土壤微生物結(jié)構(gòu)的T-RFLP及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用分析

王旭東， 張更謙， 張曉嘉， 王佳琦， 陳尚坤

(1.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院， 重慶 401120; 2.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院物證教研室， 山西太原 030001;3.吉林省警察學(xué)院 吉林長(zhǎng)春 130117)

土壤微生物結(jié)構(gòu)的T-RFLP及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用分析

王旭東1， 張更謙2， 張曉嘉2， 王佳琦2， 陳尚坤3

(1.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院， 重慶 401120; 2.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院物證教研室， 山西太原 030001;3.吉林省警察學(xué)院 吉林長(zhǎng)春 130117)

目的 用末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(T-RFLP)，觀察不同地域土壤微生物構(gòu)成的多態(tài)性，為法醫(yī)學(xué)土壤成分分析和地域鑒別提供適當(dāng)?shù)姆治龇椒ā７椒?采集吉林省和重慶市兩地的土壤樣本，用PowerSoil?試劑盒提取土壤細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的多態(tài)性區(qū)域，引物的5’端采用FAM標(biāo)記。擴(kuò)增產(chǎn)物分別用MspⅠ、RsaⅠ內(nèi)切酶消化后，用3130遺傳分析儀進(jìn)行電泳分離。采用主成分分析(PCA)法和主效可加護(hù)作用可乘模型(AMMI)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 采用MspⅠ酶切后，T-RFLP法可以明確分離重慶和吉林兩地的土壤樣本。RsaⅠ酶切后分離效果稍差。結(jié)論 T-RFLP法可以區(qū)分來(lái)自重慶、吉林兩地域的土壤樣本，為法醫(yī)學(xué)土壤多樣性分析提供了一種可靠的分析方法。

末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性； 土壤細(xì)菌； 法醫(yī)學(xué)

0 引言

法醫(yī)學(xué)對(duì)土壤分析非常感興趣，因?yàn)橥寥篮苋菀渍吹饺撕臀锷希虼藢?duì)案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的確定、犯罪嫌疑人的行動(dòng)軌跡追蹤很有意義，可為案件提供有價(jià)值的線(xiàn)索。以前在偵查破案中檢測(cè)土壤主要是針對(duì)土壤的物理特征、化學(xué)構(gòu)成，如土壤種類(lèi)、顏色、顆粒大小、土壤酸堿度、主要元素、礦物和有機(jī)成分。但是，這些參數(shù)的多樣性有限，不能充分地區(qū)分兩種土壤樣本。因此，分析土壤中微生物的差別來(lái)鑒別泥土的來(lái)源，無(wú)疑可成為提供偵查線(xiàn)索和證據(jù)的有效思路。環(huán)境微生物學(xué)的研究已充分證明，土壤中存在大量微生物，并且土壤中的微生物呈多樣性分布，不同地區(qū)及同一地區(qū)不同地點(diǎn)所分布的微生物種類(lèi)不同、菌株也不同。大量的微生物基因組測(cè)序顯示，不同種類(lèi)微生物的基因組序列存在差異，不同菌株的某些位置序列存在多態(tài)性[1-2]。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP技術(shù))為這一區(qū)分策略提供了新的技術(shù)平臺(tái)。該方法建立在PCR的基礎(chǔ)上,不需要分離培養(yǎng)細(xì)菌，因而避免了培養(yǎng)方法的弊端。通過(guò)設(shè)計(jì)出細(xì)菌的通用引物，對(duì)所有細(xì)菌的16S rRNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，酶切后產(chǎn)生大小不同的片段，根據(jù)酶切產(chǎn)物片段圖譜的差異，可明確微生物種群的差異，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)檢材來(lái)源的快速、準(zhǔn)確的分析[3]。

1 材料

1.1 土壤采集

土壤樣本共42個(gè)，分別來(lái)自吉林省和重慶市，具體見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒(MO BIO，美國(guó))；內(nèi)切酶MspⅠ和RsaⅠ(New England Biolabs，英國(guó))；rTaq和dNTP(Takara，日本)；引物序列為 8F: 5’FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG， 785R: 5’-ACTACCTGGGTATCTAATCC，擴(kuò)增產(chǎn)物總長(zhǎng)度約777 bp[4]；引物合成和標(biāo)記由生工生物工程(上海)股份公司完成。

2 方法

2.1 土壤DNA提取與擴(kuò)增

采用MO BIO PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 簡(jiǎn)單步驟如下： 取250 mg的樣品加入power Bead管中，加入C1溶液混勻，10 000 g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入C2溶液混勻，10 000 g離心1 min,將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入C3溶液，10 000 g離心1 min，取上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加C4溶液混勻，每次取600 μL加入過(guò)濾柱中，10 000 g離心1 min,重復(fù)3次，在過(guò)濾柱中加入C5洗滌，10 000 g離心1 min,將過(guò)濾柱換到新的離心管中，加入C6溶液，10 000 g離心1 min,收集離心管中的DNA。測(cè)定樣本OD值并計(jì)算其濃度。

表1 土壤樣本

用ABI PCR 9700擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：總體系50 μL，其中含 PCR緩沖液5 μL、dNTP 200 μM、引物濃度0.2 μM、rTaq 3U、DNA 100 ng。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性；共36個(gè)循環(huán)：95 ℃ 10 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

2.2 酶切

擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物，分別用內(nèi)切酶MspⅠ、RsaⅠ酶切。25 μL酶切體系含有緩沖液2.5 μL、內(nèi)切酶(MspⅠ或者RsaⅠ)10U，擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL。放置于37 ℃水浴條件下過(guò)夜后煮沸滅活內(nèi)切酶。

2.3 電泳和自動(dòng)分析

電泳在ABI公司Genetic Analyzer 3130遺傳分析儀上進(jìn)行。具體步驟如下: 取去離子甲酰胺9.5 μL、0.2 μL內(nèi)標(biāo)(LIZ 500)和1.5 μL酶切產(chǎn)物混合后95 ℃ 3 min，立即冰浴，然后上樣電泳。用GeneMapper 3.2分析電泳結(jié)果。顯示每個(gè)實(shí)際位置，BIN設(shè)置為±0.5 bp，大于該值被認(rèn)為是不同的OTU(Operational Taxonomic Units)，即不同的峰。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)收集90～500 bp之間的所有峰高大于50的峰。記錄峰位置、峰高和峰面積的大小，作為原始數(shù)據(jù)(Raw Data)。將Raw Data用T-REX軟件進(jìn)行在線(xiàn)匹配(http:∥trex.biohpc.org/)，并生成矩陣數(shù)據(jù)。對(duì)所得數(shù)據(jù)分別采用IMMA分析和PCA分析。IMMA分析由T-REX在線(xiàn)完成，PCA分析由IBM SPSS23.0完成。

3 結(jié)果

3.1 不同地域的土壤的差別

MspⅠ酶切后T-RFLP圖譜顯示，吉林地區(qū)與重慶地區(qū)的樣本T-RFLP差別較大。峰的大小和組合完全不同。兩地區(qū)的土壤樣本，其特征峰(箭頭所示)的片段大小和高度以及豐度都相差較大，即擁有不同的特征峰型組合，可明確區(qū)別來(lái)自這兩地區(qū)的土壤，如圖1。而用RsaⅠ酶切后T-RFLP圖譜，并不能將不同的地區(qū)的土壤分開(kāi)(見(jiàn)圖2)。

圖1 不同地域土壤樣本MspⅠ酶切后的T-RFLP圖譜A:代表4號(hào)樣本，B:代表9號(hào)樣本，C:代表10號(hào)樣本，D:代表15號(hào)樣本，E: 代表16號(hào)樣本，F(xiàn): 代表17號(hào)樣本。A、B、C來(lái)自重慶市，D、E、F來(lái)自吉林省。箭頭指示特征峰。

圖2 不同地域土壤樣本RsaⅠ酶切后的T-RFLP圖譜(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所做的PCA分析，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所做的PCA分析。

3.2 可重復(fù)性

重慶地區(qū)土壤樣本4、樣本9為在2 m2內(nèi)采集的兩份土壤，二者與樣本10相距約50 m。用MspⅠ酶切所得T-RFLP圖更為相似，其特征峰的片段大小高度相近，即采自于同一片區(qū)域的樣本有一定的重復(fù)性(見(jiàn)圖1)。

3.3 對(duì)MspⅠ酶切后T-RFLP圖譜的分析

擴(kuò)增產(chǎn)物用兩種限制性?xún)?nèi)切酶MspⅠ和RsaⅠ進(jìn)行酶切，對(duì)T-RFLP分別根據(jù)峰高和峰面積進(jìn)行主成分分析(PCA)和主效可加護(hù)作用可乘模型(AMMI)分析。MspⅠ 酶切處理后，PCA分析可見(jiàn)重慶和吉林地區(qū)的樣本大致分成兩個(gè)群落，并且峰高和峰面積的分析結(jié)果一致。8號(hào)樣本與其他樣本多態(tài)性差別較大，顯示出該地點(diǎn)土壤菌群的較高特異性(見(jiàn)圖3)。

圖3 MspⅠ酶切所得主成分分析(PCA)圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所做的PCA分析，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所做的PCA分析。 可見(jiàn)重慶和吉林地區(qū)的樣本大致分成兩個(gè)群落。 8號(hào)樣本與其他樣本多態(tài)性差別較大，顯示出該地點(diǎn)土壤的特異性。

用在線(xiàn)分析軟件T-REX對(duì)吉林和重慶地區(qū)的土壤樣本進(jìn)行AMMI分析，分別以峰高、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素和以峰面積、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素。用MspⅠ酶切后，AMMI分析可以將吉林土和重慶地區(qū)土壤細(xì)菌分為兩個(gè)群落。散點(diǎn)圖中吉林地區(qū)土壤樣本較為集中，重慶地區(qū)土壤樣本較為離散，分析為重慶土壤取樣位置、取樣高度差異較大，從而導(dǎo)致了土壤中細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量的較大差異，而吉林土壤取自同一高度及環(huán)境相似的農(nóng)田，因而環(huán)境對(duì)細(xì)菌菌落影響較小。8號(hào)樣本獨(dú)立于吉林和重慶兩地區(qū)土壤細(xì)菌群落外，影響因素除了位置，可能還有其較獨(dú)特的環(huán)境因素。PCA 分析和AMMI分析均可較明確區(qū)分重慶與吉林地區(qū)的土壤。 但是AMMI分析后，吉林地區(qū)樣本的結(jié)果顯示更加集中(見(jiàn)圖4)。

圖4 MspⅠ酶切后進(jìn)行T-REX在線(xiàn)AMMI分析數(shù)據(jù)圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所得AMMI分析圖，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所得AMMI分析圖。吉林地區(qū)樣本分布集中，重慶地區(qū)由于采樣高度和采樣位置的不同較為分散。其中兩圖中8號(hào)樣本的土壤顯示與其他地方土壤微生物的差異較大。

3.4 對(duì)RsaⅠ酶切后T-RFLP圖譜的分析

圖5 RsaⅠ酶切后得到的主成分分析(PCA)分析圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所做的PCA分析，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所做的PCA分析。根據(jù)分析圖，RsaⅠ難以將重慶和吉林省兩地的土壤樣本明確區(qū)分，且多數(shù)樣本較為集中。

對(duì)吉林和重慶地區(qū)的樣本，經(jīng)RsaⅠ酶切后的T-RFLP圖譜，根據(jù)特征峰的峰高和峰面積進(jìn)行PCA分析和AMMI分析，結(jié)果顯示，兩地區(qū)的點(diǎn)混雜在一起，無(wú)論用峰的有無(wú)還是峰面積均難以區(qū)分兩地區(qū)土壤樣本(見(jiàn)圖5，圖6)。

圖6 RsaⅠ酶切后進(jìn)行T-REX在線(xiàn)進(jìn)行AMMI分析數(shù)據(jù)圖(a)圖為根據(jù)土壤樣本的峰高所得AMMI分析圖，(b)圖為根據(jù)土壤樣本的峰面積所得AMMI分析圖。(a),(b)兩圖中樣本5，樣本12顯示與其它區(qū)域的土壤差異較大。

4 討論

構(gòu)成土壤生態(tài)環(huán)境的因素眾多，包括土壤的用途、植被、氣候、光照、高度等，從而造成土壤微生物群落構(gòu)成上的差別。而T-RFLP法正是以這種差別為理論基礎(chǔ)區(qū)分各個(gè)地區(qū)土壤，即用內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生不同長(zhǎng)度大小的DNA片段，通過(guò)末端標(biāo)記的熒光PCR產(chǎn)物的電泳差異顯示出來(lái)。凡有差異的土壤應(yīng)該表現(xiàn)出不同的DNA圖譜和特征峰[5-6]。

本文用T-RFLP分析不同地域土壤細(xì)菌16SrRNA基因的多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)表明，采用該方法可以成功提取大部分土壤的細(xì)菌DNA并成功擴(kuò)增和分析。本文中采自吉林、重慶有23份樣本可成功分析，采自重慶的33份土壤樣本中，有16份樣本未能成功分析。吉林樣本9份，一份樣本未能分析。未能成功分析的樣本，在DNA提取后，雖在瓊脂糖凝膠電泳后觀測(cè)到清晰的土壤細(xì)菌基因組DNA條帶，但仍無(wú)法完成PCR過(guò)程，我們?cè)鴩L試多種方法，如更換DNA提取試劑盒，用乙醇沉淀后重新純化DNA，改善擴(kuò)增條件等方法仍無(wú)法獲得有效的擴(kuò)增產(chǎn)物。分析可能為該地區(qū)土壤腐殖酸等抑制擴(kuò)增的物質(zhì)含量過(guò)多，抑制PCR擴(kuò)增[7]。隨著模板量的增大，抑制擴(kuò)增的物質(zhì)也隨之增加，一些樣本在減少模板量的條件下可以擴(kuò)增出產(chǎn)物。土壤成分復(fù)雜，如何有效減少擴(kuò)增抑制物，這是在分析土壤時(shí)必需注意的。

兩個(gè)地區(qū)的土壤細(xì)菌擴(kuò)增產(chǎn)物采用內(nèi)切酶MspⅠ處理后，可以將此二地區(qū)的土壤有效地分離開(kāi)來(lái)，而內(nèi)切酶RsaⅠ處理后，不能有效地將兩地區(qū)土壤分開(kāi)。推測(cè)是因?yàn)閮煞N酶的酶切序列不同，MspⅠ的酶切序列為5’…C＾CFF…， RsaⅠ的酶切序列為5’…GT＾AC…。另一方面我們用的引物是8F-785R,能擴(kuò)增出60%～90%的土壤細(xì)菌菌落DNA，但并不是全部細(xì)菌DNA，對(duì)于一些特異性菌落可能不能擴(kuò)出，因此可以嘗試其他引物結(jié)合不同的酶進(jìn)一步改進(jìn)。

我們用PCA和AMMI兩種方法，通過(guò)對(duì)兩種酶處理后的T-RFLP圖譜的分析，結(jié)果顯示，這兩種方法結(jié)果一致。土壤樣本距離越近，T-RFLP圖譜越相似，應(yīng)用此二方法所得出的位置也越接近，而且說(shuō)明該兩種分析方法均具有良好的可靠性和重復(fù)性。我們亦驗(yàn)證了AMMI相較于PCA能夠發(fā)現(xiàn)更微小的差異，說(shuō)明 AMMI模型能更透徹地分析交互作用(G×E)信息[8]。

內(nèi)切酶MspⅠ處理后，用AMMI 模型分析吉林地區(qū)的土壤，結(jié)果顯示分布非常集中，考慮為土壤樣本來(lái)源的環(huán)境影響較為一致。來(lái)自重慶土壤樣本分布較為離散，考慮可能為不同高度位置(山頂，山腳)和不同環(huán)境(水塘，路邊干燥處)使細(xì)菌群落表現(xiàn)出了較大的差異。不同地點(diǎn)由近到遠(yuǎn)呈漸變趨勢(shì)，如11號(hào)樣本地處樣本7和樣本12之間，而在AMMI分析圖上也位于兩點(diǎn)之間。由于土壤的多樣性，即使是取自同一地區(qū)的土壤，也有可能出現(xiàn)土壤菌落結(jié)構(gòu)的差異。對(duì)于8號(hào)樣本這樣與其他菌群差異較大的樣本，我們不能分析出其是哪一地區(qū)的土壤，但可以利用其特殊性，如沾在證據(jù)(如鞋、衣服)上的土壤和案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)土壤直接進(jìn)行比對(duì)，來(lái)推測(cè)其歸屬地的同一性。

直接提取土壤細(xì)菌全基因組DNA過(guò)程簡(jiǎn)單，擴(kuò)增和結(jié)果分析易于自動(dòng)化(儀器檢測(cè)后以數(shù)字化的形式直接輸出結(jié)果，減少了分析時(shí)人為誤差)，便于推廣，在各地有DNA實(shí)驗(yàn)室的公安局即可自行檢測(cè)；另外通過(guò)遺傳分析儀對(duì)任何一種末端限制性片段的檢測(cè)，均可以建立相應(yīng)的地區(qū)土壤數(shù)據(jù)庫(kù)，亦可與已知數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，確定樣品所包含的微生物在系統(tǒng)中的分類(lèi)地位，整個(gè)過(guò)程可在較短的時(shí)間內(nèi)完成[9]。在本研究中選用16S rRNA保守序列與不同內(nèi)切酶相結(jié)合的方法對(duì)土壤細(xì)菌群落進(jìn)行研究，結(jié)果證明并不是所有的酶和引物都適合：16S rRNA序列與MspⅠ內(nèi)切酶結(jié)合，在土壤多態(tài)性研究方面是一種有效的手段，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，但16S rRNA序列結(jié)合RsaⅠ內(nèi)切酶對(duì)不同地區(qū)土壤的鑒別能力較差。我們將進(jìn)一步用不同引物和不同酶組合的方法檢測(cè)土壤微生物的多樣性，為法醫(yī)微生物學(xué)研究土壤提供更有效的方法。

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(責(zé)任編輯 于瑞華)

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目“微生物16SrRNA的T-RFLP技術(shù)在法庭科學(xué)中的應(yīng)用研究”(20110424)。

王旭東(1970—)，男，山西平陸人，醫(yī)學(xué)博士，副教授。研究方向?yàn)榉ㄡt(yī)遺傳學(xué)。

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