來建飛 丁蕾 竇曉兵?

miRNA在結(jié)直腸癌中的作用研究進(jìn)展

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結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率居世界惡性腫瘤第三位，是全球第四大癌癥死因［1］。引起CRC的危險(xiǎn)因素包括吸煙、肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)等。2015年的研究數(shù)據(jù)顯示［2］，早期診斷出結(jié)直腸癌的患者存活率約為60%，高于2005年至2009年的平均數(shù)據(jù)［3］。結(jié)直腸癌發(fā)生是多基因參與、多步驟發(fā)生的過程，其生物過程及分子機(jī)制尚不明確。1993年科學(xué)家首次在線蟲發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miRNA）lin-4［4］后，越來越多關(guān)于miRNA的問題引起關(guān)注，其在人體多種疾病中扮演重要角色，包括各種癌癥。對(duì)miRNA的相關(guān)研究將有助于闡明其功能及分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在結(jié)直腸癌患者中表達(dá)失衡，參與癌癥發(fā)生與發(fā)展過程。miRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，是一類重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，可靶向結(jié)合mRNA，通過沉默癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)［5］，促進(jìn)或抑制腫瘤的生長(zhǎng)。miRNA可作為結(jié)直腸癌早期診斷、治療、預(yù)后的新的分子生物學(xué)標(biāo)志物，也可作為體內(nèi)CRC治療的靶點(diǎn)［6］。

1 miRNA 的分子結(jié)構(gòu)和生物功能

miRNA是一類在多種真核細(xì)胞和病毒中發(fā)現(xiàn)的進(jìn)化上保守、長(zhǎng)度為19～22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上千種miRNA。miRNA的產(chǎn)生過程及生物功能各不相同，其核內(nèi)生成過程如下［7］：編碼miRNA的基因片段通過RNA聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄合成初級(jí)miRNA（primiRNA），pri-miRNA包含一個(gè)DROSHA蛋白和兩個(gè)DGCR8蛋白，經(jīng)過DROSHA酶切后，形成發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA），長(zhǎng)度為70～100nt；pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5和GTP酶共同作用下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，被核酸酶Dicer切割成21～25個(gè)堿基的雙鏈miRNA；該雙鏈解旋為兩條miRNA，其中一條為成熟的miRNA，另一條通常被降解。成熟miRNA分子可與其他蛋白質(zhì)組成RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。成熟miRNA 5' 端高度保守的種子序列（seed region）可與mRNA 3'端非編碼區(qū)域（3'UTR）完全或不完全識(shí)別結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行剪切、降解或去腺苷酸化調(diào)控，影響mRNA 完整性，誘導(dǎo)靶分子mRNA降解或遏制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平影響基因或蛋白的表達(dá)。

2 miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

2.1 miRNA與腫瘤的作用機(jī)制 不同種類的miRNA生物學(xué)功能取決于其所結(jié)合的mRNA功能［8］。miRNA參與體內(nèi)多種調(diào)控機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一條單鏈miRNA可作用于多條mRNA，同時(shí)一條mRNA可被多條miRNA作用［9］；而同一miRNA在不同的腫瘤中作用不同，多種miRNA也可以作用于同一靶基因發(fā)揮作用。miRNA與腫瘤的作用方式主要包括［10］：（1）miRNA與靶mRNA 的3'-UTR不完全配對(duì)，阻斷其翻譯過程，從而下調(diào)靶mRNA的表達(dá)。（2）miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全配對(duì)，引起靶基因互補(bǔ)區(qū)特異性斷裂，從而將基因沉默，使其無法表達(dá)。（3） miRNA可通過加速靶mRNA 3' 端polyA的脫腺苷酸化，從而迅速降解靶mRNA。miRNA家族中，部分為癌性基因，部分為抑癌基因，通過其下游基因或某些信號(hào)通路控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［11］，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移與侵襲［12］。

2.2 miRNA參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后 近兩年又發(fā)現(xiàn)有多種miRNA參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后過程。2015年Cell上一篇文章表明［13］，一些miRNA在基因組上成簇存在，以多順反子形式轉(zhuǎn)錄。miR-17-92基因簇是一個(gè)高度保守的基因簇，編碼miRNA-17、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a、miRNA-19b-1和miRNA-92a這6個(gè)成熟miRNA，參與哺乳動(dòng)物多個(gè)器官發(fā)育，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。miRNA-17-92基因簇在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。因此精確調(diào)控這一miRNA基因簇，以及基因簇中各個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)對(duì)于發(fā)育和腫瘤相關(guān)疾病有重大作用。

例如，Zhang G等研究發(fā)現(xiàn)［14］，miRNA-92a在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC患者中表達(dá)顯著升高，PTEN基因是其下游靶基因之一；miRNA-92a誘導(dǎo)上皮細(xì)胞至間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（EMT），通過下調(diào)PTEN表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和入侵。臨床病理特點(diǎn)表明，miRNA-92a超表達(dá)與臨床晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移以及低氧化應(yīng)激水平（OS）密切相關(guān)，推測(cè)miRNA-92a可作為CRC預(yù)后標(biāo)志［15］。2015年，Chang C等［16］發(fā)現(xiàn)，miRNA-339-5p可靶向結(jié)合mRNA PRL-1的3'UTR從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。體外實(shí)驗(yàn)證明miRNA-339-3p過度表達(dá)會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而PRL-1表達(dá)不受miRNA- 339-3p調(diào)控。表明miRNA-339-5p和miRNA-339-3p作用的目標(biāo)mRNA可能不同，miRNA-339-3p的目標(biāo)基因仍有待確定。因此，研究不同miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制具有重要意義。

3 miRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

目前CRC的篩選方法包括結(jié)腸鏡檢查和糞便隱血試驗(yàn)等常用的方法，但是這些方法受限于低特異性、敏感性、高侵襲性、高成本和高風(fēng)險(xiǎn)［17］。越來越多研究報(bào)道，miRNA作為潛在CRC診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，廣泛存在于CRC患者糞便、血清、血漿和組織中。

3.1 miRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá) 2015年，Raheleh A等［18］根據(jù)關(guān)于熒光素酶報(bào)告基因文獻(xiàn)，總結(jié)近10年發(fā)表的77篇文獻(xiàn)制訂出一份關(guān)于結(jié)直腸癌患者異常表達(dá)的不同miRNA及其靶基因信息表，列舉了多種miRNA靶基因及其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用。一篇Oncology 文獻(xiàn)報(bào)道［19］，miRNA-143靶向作用于MACC1的3'UTR，下調(diào)MACC1表達(dá)；提示miRNA-143可能直接作用于其靶分子MACC1，抑制癌細(xì)胞侵襲。2016年，Zhou B等［20］發(fā)現(xiàn)miRNA-382在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)異常下調(diào)，經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)miRNA-382直接作用于NR2F2的3'UTR；NR2F2在CRC組織中相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織；敲除NR2F2可抑制CRC細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、和入侵。因此，miRNA-382/ NR2F2可作為一個(gè)潛在機(jī)制調(diào)控CRC的發(fā)生發(fā)展。最近，Bo L等［21］發(fā)現(xiàn)在CRC細(xì)胞系和組織樣本中miRNA-152表達(dá)下調(diào)；恢復(fù)CRC細(xì)胞中miRNA-152表達(dá)后，CRC細(xì)胞增殖、遷移和入侵顯著減少；PIK3R3是miRNA-152直接和功能性下游靶目標(biāo)，PIK3R3表達(dá)和miRNA-152表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；下調(diào)PIK3R3表達(dá)使miRNA-152超表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

3.2 miRNA在結(jié)腸癌患者血清中的表達(dá) 目前miRNA在結(jié)腸癌患者外周血中表達(dá)水平研究較少，但其在結(jié)直腸癌早期的診斷治療中具有重要意義。2015年，F(xiàn)ang Z等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者血清中miRNA-24、miRNA-320a和miRNA-423-5p表達(dá)水平明顯低于正常組標(biāo)本；手術(shù)后這三個(gè)分子濃度明顯增加。因此血清中miRNA-24，miRNA-320a和miRNA-423-5p表達(dá)水平有潛力作為CRC早期階段的新型生物標(biāo)志物檢測(cè)，且優(yōu)于目前臨床生物標(biāo)志物。2016年，Hu J等［23］表明在CRC細(xì)胞中miRNA-1914和miRNA-1915作用于NFIX RNA的3'UTR，下調(diào)NFIX RNA的表達(dá)；其過度表達(dá)會(huì)減弱5-FU和Oxaliplatin的抗腫瘤作用，降低CRC細(xì)胞的化學(xué)抵抗能力。因此miRNA-1914和miRNA-1915可能在結(jié)直腸癌治療和診斷中發(fā)揮重大作用。

3.3 miRNA在結(jié)腸癌患者糞便中的表達(dá) 為了在CRC初期進(jìn)行切除腫瘤，降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率，進(jìn)行結(jié)直腸癌早期篩查非常必要。Lee JK等［24］發(fā)現(xiàn)，miRNA具有高度穩(wěn)定性，能夠抵抗核酸酶（Rnases）的消化，適合在血清/血漿等體液，甚至糞便樣本中進(jìn)行檢測(cè)。因此可以通過檢測(cè)糞便中miRNA表達(dá)來作為篩查結(jié)直腸癌的一種新方法。2015年，Zhu Y等［25］表明，與正常健康人比較，CRC患者糞便中miRNA-29a（P＜0.001），miRNA-223（P＜0.001）和miRNA-224（P＜0.001）表達(dá)水平均顯著降低；miR-29a水平在直腸癌患者糞便中的表達(dá)也顯著高于結(jié)腸癌患者（P＜0.001）。因此miRNA可以成為一個(gè)CRC的篩查和早期診斷的生物標(biāo)志物。

4 miRNA與結(jié)直腸癌的診斷治療

4.1 miRNA與CRC的早期診斷 CRC傳統(tǒng)化療主要基于5氟尿嘧啶（5-FU）。與目前廣泛應(yīng)用的腫瘤標(biāo)記物不同，miRNA表達(dá)譜具有高度特異性，通過其特征對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷［26］。Lekun F等［27］在295位CRC患者樣本中發(fā)現(xiàn)，化療抵抗患者中，miRNA-17-5p表達(dá)水平比化療敏感患者高，miR-17-5p高表達(dá)的CRC患者預(yù)后效果較差，推測(cè)miRNA-17-5p可以作為對(duì)化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。2016年，Ghanbari R等［28］證實(shí)，CRC患者血清和糞便中l(wèi)et-7a-5p和let-7f-5p miRNA表達(dá)顯著降低，這可能是CRC早期檢測(cè)潛在分子生物標(biāo)志物。通過人為改變miRNA表達(dá)量控制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)等，miRNA表達(dá)譜可用于評(píng)估腫瘤治療效果。

4.2 miRNA與CRC的靶向治療 隨著CRC研究不斷深入，個(gè)性化靶向治療得到發(fā)展，人類腫瘤發(fā)生過程中miRNA成為一個(gè)新型特異性分子靶標(biāo)［29-30］。Min-Bin C等發(fā)現(xiàn)［31］，miRNA-451在結(jié)腸癌組織中過度表達(dá)，抑制AMPK活化機(jī)制，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體（mTORC1）過度活化和肌動(dòng)蛋白束蛋白（FSCN1）上調(diào)，增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和增殖能力；若敲除miRNA-451基因或使用miRNA-451抑制劑，結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和增殖被抑制。2015年，YANG等［32］發(fā)現(xiàn)，miRNA-499在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)，miRNA-499-5p靶向結(jié)合FOXO4和PDCD4，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移。由此可見miRNA-499-5p在結(jié)直腸癌的侵襲和生長(zhǎng)中起著重要的調(diào)控作用，有望成為CRC臨床診斷治療的潛在靶點(diǎn)。這些研究表明有多種miRNA促進(jìn)或抑制結(jié)直腸腫瘤入侵與轉(zhuǎn)移過程，通過調(diào)整相關(guān)基因?yàn)榭罐D(zhuǎn)移策略提供潛在治療靶點(diǎn)，為CRC的靶向治療提供重要線索。

5 展望

miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，是目前研究的前沿。今后，若能在正常人、結(jié)直腸癌癌前病變患者及不同階段結(jié)直腸癌患者中建立系統(tǒng)完善的miRNA差異表達(dá)譜，將有助于闡明結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制，為結(jié)直腸癌的診斷治療帶來新的研究方向和思路。如何特異性地將miRNA的激活劑及抑制劑引入腫瘤細(xì)胞，以及如何利用miRNA的表達(dá)譜為早期結(jié)直腸癌提供診斷依據(jù)，都是未來的研究方向。miRNA或許可成為結(jié)直腸癌早期診斷、特異性治療及評(píng)估預(yù)后的小分子標(biāo)志物。因此，miRNA在結(jié)直腸癌診療中具有重要意義。

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310053浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

*通信作者