孫 明，劉巧榮，宋文靜，喬明明，顧 強(qiáng)，張 謙，劉伯華，楊雪松，陳西釗*

(1.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094；2.北京關(guān)忠動(dòng)物醫(yī)院，北京 100025)

寵物犬布氏桿菌的PCR檢測(cè)及部分序列分析

孫 明1，劉巧榮1，宋文靜2，喬明明1，顧 強(qiáng)2，張 謙1，劉伯華1，楊雪松2，陳西釗1*

(1.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094；2.北京關(guān)忠動(dòng)物醫(yī)院，北京 100025)

對(duì)北京關(guān)忠動(dòng)物醫(yī)院送檢的2例疑似感染布氏桿菌寵物犬的7份分泌物進(jìn)行了布氏桿菌普通PCR、快速實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)和Multi-PCR鑒定，并對(duì)部分基因序列測(cè)序分析，旨在對(duì)寵物犬感染犬布氏桿菌作出確診，為寵物犬感染布氏桿菌診斷與防控提供資料。結(jié)果顯示，布氏桿菌快速實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)試劑盒對(duì)兩例犬的7份分泌物檢測(cè)結(jié)果均為布氏桿菌陽(yáng)性；Multi-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，感染犬布氏桿菌屬于犬種布氏桿菌，且為非典型犬布氏桿菌；序列分析進(jìn)一步驗(yàn)證了患犬感染樣品擴(kuò)增的序列均為布氏桿菌序列：BSCP31表面蛋白序列與已經(jīng)發(fā)布的序列相比相似性在99%～100%；OMP25序列與中國(guó)內(nèi)蒙古分離的犬布氏桿菌xue1分離株和韓國(guó)BrucellacanisHSK A52141 分離株親緣關(guān)系最為親近，核苷酸相似性均為99.9%；16S rRNA 序列顯示，進(jìn)口斗牛犬和泰迪犬感染菌株均屬于布氏桿菌序列。以上試驗(yàn)結(jié)果表明兩例寵物犬均為犬布氏桿菌感染，這些數(shù)據(jù)將為布氏桿菌病的篩查和防控提供一定的基礎(chǔ)。

布氏桿菌；寵物犬；PCR檢測(cè)；序列分析

布氏桿菌病(brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是由布氏桿菌引起的一種以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病。該病分布廣泛，有170多個(gè)國(guó)家存在此病。該病不僅影響畜牧業(yè)的發(fā)展，還直接威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全。

1966年L. E. Carmichael等首次在患病犬的組織和陰道分泌物中發(fā)現(xiàn)了犬種布氏桿菌[1]。犬種布氏桿菌屬于粗糙型菌株，主要引起犬類動(dòng)物發(fā)病，被犬種布氏桿菌感染的犬可引起繁殖障礙(如流產(chǎn)、死胎、不孕等)，也可表現(xiàn)非繁殖障礙癥狀(如視力缺陷、肌肉關(guān)節(jié)或皮膚受損等)。近幾年，犬的飼養(yǎng)量大幅度增加，越來越多的人選擇犬作為寵物，犬的品種繁雜、來源廣泛，其疫病也較為復(fù)雜，導(dǎo)致犬布病的發(fā)病率逐年上升，而犬布病多呈隱性經(jīng)過，不易察覺，當(dāng)患病犬流產(chǎn)時(shí)才懷疑是布病，因此犬布病的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)犬布病的防控和人類健康和公共衛(wèi)生安全均有重要的意義。目前，布氏桿菌的檢測(cè)方法主要有病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷，前兩種方法操作耗時(shí)、特異性和敏感性有待提高，且存在一定的風(fēng)險(xiǎn)；而以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)不僅用于布氏桿菌種及型的鑒定，還能反映基因間存在的差異，因此可在基因水平上進(jìn)行分型和疫苗株的鑒定[2]，且PCR方法無風(fēng)險(xiǎn)，耗時(shí)短，對(duì)布氏桿菌病的監(jiān)測(cè)和確診具有很大的意義。

筆者對(duì)關(guān)忠動(dòng)物醫(yī)院送檢的兩例寵物犬的7份分泌物進(jìn)行了PCR檢測(cè)和種屬鑒定，并對(duì)部分基因克隆測(cè)序，旨在對(duì)寵物犬感染布氏桿菌進(jìn)行確診，為犬布病的監(jiān)測(cè)和防控提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床背景

病例1：兩只進(jìn)口斗牛犬，一公一母，來自同一窩，4個(gè)月，白色。回國(guó)后發(fā)現(xiàn)有輕微感冒，體溫正常，偶爾咳嗽，鼻涕少，眼屎未見增多。其中公犬睪丸發(fā)育遲緩。采樣：母犬眼鼻分泌物(樣品1)和陰道分泌物(樣品2)，公犬眼鼻分泌物(樣品3)和陰莖分泌物(樣品4)。

病例2：母種犬，品種泰迪，2歲，棕色。繁殖史：1歲時(shí)懷孕生產(chǎn)，一切正常。第二次懷孕，懷孕不足40 d，流產(chǎn)。采樣：眼鼻分泌物(樣品5)，陰道分泌物(樣品6)，尿液(樣品7)。

1.2 菌體染色

將疑似分泌物進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.3 載體和主要試劑

PMD19-T克隆載體、EX-TaqDNA聚合酶購(gòu)自于大連TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；總DNA提取試劑盒為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒為Omega產(chǎn)品。布氏桿菌(BRU)快速實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒和布氏桿菌PCR檢測(cè)試劑盒為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的布氏桿菌基因組和相應(yīng)文獻(xiàn)合成以下引物：由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 The sequence of the primers for PCR amplification

基因Gene上游引物(5′→3′)Forwardprimer下游引物(5′→3′)Reverseprimer產(chǎn)物大小/bpExpectedsize16SrRNACATGGCTCAGAACGAACGCTACGACTTCACCCCAGTCGCT1420OMP25CATGGGCGGTTTACTCCGGCCAGATCATAGTTC650BSCPGGAACCGATCATTGAGGGATTACTATGCGGGAAGAGGACTGGTA1030

1.5 布氏桿菌DNA提取

按照北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司的DNA提取試劑盒操作說明提取布氏桿菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 布氏桿菌檢測(cè)

按照北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的布氏桿菌(BRU)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒和布氏桿菌PCR檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行鑒定。

1.7 Multi-PCR鑒定

1.7.1 菌種鑒定 引物參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，見表2。根據(jù)引物擴(kuò)增目的片段大小不同判斷種屬。牛種布氏桿菌能擴(kuò)增出494和591 bp片段，羊種布氏桿菌能擴(kuò)增出732和591 bp片段，豬種布氏桿菌能擴(kuò)增出591和272 bp片段，犬種布氏桿菌能擴(kuò)增出272 bp片段。

表2 牛羊豬犬種布氏桿菌Multi-PCR引物

Table 2 Multi-PCR primers ofB.abortus,B.melitensis,B.suisandB.canis

引物名稱Primers引物序列(5′?3′)Primersequence產(chǎn)物大小/bpExpectedsize目的菌種BrucellaspeciesPIS711fTGCCGATCACTTAAGGGCCTTCATP494rGACGAACGGAATTTTTCCAATCCC494B．a(chǎn)bortusPIS711fTGCCGATCACTTAAGGGCCTTCATP732rAAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA732B．melitensisP591fCTGGTGGGTATCGCATTACTCGGP591rTTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG591B．a(chǎn)bortus、B．melitensis、B．suisP272fGGAACACTACGCCACCTTGTP272rGATGGAGCAAACGCTGAAG272B．suis、B．canis

1.7.2 典型和非典型鑒定 引物參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，能擴(kuò)增出836、436和217 bp片段的為典型布氏桿菌，擴(kuò)增出436和217 bp片段的為非典型犬布氏桿菌，擴(kuò)增出436、217和大于836 bp的片段不是犬布氏桿菌。

表3 鑒定犬典型和非典型布氏桿菌Multi-PCR 引物

Table 3 Multi-PCR primers of Typical and AtypicalB.canis

引物名稱Primers引物序列(5′?3′)Primersequence產(chǎn)物大小/bpExpectedsizeB．a(chǎn)b?fGTCTTCCTGATTGCGGCTGGB．a(chǎn)b?rACCACCAGCGACAGGAACATC436B．can?fGGCTTCCTCACGACATACCAGB．can?rCTGAACAGGATGCAATGACGC836或大于836B．sul?fCCACGAACGAGCGAACAGCB．sul?rCGGTAAAGCGTTGATTTCCATG217

1.8 基因擴(kuò)增

用合成的16S rRNA引物、OMP25引物和BSCP引物對(duì)樣品1和5進(jìn)行各基因擴(kuò)增。擴(kuò)增使用20 μL體系，依次加入10×ExBuffer 2 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、ExTaq0.2 μL、上下游引物各1 μL(10 pmol·μL-1)、滅菌純水11.8 μL、布氏桿菌DNA 2 μL。擴(kuò)增程序： 95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用OMEGA公司膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增的目的基因片段。

1.9 擴(kuò)增產(chǎn)物的亞克隆及測(cè)序

分別將PCR擴(kuò)增得到的相應(yīng)片段連接到pMD19-T中，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，將初步鑒定的陽(yáng)性克隆送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.10 序列同源性分析

應(yīng)用DNAman和DNAStar生物軟件對(duì)基因序列與GenBank上登錄的國(guó)內(nèi)外有代表性的布氏桿菌相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析、比對(duì)，分析其序列特征。

2 結(jié) 果

2.1 菌體染色

布氏桿菌革蘭染色為陰性(紅色)，呈球桿狀細(xì)菌，單個(gè)或多個(gè)存在，見圖1。

2.2 布氏桿菌試劑盒檢測(cè)

使用北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的布氏桿菌快速實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(圖2)和布氏桿菌PCR試劑盒(圖3)對(duì)7份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，快速熒光試劑盒檢測(cè)7份樣品均為陽(yáng)性，普通PCR試劑盒檢測(cè)7份樣品中5份陽(yáng)性，2份陰性。結(jié)果見表4、圖2和圖3。表4為快速熒光試劑盒檢測(cè)Ct值，可知眼分泌物病菌含量高于陰道分泌物和尿液中的病菌含量。

圖1 布氏桿菌感染犬分泌物染色(915×)Fig.1 Staining of secretion from Brucella infected pet dogs (915×)

1～7. 樣品編號(hào)；8. 陽(yáng)性對(duì)照；9. 陰性對(duì)照1-7. Sample number；8. Positive control; 9. Negative control圖2 布氏桿菌快速熒光試劑盒結(jié)果Fig.2 Detection results of Brucella rapid fluorescent reagent kit

表4 布氏桿菌快速熒光試劑盒檢測(cè)Ct值

Table 4 Result ofCtvalues byBrucellarapid fluorescent reagent kit

犬品種Dogspecies樣品編號(hào)Samplenumber樣品來源SamplesourceCt值Ctnumber結(jié)果Results斗牛犬(母)1眼鼻分泌物27．43陽(yáng)性2陰道分泌物33．61陽(yáng)性斗牛犬(公)3眼鼻分泌物33．83陽(yáng)性4陰莖分泌物37．29陽(yáng)性泰迪(母)5眼鼻分泌物25．28陽(yáng)性6陰道分泌物29．57陽(yáng)性7尿液37．75陽(yáng)性

1～7. 樣品編號(hào)；8. 陽(yáng)性對(duì)照；9. 陰性對(duì)照；M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-7. Sample number; 8. Positive control; 9. Negative control; M. DL2000 DNA marker圖3 布氏桿菌PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of Brucella PCR kit

2.3 Multi-PCR 鑒定

用兩種Multi-PCR對(duì)樣品1和樣品5進(jìn)行擴(kuò)增，牛羊豬犬Multi-PCR結(jié)果顯示兩個(gè)樣品均能擴(kuò)增出272 bp的片段，為犬種布氏桿菌，結(jié)果見圖4。典型非典型Multi-PCR結(jié)果顯示能擴(kuò)增出436和217 bp的片段，為非典型犬布氏桿菌，結(jié)果見圖5。

1.樣品1；2. 樣品5；3. 疫苗株S2對(duì)照; 4. 陰性對(duì)照；M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.Sample 1; 2. Sample 5; 3. Control of Vaccine S2 strain; 4. Negative control; M. DL2000 DNA marker圖4 牛、羊、豬、犬布氏桿菌Multi-PCR 檢測(cè)Fig.4 The detection of Multiplex PCR for Brucella abortus, Brucella meltitensis, Brucella suis and Brucella canis

1.陰性對(duì)照；2. 樣品1；3. 樣品5；M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Negative control; 2. Sample 1; 3. Sample 5; M. DL2000 DNA marker圖5 典型和非典型布氏桿菌Multi-PCR結(jié)果Fig.5 The results of Multi-PCR for Typical and Atypical B. canis

2.4 基因序列擴(kuò)增

用16S rRNA引物、OMP25引物和BSCP引物從樣品1和樣品5 的DNA中擴(kuò)增相應(yīng)基因序列，結(jié)果顯示，均獲得大小合適的目的條帶：16S rRNA大小約為1 400 bp，BSCP大小約為1 000 bp，OMP25約為650 bp。結(jié)果詳見圖6。

1.樣品1；5. 樣品5；M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Sample 1；5. Sample 5；M. DL2000 DNA marker圖6 基因序列擴(kuò)增Fig.6 Amplication results of genes

2.5 基因序列測(cè)序及分析

測(cè)序結(jié)果顯示，樣品1(來自進(jìn)口斗牛犬)和樣品5(來自泰迪犬)16S rRNA、OMP25和BSCP分別長(zhǎng)1 426、652和1 034 bp，核苷酸相似性均為100%。將樣品5的16S rRNA、OMP25和BSCP基因序列提交到GenBank，登錄號(hào)分別為KX529832、KX529833和KX529834，將該菌株命名為YH-C16。OMP25基因序列與我國(guó)內(nèi)蒙古分離的xue1分離株和韓國(guó)BrucellacanisHSK A52141分離株關(guān)系最為親近，相似性為99.9%，有兩個(gè)核苷酸發(fā)生改變，但氨基酸沒有改變。16S rRNA 基因序列分析顯示，本次感染的菌株屬于布氏桿菌。BSCP31基因測(cè)序顯示，兩個(gè)菌株與NCBI上代表性的菌株相似性均在99%以上，其中與BrucellasuisSPC 株、BrucellacanisRM6/66株、SVA13株以及ATCC23365等菌株核苷酸相似性為100%。

3 討 論

2016年1月，我單位收到關(guān)忠動(dòng)物醫(yī)院送檢的兩例疑似布病感染的7份樣品，對(duì)其分別用布氏桿菌快速實(shí)時(shí)熒光PCR和布氏桿菌PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；快速實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)兩例犬的7份分泌物均為布氏桿菌陽(yáng)性，普通PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)7份樣品中5份陽(yáng)性，2份陰性，其中眼分泌物病菌含量最高，其次是陰道分泌物，尿液中病菌含量最低。為對(duì)感染布氏桿菌進(jìn)一步鑒定確診，復(fù)采取Multi-PCR和序列測(cè)序的方法對(duì)樣品1和樣品5進(jìn)行鑒定。Multi-PCR表明兩份樣品均為犬種布氏桿菌感染，且為非典型布氏桿菌，這與患犬臨床癥狀和測(cè)序結(jié)果相符(OMP25 基因序列與犬種分離株xue1相似性最高)。16S rRNA、OMP25和BSCP31基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，布氏桿菌16S rRNA、OMP25、BSCP31等基因和NCBI基因庫(kù)里的基因序列相似性均在99%以上，這說明布氏桿菌菌株之間、種屬之間序列差異不大。

16S rRNA為原核生物的一種核糖體RNA。由于其基因序列的保守性和存在的普遍性，應(yīng)用16S rRNA作為分子指標(biāo)已逐漸成為微生物檢測(cè)和分類鑒定的一種強(qiáng)有力工具[3]。但也存在一些問題，比如水平基因轉(zhuǎn)移、多拷貝的異質(zhì)性、基因擴(kuò)增效率的差異等[5-6]。本研究對(duì)16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，并擴(kuò)增出了大小與目的片段大小相符的目的DNA。OMP25是OmpA家族成員之一，是布氏桿菌重要的外膜蛋白，在維持細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[7-8]，此外，OMP25還與布氏桿菌的毒力有關(guān)[9]。BSCP31是布氏桿菌表面蛋白，基因序列非常保守，目前其功能還不是很清楚，但基因缺失研究表明BSCP31并不影響細(xì)菌侵襲力和生長(zhǎng)速度[10]。本次擴(kuò)增的OMP25和BSCP31序列，和犬布氏桿菌相應(yīng)序列相比，相似性在99%以上，與狄棟棟[2]和丁家波[11]報(bào)道的一致。

目前PCR技術(shù)多用于人類布病的檢測(cè)，對(duì)于動(dòng)物布病這一方法尚未列入我國(guó)布病標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中。本研究從布氏桿菌試劑盒檢測(cè)、Mutil-PCR種屬鑒定和基因測(cè)序等方面對(duì)疑似感染布氏桿菌犬進(jìn)行了鑒定，確診了北京地區(qū)存在寵物犬感染布氏桿菌的病例，結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了布氏桿菌檢測(cè)試劑盒的可靠性和準(zhǔn)確性。本研究為以后布氏桿菌病的檢測(cè)提供了很好的工具，也為布氏桿菌病的篩查以及防控提供了依據(jù)。

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(編輯 白永平)

PCR Detection and Partial Sequencing Analysis of Brucella canis from Pet Dogs

SUN Ming1，LIU Qiao-rong1，SONG Wen-jing2，QIAO Ming-ming1，GU Qiang2,ZHANG Qian1，LIU Bo-hua1，YANG Xue-song2，CHEN Xi-zhao1*

(1.Beijing Anheal Laboratories Co., Ltd, Beijing 100094, China;2.BeijingGuanZhongAnimalHospital,Beijing100025,China)

Two cases of pet dogs were confirmed to be infected withBrucellacanisbased on detection to their excretion by use of the BRU real time PCR and conventional PCR kits, and the partial genetic sequences of theBrucellacanisinfected were characterized. The results showed that theBrucellastrains from the pet dogs belong to theBrucellacanis, and atypical canine brucellosis. Phylogenetic analysis of BSCP31 gene sequences showed 99%-100% nucleotide identity with the published sequences in GenBank, andOMP25 gene showed 99.9% nucleotide identity betweenBrucellacanisxue1 strain andBrucellacanisHSK A52141 strain. Sequence analysis on 16S rRNA showed the strains from French Bulldog and Teddy Dog belong toBrucella. These data might provide a valuble infomation for future screening and prevention of canine brucellosis.

Brucella; pet dogs; PCR detection; sequence analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.12.023

2016-06-16

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0501006)

孫 明(1963-)，男，河北秦皇島人，博士，主要從事分子病毒診斷技術(shù)研究，E-mail：sunming@anheal.com

*通信作者：陳西釗，博士，研究員，主要從事動(dòng)物傳染病與預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：chenxizhao@anheal.com

S852.612

A

0366-6964(2016)12-2520-06