趙一，李天明，劉金雷，王崇慧，儀宏，馮惠勇

(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊,050000)

代謝工程改造Corynebacteriumglutamicum生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸

趙一，李天明，劉金雷，王崇慧，儀宏，馮惠勇*

(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊,050000)

以提高L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量為目標(biāo)，采用一次交換兩次同源重組的方法，利用反向篩選標(biāo)記，在敲除了丙酮酸醌氧化還原酶編碼基因(pqo),丙酮酸脫氫酶編碼基因(pdh)和乳酸脫氫酶編碼基因(lldh)的C. glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C. glutamicumΔPPL)基礎(chǔ)上，無(wú)痕敲除了L-蘋(píng)果酸積累支流代謝途徑的2個(gè)關(guān)鍵酶基因：蘋(píng)果酸醌氧化還原酶編碼基因(mqo)和蘋(píng)果酸酶編碼基因(male)，同時(shí)敲入了蘋(píng)果酸分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(transb)，獲得了產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的工程菌株；采用高效液相色譜法檢測(cè)了工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的發(fā)酵產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：C. glutamicum ATCC 13032發(fā)酵后不積累L-蘋(píng)果酸，而工程菌C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale發(fā)酵48 h，積累了12.8 g/L的L-蘋(píng)果酸，工程菌的糖酸轉(zhuǎn)化率為33.18%，為利用C. glutamicum ATCC 13032發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸提供了基礎(chǔ)遺傳資源。

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)；L-蘋(píng)果酸；基因敲除；基因敲入

L-蘋(píng)果酸是一種十分重要的有機(jī)酸, 在食品、醫(yī)藥等工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。L-蘋(píng)果酸可用作食品添加劑，具有抑菌防腐的作用,可延長(zhǎng)香腸和果醬的保存期[1]；在葡萄酒釀造中用于除去酒石酸鹽[2]；作為日化品添加劑,能夠起到潤(rùn)膚和抗皺作用[3]；醫(yī)藥行業(yè)中，在抗疲勞、治療心臟病、保護(hù)肝臟等方面有明顯的作用[4]。

L-蘋(píng)果酸的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法、酶催化法和微生物法[5]?；瘜W(xué)合成法是利用順丁烯二酸為原料經(jīng)過(guò)兩個(gè)步驟合成L-蘋(píng)果酸，此方法存在污染環(huán)境，技術(shù)復(fù)雜，產(chǎn)物不純等缺點(diǎn)[6]。第二種是酶催化法，以富馬酸鹽為原料，利用微生物的延胡索酸酶催化生成L-蘋(píng)果酸，但此方法成本較高，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用受到限制[7-9]。目前工業(yè)上有多種微生物法能夠發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸，如利用黃曲霉(Aspergillus flavus ATCC13697)以葡萄糖為原料，一步發(fā)酵生產(chǎn)蘋(píng)果酸[10-13]；也可以2種微生物聯(lián)合應(yīng)用生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸,如先利用少根根霉菌(Rhizopusahirrizus)將糖質(zhì)類原料發(fā)酵成富馬酸，再用膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)將富馬酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸[14-16]。與化學(xué)合成法和酶催化法相比,微生物轉(zhuǎn)化法效率更高、能耗更低,而且清潔環(huán)保。

Corynebacterium.glutamicum是經(jīng)典食品性安全菌，而且近年來(lái)，C. glutamicum ATCC 13032全基因組測(cè)序的完成和C. glutamicum ATCC 13032的遺傳操作系統(tǒng)的完善，都為利用代謝工程手段對(duì)其進(jìn)行定向改造提供了有利條件，使得C. glutamicum ATCC 13032作為細(xì)胞工廠，越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于化學(xué)品的生物制造[17-20]，因此用C. glutamicum ATCC 13032發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸具有一定的理論及應(yīng)用價(jià)值。C. glutamicum ATCC 13032積累L-蘋(píng)果酸的代謝途徑如圖1所示。

圖1 C. glutamicum ATCC 13032部分代謝途徑Fig.1 The partial metabolic pathways of C. glutamicum ATCC 13032

通過(guò)阻斷乙酸和乳酸形成途徑，提高丙酮酸的合成，以增加L-蘋(píng)果酸合成的底物；通過(guò)阻斷TCA循環(huán)途徑中由L-蘋(píng)果酸到草酰乙酸的代謝途徑，大量積累L-蘋(píng)果酸，使其接近1 mol葡萄糖生成1 molL-蘋(píng)果酸的最大理論摩爾收率，獲得具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值、優(yōu)良性能的工程菌。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存菌株C. glutamicum ΔPPL(實(shí)驗(yàn)室保存菌株)作為出發(fā)菌株，即敲除了丙酮酸醌氧化還原酶基因(pqo),丙酮酸脫氫酶基因(pdh)和乳酸脫氫酶基因(lldh)的工程菌，利用同源重組的原理及蔗糖致死基因(sacB基因)的反向篩選，無(wú)痕敲除了控制丙酮酸和L-蘋(píng)果酸代謝過(guò)程中的支流代謝途徑的關(guān)鍵基因：蘋(píng)果酸酶編碼基因(mqo)和蘋(píng)果酸醌氧化還原酶編碼基因(male)，同時(shí)強(qiáng)化了L-蘋(píng)果酸分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(transb)，獲得了產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒與菌株見(jiàn)表1。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒

1.1.2 試劑

High-Fidelity DNA 聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司；T4DNA ligse購(gòu)自大連寶生物工程公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自大連寶生物工程公司(TARAKA)；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他試劑均為分析純產(chǎn)品，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和菌株培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，調(diào)pH值6.5左右，需要時(shí)加入卡那霉素至終濃度30 mg/L。固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉20 g/L。

CD培養(yǎng)基：1 g/LKH2PO4，3 g/L (NH4)2SO4，1 g/L NH4NO3，0.5 g/L MgSO4，0.2 g/L CaCl2，0.01 g/L Fe2(SO4)3，0.01 g/L MnSO4，0.002 g/L CuSO4，0.001 g/L ZnSO4，0.002 g/L生物素，pH值6.5左右。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：CD培養(yǎng)基，25 g/L葡萄糖，5 g/L NaAce，pH值6.5左右。

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：50 g/L葡萄糖，10 g/L NaAce，3 g/L (NH4)2SO4，1.5 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O，5 g/L (NH4)2SO4，0.2 g/L CaCl2，pH 7.0。

C.glutamicumATCC 13032 在30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，E.coliDH5α在37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad Molecular Imager Gel DOC XR；臺(tái)式高速離心機(jī)，Eppendorf Mini Spin；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Sorvall Evolution RC；酶標(biāo)儀，Bioteke Powerwave；高效液相色譜儀，Agilent 1260 Infinity。

1.2 方法

1.2.1 打靶質(zhì)粒的構(gòu)建

mqo基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建方法為：分別以C.glutamicum ATCC 13032和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因組作為模板，利用PCR擴(kuò)增出待敲除基因mqo的上下游同源臂片段和待敲入的替換基因transb，利用融合PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得目的片段mqoup-transb-do，純化后與pK18mobsacB空質(zhì)粒用Hind III和Not I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物，通過(guò)T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)驗(yàn)證獲得打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmqo::transb。同樣，利用此方法構(gòu)建獲得male基因敲除質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmale，本實(shí)驗(yàn)所用引物如表2所示，下劃線部分為酶切位點(diǎn)序列。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.2 感受態(tài)及電轉(zhuǎn)化方法

大腸感受態(tài)制備參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[21]，谷氨酸棒狀桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備參考《Handbook ofCorynebacteriumglutamicum》[22]。

1.2.3 工程菌株的轉(zhuǎn)化

谷氨酸棒桿菌工程菌株的構(gòu)建是利用負(fù)篩選標(biāo)記通過(guò)2次同源重組的方法進(jìn)行基因敲除來(lái)實(shí)現(xiàn)的，如圖2所示。

圖2 同源雙交換原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of homologous double switch

以獲得突變菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transb為例，首先將pK18mobsacB/Δmqo::transb經(jīng)電轉(zhuǎn)化(電擊條件為，2.5 kV/cm電壓，250 Ω電阻，25 μF電容，2 mm 電擊杯)轉(zhuǎn)入到工程菌C. glutamicumΔPPL感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)的細(xì)胞再在含有0.5%乙酸鈉的液體LB培養(yǎng)基中30 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，再把發(fā)酵液涂布在含有30 μg/mL卡那霉素及0.5%乙酸鈉的LB固體培養(yǎng)基30 ℃恒溫培養(yǎng)48～60 h。

1.2.4 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定

經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證篩選出第1次同源重組的工程菌，即pK18mobsacB/Δmqo::transb經(jīng)同源重組已整合到染色體上。再將其接到含有0.5%乙酸鈉的液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h后，涂布在含有10%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基上，利用蔗糖致死基因sacB基因負(fù)篩選出第2次同源重組的轉(zhuǎn)化子，將其一一對(duì)應(yīng)分別擴(kuò)培到含10%蔗糖和30 μg/mL Kan抗性且含有0.5%乙酸鈉的LB固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d左右。最后挑選在蔗糖板上生長(zhǎng)而Kan板上不生長(zhǎng)的菌落，利用菌落PCR驗(yàn)證篩選出陽(yáng)性工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transb。利用此方法將pK18mobsacB/Δmale轉(zhuǎn)入C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb中，獲得C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale。1.2.5 工程菌株生長(zhǎng)及發(fā)酵L-蘋(píng)果酸的研究

將驗(yàn)證正確的工程菌C. glutamicumΔPPLmqo::transb、C.glutamicumΔPPLmqo::transbΔmale和野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032分別接種到含5%葡萄糖和1%乙酸鈉的CD液體培養(yǎng)基中作種子，30 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物離心收集菌體，轉(zhuǎn)移到以5%的葡萄糖1%乙酸鈉作為碳源的CD培養(yǎng)基中，以相同條件繼續(xù)搖床振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵48 h，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)調(diào)節(jié)pH，使之維持在7.0，同時(shí)測(cè)定OD值，定期記錄菌株生長(zhǎng)情況，并留存樣品用來(lái)進(jìn)行高效液相色譜的測(cè)定。

1.2.6 高效液相色譜檢測(cè)丙酮酸和L-蘋(píng)果酸的方法

將待測(cè)發(fā)酵液經(jīng)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 醋酸纖維素濾膜過(guò)濾后，利用高效液相色譜法分析L-蘋(píng)果酸的含量[23]。檢測(cè)條件為:Agilent1200高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，BDS HYPERSIL C18柱，4.6 mm×200 mm，流動(dòng)相：乙腈和20 mmol/L KH2PO4(pH2.8)混合液(體積比為1∶99)，流速0.5 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫29 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1mqo基因缺失菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

2.1.1mqo基因敲除打靶質(zhì)粒的構(gòu)建

蘋(píng)果酸醌氧化還原酶基因(mqo)是以野生型C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得mqo基因的上下同源臂；再以Saccharomyces cerevisiae的基因組為模版，擴(kuò)增出強(qiáng)化分泌的transb基因，融合獲得大小為3 400 bp的片段mqoup-transb-do，如圖3-A所示。將融合片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB相連，得到重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmqo::transb，對(duì)其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，如圖3-B所示，經(jīng)酶切后的質(zhì)粒分別獲得大小為3 400 bp的融合片段和5 400 bp載體片段，符合與理論值一致，說(shuō)明mqo基因敲除打靶質(zhì)粒的構(gòu)建成功。

A:1,2-mqo基因上下同源臂transb融合結(jié)果；M-DNA 5k marker; B：1-pK18mobsacB/Δmqo::transb雙酶切；2-pK18mobsacB空質(zhì)粒雙酶切；M-DNA 15k marker圖3 pK18mobsacB/Δmqo::transb打靶質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.3 Construction of targeting plasmid pK18mobsacB/Δmqo::transb

2.1.2 工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb的篩選及驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmqo::transb電轉(zhuǎn)化至實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的工程菌C. glutamicumΔPPL感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)兩次同源重組使transb基因替換mqo基因，從而mqo基因被敲除。按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因mqo的基因序列設(shè)計(jì)敲除驗(yàn)證引物QMQOF/QMQOR，隨機(jī)挑取7株重組菌株，分別利用mqo基因敲除驗(yàn)證引物QMQOF/QMQOR、transb基因驗(yàn)證引物TRANSF/TRANSR進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，7號(hào)菌株擴(kuò)增出1 000 bp的transb基因，而mqo基因未能擴(kuò)增處，這說(shuō)明7號(hào)菌株transb基因整合到了染色體，替換掉了mqo基因，從而獲得了工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb。

T1-7：transb基因驗(yàn)證結(jié)果；M1-7：mqo基因驗(yàn)證結(jié)果；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照；M：DNA 2k marker圖4 工程菌C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb菌落PCR驗(yàn)證Fig.4 Colony PCR verification of C. glutamicum ΔPPL Δmqo::transb

2.2male基因缺失菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

2.2.1male基因敲除打靶質(zhì)粒的構(gòu)建

A:1～3-male基因上下同源臂融合結(jié)果；M-DNA 2k marker;B：1-pK18mobsacB/Δmale雙酶切；2-pK18mobsacB空質(zhì)粒雙酶切；M-DNA 15k marker圖5 pK18mobsacB/Δmale打靶質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.5 Construction of targeting plasmid pK18mobsacB/Δ mqo::transb

蘋(píng)果酸酶基因(male)是以野生型C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得上下同源臂，經(jīng)融合獲得大小為1 900 bp的片段maleup-do，結(jié)果如圖5-A。將融合片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB相連，得到重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmale，對(duì)其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，如圖5-B所示，經(jīng)酶切后的質(zhì)粒分別獲得大小為1 900 bp的融合片段和5 400 bp載體片段，符合與理論值一致，說(shuō)明male基因敲除打靶質(zhì)粒的構(gòu)建成功。2.2.2 工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmale電轉(zhuǎn)化至工程菌C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb的感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)2次重組使male基因被敲除。按照按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因male的基因序列設(shè)計(jì)敲除驗(yàn)證引物QMALEF/QMALER，隨機(jī)挑取7株重組菌株，利用male基因敲除驗(yàn)證引物QMALEF/QMALER進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示，2-5號(hào)菌株未能擴(kuò)增出male基因，而陽(yáng)性對(duì)照C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb與其他菌株擴(kuò)增出了male基因，陰性對(duì)照水為模版也同樣未能擴(kuò)增處條帶，這說(shuō)明2-5號(hào)菌株male基因被敲除，從而驗(yàn)證了工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale構(gòu)建成功。

M1-10：male基因驗(yàn)證結(jié)果；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照；M：DNA 2k marker圖6 工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale菌落驗(yàn)證 Fig.6 Colony PCR verification of C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale

2.3 工程菌生長(zhǎng)特性研究

將C.glutamicumΔPPL，C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale與野生菌C. glutamicum ATCC 13032以等OD值分別接種到含5%葡萄糖和1%乙酸鈉的CD培養(yǎng)基中，在30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，分別在12、24、36、48 h測(cè)定OD值，繪制生長(zhǎng)狀況圖，如圖7所示。由于基因缺失C. glutamicumΔPPL、C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的生長(zhǎng)情況均不如野生型C. glutamicum ATCC 13032。與野生型C.glutamicum ATCC 13032相比，基因缺失菌株C.glutamicumΔPPL和C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale生長(zhǎng)較緩慢，而且其生長(zhǎng)依賴于乙酸鹽，是因?yàn)閮芍旯こ叹甓既笔Я藀dh基因造成的。

圖7 生長(zhǎng)曲線圖Fig.7 Growth curve

2.4 工程菌的L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量

為了進(jìn)一步驗(yàn)證工程菌L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量,分別將C.glutamicumΔPPL、C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale與野生菌C.glutamicum ATCC 13032同時(shí)以5%的葡萄糖和1%乙酸鈉作為碳源的CD培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，48 h后收集發(fā)酵液，利用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中L-蘋(píng)果酸的含量同時(shí)測(cè)定副產(chǎn)物丙酮酸的含量。由于工程菌 C. glutamicumΔPPL Δmqo::transbΔmale敲除了蘋(píng)果酸代謝過(guò)程中的2個(gè)關(guān)鍵基因蘋(píng)果酸醌氧化還原酶編碼基因(mqo)和蘋(píng)果酸酶編碼基因(male)，遏制了副產(chǎn)物的形成，且強(qiáng)化了蘋(píng)果酸分泌基因(transb),因而積累的L-蘋(píng)果酸明顯高于野生型菌株和出發(fā)菌株。經(jīng)計(jì)算結(jié)果表3所示。野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032 發(fā)酵48小時(shí)后，沒(méi)有L-蘋(píng)果酸積累，丙酮酸的含量為0.65 g/L，而工程菌C.glutamicumΔPPL在敲除pqo,pdh, lldh后，丙酮酸含量提高為15.1 g/L、L-蘋(píng)果酸含量為0 g/L，C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale發(fā)酵48小時(shí)后L-蘋(píng)果酸的含量為12.8 g/L、丙酮酸含量為14.6 g/L，L-蘋(píng)果酸含量明顯提升，丙酮酸含量略有下降，出峰結(jié)果如圖8所示。

圖8 工程菌C. glutamicum ΔPPLΔmqo::transb Δmale發(fā)酵48 h液相圖Fig.8 C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale 48 h fermentation phase diagram

3 結(jié)論

本文采用食品級(jí)微生物C.glutamicum作為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸的生產(chǎn)菌，更安全可靠，符合食品添加劑的生產(chǎn)要求[24-25]。根據(jù)C.glutamicum的L-蘋(píng)果酸生物合成的代謝途徑，設(shè)計(jì)代謝工程改造的策略(如圖1所示)，在敲除了支流代謝相關(guān)酶編碼基因基礎(chǔ)上，依次構(gòu)建了蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶編碼基因(transb)置換蘋(píng)果酸醌氧化還原酶編碼基因(mqo)的打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmqo::transb和敲除蘋(píng)果酸酶基因(male)的打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmale，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化，將打靶質(zhì)粒pK18mobsacB/Δmqo::transb和pK18mobsacB/Δmale依次轉(zhuǎn)化至已制備好的相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)一次交換兩次同源重組的方法，經(jīng)抗性篩選和反向標(biāo)記篩選，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗(yàn)證，證明C.glutamicumΔPPL染色體上的mqo,male基因被敲除，transb基因被敲入，獲得C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale工程菌株。在5%的葡萄糖1%乙酸為碳源的CD培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，48 h后，野生菌株無(wú)L-蘋(píng)果酸產(chǎn)生，而工程菌L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)量為12.8 g/L，工程菌的糖酸轉(zhuǎn)化率為33.18%。有效地阻斷了支流代謝途徑，減少了副產(chǎn)物的生成，強(qiáng)化了L-蘋(píng)果酸的分泌，提高了L-蘋(píng)果酸的產(chǎn)率。獲得的遺傳資源具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力，為進(jìn)一步代謝工程改造菌種、提高L-蘋(píng)果酸產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。

[2] 劉建軍,姜魯燕,趙祥穎,等.L-蘋(píng)果酸的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑,2003(3):53-56.

[3] 汪多仁, 陳體慶.L-蘋(píng)果酸的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[J]. 飲料工業(yè), 2004, 7(1): 21-26.

[4] LIU G L, ZHOU Y, LUO H P, et al.A comparative evaluation of different types of microbial electrolysis desalination cells for malic acid production[J]. Bioresource Technology, 2015, 198: 87-93.

[5] KNUF C, NOOKAEW I, REMMERS I, et al. Physiological characterization of the high malic acid-producingAspergillusoryzaestrain 2103a-68[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014,98(8): 3 517-3 527.

[6] 康毅,劉樹(shù)文.蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程酒酒球菌碳源代謝分析研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2012,33(19):326-330.

[7] LITSANOV B, KABUS A, BROCKER M, et al. Efficient aerobic succinate production from glucose in minimal medium withCorynebacteriumglutamicum[J]. Microbial Biotechnology, 2012, 5(1): 116-128.

[8] NISHIMURA T, TERAMOTO H, INUI M, et al. Gene expression profiling ofCorynebacteriumglutamicumduring anaerobic nitrate respiration: induction of the SOS response for cell survival[J]. Journal of Bacteriology, 2011, 193(6): 1 327-1 333.

[9] 黃艷紅, 田延軍, 郝夕祥, 等.L-蘋(píng)果酸代謝流分析及高產(chǎn)菌株構(gòu)建[J]. 山東食品發(fā)酵, 2009(3): 3-8.

[10] 吳亞斌, 張梁, 石貴陽(yáng). 產(chǎn)L-蘋(píng)果酸重組大腸桿菌的構(gòu)建[J]. 生物加工過(guò)程, 2014(3): 12-18.

[11] 吳軍林, 吳清平, 張菊梅.L-蘋(píng)果酸的生理功能研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2008,29(11): 692-695.

[12] LIU G L, LUO H P, WANG H H, et al.Malic acid production using a biological electrodialysis with bipolar membrane[J]. Journal of Membrane Science, 2014, 471: 179-184.

[13] 胡永紅, 歐陽(yáng)平凱, 沈樹(shù)寶,等. 反應(yīng)分離耦合技術(shù)生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸工藝過(guò)程的優(yōu)化研究[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17(5): 503-505.

[14] 周小燕, 吳清平, 蔡芷荷, 等. 曲霉N1-14′胞質(zhì)酶活性與產(chǎn)L-蘋(píng)果酸能力的關(guān)系[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2000, 30(5): 500-506.

[15] 田三德, 吳艷娜, 徐新麗. 混合發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的工藝研究及淺析[J]. 食品科技, 2009, 30(3): 232-234.

[16] LITSANOV B, BROCKER M, BOTT M. Toward homosuccinate fermentation: metabolic engineering ofCorynebacteriumglutamicumfor anaerobic production of succinate from glucose and formate[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(9): 3 325-3 337.

[17] KIND S, JEONG W K, SCHR?DER H, et al.Systems-wide metabolic pathway engineering inCorynebacteriumglutamicumfor bio-based production of diaminopentane[J]. Metabolic Engineering, 2010, 12(4): 341-351.

[18] ZAHOOR A, LINDNER S N, WENDISCH V F.Metabolic engineering ofCorynebacteriumglutamicumaimed at alternative carbon sources and new products[J]. Computational and Structural Biotechnology Journal, 2012, 3: 1-11.

[19] ZHU N, XIA H, WANG Z, et al.Engineering of Acetate Recycling and Citrate Synthase to Improve Aerobic Succinate Production inCorynebacteriumglutamicum[J]. PloS One, 2013, 8(4): e60659.

[20] SHI X C, CHEN Y, REN H F, et al. Economically enhanced succinic acid fermentation from cassava bagasse hydrolysate usingCorynebacteriumglutamicumimmobilized in porous polyurethane filler[J]. Bioresource Technology, 2014, 174: 190-197.

[21] EGGELING L,BOTT M.Handbook of Boca Raton[J].2005:535-545.

[22] HORTON R M.PCR-mediated.recombination and mutagenesis.SOEing together tailor-made gene[J].Molecular Biotechnology,1995,3(2):93-99.

[23] 尹志梅, 楊青, 吳敏秀,等.L-蘋(píng)果酸定量測(cè)定方法[J]. 中國(guó)釀造,1999,18(4):33-34.

[24] KALINOWSKI J, BATHE B, BARTELS D, et al. The completeCorynebacteriumglutamicumATCC 13032 genome sequence and its impact on the production ofL-aspartate-derived amino acids and vitamins[J]. Journal of Biotechnology, 2003, 104(1): 5-25.

[25] MENTZ A, NESHAT A, PFEIFER-SANCAR K, et al. Comprehensive discovery and characterization of small RNAs inCorynebacteriumglutamicumATCC 13032[J]. BMC genomics, 2013, 14(1): 714.

Metabolic engineering ofCorynebacteriumglutamicumforL-malate production

ZHAO Yi, LE Tian-ming, LIU Jin-lei, WANG Chong-hui, YI YONG, FENG Hui-yong*

(College of Bioscience & Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050000,China)

L-malate is an important organic acid in microbial metabolic pathway. It has been widely used in food, medicine and other industrial fields. To improve malate production, the C. glutamicum ΔpqoΔpdhΔlldh(C. glutamicum PPL) was genetically modified by homologous recombination technology and reverse selection method to knockout pyruvate quinone oxidoreductase (pqo), pyruvate dehydrogenase (pdh) andL-lactate dehydrogenase (lldh). The 2 key genes in malate metabolic pathway, malate quinone oxidoreductase (mqo) and malic enzyme (male), were knockout and one new gene malate transport-protein (transb) was inserted intoC.glutamicumΔPPL to obtain a new engineering mutantC.glutamicumΔPPL Δmqo::transbΔmale. TheL-malate production was measured by HPLC after fermentation for 48 h. The results showed that theL-malate production from fermentation broth of mutant was 12.8 g/L whereas the wild type had noL-malate accumulation. The sugar acid conversion rate of engineering bacteria was 33.18%. Our research provides the genetic resources for malate production byC.glutamicumfermentation.

Corynebacteriumglutamicum;L-malate;knockout;knockin

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612003

碩士研究生(馮惠勇教授為通訊作者，E-mail：fenghuiyong@163.com)。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2014AA022102)

2016-05-20，改回日期：2016-07-18