通風的地方，15 d左右孢子散落，收集成熟的孢子，置于4 ℃冰箱中保存，供培養(yǎng)使用 。 ②孢子的消毒：在超凈工作臺上，用75 %酒精消毒25～30 s左右，無菌水沖 3～4 次；再用 0.1 %升汞消毒4～5 min，無菌水沖 4～5次,備用。

1.2.2 孢子萌發(fā) 以MS、1/2MS 、1/3MS、KnopS 為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂7 g/L 、蔗糖30 g/L，pH值5.8，培養(yǎng)溫度(28±2) ℃， 日光燈光源，光照強度為1000～1500 lx，光照時時間為12 h/d培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d，觀察統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況。

每處理5瓶，每瓶接種孢子60個，重復3次。

1.2.3 原葉體增殖培養(yǎng) 將萌發(fā)成的原葉體分散成小塊，每塊約0.5 cm×0.5 cm，含3～5片原葉體，接種到原葉體增殖培養(yǎng)基上以1/2MS 、1/3MS、KnopS 為基本培養(yǎng)基，分別加入不同質(zhì)量濃度的NAA、6-BA、蔗糖，按正交設計表4因素3水平L9(34)正交試驗設計(表1)，進行原葉體增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d，觀察統(tǒng)計原葉體增殖情況[原葉體增殖率( %)=(40 d后的鮮重/最初的鮮重)×100 %]，每個處理為3瓶，每瓶接種原葉體堆(直徑3～5 mm) 5個，重復2次，記錄原葉體的質(zhì)量。

1.2.4 孢子體誘導 將原葉體分割成1 cm×1 cm大小，接種在1/2MS+不同濃度NAA 0、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L的培養(yǎng)基中，每瓶接種5個原葉體，每處理5瓶，重復3次。60 d后觀察孢子體誘導率。

1.2.5 煉苗與移栽 將置于室溫下放置3～4 d，去蓋，從培養(yǎng)瓶中取出，移栽至腐殖土中，遮陰。試管生根組培苗3～5 cm高時用鑷子從培養(yǎng)瓶取出，清洗掉培養(yǎng)基，盡量避免不要傷根，移植到消毒過的泥炭為基質(zhì)的穴盤中，放人大棚，管理條件：溫度20～ 25 ℃，光強500 lx，遮陰率60 % ，濕度保持在90 %左右，移栽后30 d，成活率可達90 %以上。

1.2.6 培養(yǎng)條件培養(yǎng)室條件 白天溫度25 ℃，夜間21 ℃，散射光，光強300 lx，光照時間12 h/d，濕度80 %。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對芒萁孢子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，5種無機鹽不同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基對芒萁孢子萌發(fā)都有影響，萌發(fā)率在39.8 %～69.7 %。孢子萌發(fā)率最高的是1/2MS，達69.7 %； 孢子萌發(fā)率最低的是MS培養(yǎng)基，為39.8 %。方差分析結果表明，1/2MS培養(yǎng)基、1/3MS培養(yǎng)基和Knop’s低鹽培養(yǎng)基對孢子的萌發(fā)率差異不顯著，說明這3種培養(yǎng)基對芒萁孢子萌發(fā)率的影響無差異；MS培養(yǎng)基與其它3種培養(yǎng)基相比，孢子的萌發(fā)率差異達極顯著。表明孢子的萌發(fā)與無機鹽的質(zhì)量濃度有關，降低培養(yǎng)基中無機鹽的質(zhì)量濃度可促進孢子萌發(fā)。

表2 不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)的影響

注：同列肩標小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05);同列肩標大寫字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)。 Notes:Data followed by different small letters were significantly different at the 0.05 level; Data followed by different capatal letters were significantly different at the 0.01 level.

表3 葉原體增殖試驗結果

注：Ki代表水平i的平均值；*表示差異達0.05顯著水平(F0.05=4.46)。下同。

Notes:Kimeant the average of leveli; *meant 0.05 significant level(F0.05=4.46). The same as below.

2.2 原葉體增殖培養(yǎng)

由表3的分析表明, 4種因子對芒萁原葉體增殖效應的大小依次是培養(yǎng)基>6-BA>蔗糖>NAA。在直觀分析的基礎上對芒萁原葉體增殖進行方差分析，結果(表5)表明，除基本培養(yǎng)基對芒萁原葉體增殖的影響沒達到顯著水平外，其余 NAA、6-BA、蔗糖3個因素均對芒萁原葉體增殖的影響均達到顯著水平(P<0.05)。以上分析結合表3可知，對芒萁原葉體增殖的影響最佳組合為A2B3C1D3,即1/2MS + NAA 1.0mg/L +6-BA 1.5mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂 7 g/L，增殖系數(shù)為5.95。

2.3 不同培養(yǎng)基對孢子體誘導的影響

由表4可以看出，將葉原體接種在1/2MS+不同質(zhì)量濃度NAA培養(yǎng)基中，均可誘導孢子體形成，誘導率25.8 %～91.1 %。誘導率最高是NAA 0.1 mg/L，誘導率91.1 %；最低的是NAA 0.3 mg/L，誘導率25.8 %。經(jīng)方差分析表明，NAA 0.05 mg/L、和NAA 0.1 mg/L對孢體子的萌發(fā)率差異不顯著。表明高濃度的NAA對芒萁孢子體誘導有抑制作用。

3 討 論

芒萁的組培快繁除利用孢子外，還可以利用植株體上的根狀莖、嫩葉、葉柄等作外植體。本研究以孢子為外植體進行組培快繁，實際上是將蕨類自然繁殖轉換到人工可控的環(huán)境中進行繁殖，具有取材容易、不損害母株、容易消毒、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點[11]，是芒萁組織培養(yǎng)的有效方法。

表4 不同培養(yǎng)基對孢子體誘導的影響

蕨類孢子萌發(fā)使用有多種基本培養(yǎng)基。Wang HsinMei，陳龍清以MS為基本培養(yǎng)基誘導孢子萌發(fā)[12-13]； Hirch AM[15]和Teng WT[16]研究表明高鹽濃度的基本培養(yǎng)基會抑制某些蕨類孢子的萌發(fā)，與筆者研究結果一致。

Kwa等[15]認為鳳尾蕨的原葉體在1/2 MS上只能增殖，只有在1/10MS上才能誘導形成孢子體。筆者采用1/2 MS， 同樣獲得孢子體，這可能是芒萁對于大量元素不敏感造成的。

蔗糖在組織培養(yǎng)中一個作用是解決培養(yǎng)基的滲透壓問題[14]，另一個作用是對世代轉換起重要調(diào)控作用[18]。程治英等[19]研究認為，原葉體的分化需要糖的參與，但濃度不宜高，否則影響孢子體的生長。本試驗通過正交試驗，得30 g/L蔗糖有利于葉原體的增殖，與田曉艷等[14]的報道一致。

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(責任編輯 王家銀)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Technique ofDicranopterisdichotomaHance Meristem

YANG Chun-mei1，2，QU Yun-hui1*，WANG Guo-xian1,2，SHAN Qin-li1,2，WU Li-fang1,2，RUAN Ji-wei1,2，JIANG Hai-yu3**

(1.Institute of Flower,Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Yunnan Flower Breeding, Yunnan Kunming 650205, China；2.Yuxi Yunxing Bological Science and Technology Limited Campany，Yunnan Yuxi 653100,China;3.Agricultural Economics and Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Yunnan Kunming 650205,China)

The micropropagation system onDicranopterisdichotomawith spore asexplants was established.The spore bourgeon and sporophyte induction was studied through adding different growth material in minimal medium.The optimum culture medium for spores bourgeon was 1/2 MS+ sucrose 30 g/L + agar 7 g/L，and pH value was 5.8-6.0. The optimum culture medium for prothallus proliferation was 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 7 g/L.And the optimum culture for sporophyte inductio was 1/2 MS+NAA0.0 mg/L +sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L.

Dicranopterisdichotoma； Tissue culture；Rapid propagation technology；Sporophyte induction

1001-4829(2016)12-2955-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.033

2015-05-12

云南省技術創(chuàng)新暨產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金(2015XB015)

楊春梅(1970-)，女，云南元江人，碩士，研究員，主要研究方向為花卉高效繁育技術研究及新品種選育,E-mail:ycm68@yahoo.cn，*為共同第一作者，**為通訊作者。

S682.35

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