雌激素通過ER-α調控CYP2C8在雞肝中的表達

李艷敏，李翠翠，鄭 航，田方圓，王臺安，田亞東，李轉見，康相濤，劉小軍

(河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南省家禽種質資源創(chuàng)新工程研究中心，河南省家禽育種國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450002)

雌激素通過ER-α調控CYP2C8在雞肝中的表達

李艷敏，李翠翠，鄭 航，田方圓，王臺安，田亞東，李轉見，康相濤，劉小軍*

(河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南省家禽種質資源創(chuàng)新工程研究中心，河南省家禽育種國際聯(lián)合實驗室，鄭州 450002)

本研究旨在探討雞CYP2C8基因的表達調控規(guī)律。采集30周齡盧氏綠殼蛋雞心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰、十二指腸、空腸、回腸14種組織以及從1日齡～30周齡不同發(fā)育時期的肝組織，用熒光實時定量PCR分析CYP2C8基因的時空表達規(guī)律；用雌激素及其受體拮抗劑對活體和體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細胞進行處理，用熒光實時定量PCR分析CYP2C8基因的表達調控機制。結果表明，雞CYP2C8基因在各組織中表現(xiàn)出廣泛表達的特性，但在脂類代謝旺盛的器官如肝、腎、小腸(十二指腸、空腸、回腸)等器官中表達較高，且在肝中的表達水平隨著性成熟而顯著升高(P<0.01)；雌激素處理可顯著提高雞肝組織和體外培養(yǎng)的雞胚胎肝原代細胞中CYP2C8的表達水平(P<0.05)，但雌激素受體ER-α拮抗劑MPP可完全抑制雌激素的作用(P<0.05)。綜上表明，雞CYP2C8基因在不同組織中廣泛表達，而以肝中的表達水平最高，且肝中CYP2C8基因的表達是受雌激素并通過ER-α調控。

肝；CYP2C8基因；表達調控；雌激素

細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450或P450)是一組含血紅素的蛋白質，由結構和功能相關的基因超家族編碼形成的超家族酶系[1]，因還原型CYP450蛋白與一氧化碳復合物在450 nm處有特異性吸收峰而得名[2]。CYP2C8基因是P450家族的重要成員[3]，哺乳動物的研究表明，CYP2C8基因在腎、肺、鼻黏膜、內皮黏膜、心都有表達，但肝組織表達最高[4-7]，主要參與體內藥物代謝[8-11]，如人CYP2C8基因主要參與體內抗糖尿病藥物羅格列酮和曲格列酮、抗癌藥物紫杉醇、降膽固醇藥物西立伐他汀等的代謝[11]和內源性分子花生四烯酸到環(huán)氧化二十碳三稀酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs) 等的代謝[12]。

PPARα是PPAR轉錄因子的一個亞型，是一種營養(yǎng)傳感器，能調節(jié)脂肪酸的代謝，影響脂肪生成和酮體合成[13]。雞PPARα基因在肝、心、腎和尾脂腺組織中表達量較高[14]，而熊敏等[15]在初生肉雞中研究表明PPARα只在肝中表達，推測其在初生肉雞肝脂肪代謝中起重要的作用，然而CYP2C8基因作為PPARα新靶基因[16]，筆者推測其可能參與家禽調控脂質代謝。

通過對產(chǎn)蛋前期母雞(20周齡)和產(chǎn)蛋高峰期母雞(30周齡)肝組織轉錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C8基因的表達水平在產(chǎn)蛋高峰期雞肝組織顯著升高[17]，表明CYP2C8基因在產(chǎn)蛋期母雞肝代謝中可能發(fā)揮重要的生理功能。由于產(chǎn)蛋期母雞肝需要合成大量的低密度脂蛋白(VLDL)及卵黃前期物(VTG)等脂類物質[18]，產(chǎn)蛋雞肝的代謝活動多與脂質代謝有關，而且這一過程一般認為受雌激素調控[19]。而有關CYP2C8基因在雞的時空表達規(guī)律及其表達調控機制迄今未見報道。本研究將分析CYP2C8基因在不同組織和不同生長階段的表達模式，同時探討其在雌激素誘導下的表達調控規(guī)律，為進一步闡明CYP2C8基因在產(chǎn)蛋期母雞肝脂質代謝中的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選取不同發(fā)育時期(1日齡、1周齡、10周齡、15周齡、20周齡和30周齡)體重相近的健康河南省優(yōu)良地方雞品種盧氏綠殼蛋雞各6只，頸部放血處死后，采集心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰、十二指腸、空腸、回腸14種組織，于液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。選取體重相近的健康10周齡的海蘭褐蛋雞70只，隨機分為4組，前3組中每組20只，各組分別按0.5、1.0和2.0 mg·kg-1體重肌肉注射溶于無水乙醇的3種不同濃度的17β-雌二醇(Sigma，美國)，第4組10只雞為對照組，注射等量的溶劑。各試驗組在17β-雌二醇注射12 h后隨機挑選10只雞，頸部放血處死，采集肝組織，于液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩８髟囼灲M剩余個體在17β-雌二醇注射24 h后與對照組一起，采用與上述同樣的方法處死，采集并保存樣品。

1.2 雞胚肝原代細胞的分離與培養(yǎng)

購自于北京梅里亞維通試驗動物技術有限公司SPF種蛋消毒后，置于溫度38 ℃，濕度97%條件下孵化，孵化過程中自動翻蛋。孵化至17胚齡時取出，用酒精消毒后，打開蛋殼鈍端并揭開氣室膜，于超凈臺中取出雞胚，打開雞胚腹腔，取出肝，用D-Hank’s溶液進行清洗，并剔除非肝組織部分，然后移入加有D-Hank’s的燒杯中，用手術剪將肝組織剪成1 mm3的小塊，隨后加入0.1%的膠原酶IV進行消化，待消化完成后，用100目、500目細胞篩過濾，取過濾后的細胞懸液，1 000 r·min-1，5 min離心3次細胞懸液，吸取上清液，加入Williams’E培養(yǎng)液重懸，采用Percoll梯度離心法純化肝細胞，將純化后的肝原代細胞用含胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)液重懸，采用臺盼蘭染色法進行細胞計數(shù)，按5×105個·mL-1種植于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的雜細胞和細胞碎片，待細胞生長到80%融合時，更換為無血清的基礎培養(yǎng)基饑餓處理6 h，然后用不同濃度的17β-雌二醇(1、50、100 mg·L-1)、MPP(100 mg·L-1)、 ICI 182,780、Tamoxifen(100 mg·L-1)(均購自Sigma，美國)單獨或混合處理細胞，24 h后收集細胞，-80 ℃保存。

1.3 總RNA的提取與反轉錄

參照RNAiso Plus(TaKaRa)說明書提取組織和細胞RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒方法進行反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計與合成

參照Ensemble中雞CYP2C8(ENSGALG-000000 26793)和NCBI中β-actin(MGL-1_205518.1)、ApoVLDLII(MGL-1_205483.2)基因mRNA序列，利用Primer5.0軟件設計PCR引物(表1)，退火溫度為60 ℃，由上海生工生物有限公司合成。

表1 PCR引物序列及擴增片段的大小

Table 1 The Primer sequences and Product size for PCR

基因Gene引物序列(5′→3′)Primersequence產(chǎn)物長度/bpLengthCYP2C8F：GTTTGCAGGTCCCAGTTCAG，R：TCCTTCCCTCTTTGCGATGT152β?actinF：CAGCCAGCCATGGATGATGA，R：ACCAACCATCACACCCTGAT118ApoVLDLIIF：CAATGAAACGGCTAGACTCA，R：AACACCGACTTTTCTTCCAA108

1.5 實時熒光定量PCR

根據(jù)QuantiFastSYBR GreenPCR的試劑盒的操作說明，以β-actin為內參，用實時熒光定量PCR檢測CYP2C8基因的表達量，同一反應重復3次。實時熒光定量PCR體系為2×QuantiFastSYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL,用RNase-Free水補足到20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt方法分析基因的相對表達量，應用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析，比較不同組織、不同發(fā)育時期基因的表達水平，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。圖中數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示(圖1除外)。

2 結 果

2.1 雞CYP2C8基因在不同組織中的表達規(guī)律

將各組織6個個體的cDNA樣品等量混合，以β-actin為內參，用熒光實時定量PCR分析表明，雞CYP2C8基因在心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腹脂、肌胃、腺胃、卵巢、胰臟、十二指腸、空腸、回腸等組織中均有不同程度的表達，尤其在脂類代謝旺盛的器官如肝、腎、小腸(十二指腸、空腸、回腸)等器官中表達水平較高，且以肝的表達水平最高(圖1)。

圖1 雞CYP2C8基因在30周齡個體不同組織中的相對表達量Fig.1 The relative expression level of CYP2C8 gene in different tissues of chicken at 30 weeks old

2.2 雞CYP2C8基因在肝組織中的時序表達規(guī)律

對1日齡、1周齡、10周齡、15周齡、20周齡、30周齡6個發(fā)育階段肝組織(n=6)中CYP2C8基因的熒光實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)母雞肝中CYP2C8基因的表達量極顯著高于產(chǎn)蛋前期(20周齡以前)母雞(P<0.01)肝中CYP2C8基因的表達量(圖2)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Different uppercase letters means very significant difference between groups (P<0.01),the same letter mean no significant difference between groups(P>0.05). The same as below圖2 不同發(fā)育時期雞肝組織中CYP2C8基因的表達規(guī)律Fig.2 The relative expression level of CYP2C8 gene in liver of chicken in different development stages

2.3 雌激素處理對血液指標和雞肝內CYP2C8基因表達的影響

2.3.1 雌激素處理對血液指標的影響 雌激素是產(chǎn)蛋期母雞肝脂質代謝的主要誘導因子[19-20]，不同濃度的17β-雌二醇(0.5、1.0和2.0 mg·kg-1)處理10周齡青年母雞12 h后，與對照組相比，血清中的TG含量顯著升高(P<0.05)，TC的含量只在1.0 mg·kg-1組顯著升高(P<0.05)，VLDL-c無顯著變化(P>0.05)；雌激素處理24 h，血清中的TG、 TC和VLDL-c的含量在1.0和2.0 mg·kg-1組顯著升高(P<0.05)(圖3)。

2.3.2 雌激素處理對雞肝CYP2C8基因表達的影響ApoVLDLII基因啟動子區(qū)含有典型的雌激素受體結合位點(ERE)[26-27]，可作為生物體對雌激素反應的標記基因。不同濃度的17β-雌二醇(0.5、1.0和2.0 mg·kg-1)處理10周齡青年母雞12和24 h后，與對照組相比，雌激素反應的標記基因ApoVLDLII的表達水平都成劑量依賴性顯著升高(P<0.05)(圖4A, B)，表明17β-雌二醇發(fā)揮其正常生理功能。同時，17β-雌二醇處理12 h后，各試驗組中CYP2C8基因的表達水平與對照組相比也顯著升高(P<0.05)(圖4C)；17β-雌二醇處理24 h后，1.0和2.0 mg·kg-1組CYP2C8基因的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，但0.5 mg·kg-1組CYP2C8基因的表達水平與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖4D)。

A.12 h；B.24 h。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同A.12 h; B.24 h. Different small letters list means significant difference (P<0.05), the same letter show no significant difference between treatments(P>0.05). The same as below圖3 雌激素處理的雞血清中TG、TC和VLDL-c的濃度Fig.3 The concentrations of TG,TC and VLDL-c in different estrogen treatment in chicken serum

2.4 雌激素處理對雞胚肝原代細胞中CYP2C8基因表達的影響

2.4.1 雞胚肝原代細胞形態(tài)觀察 剛分離(0 h)的雞胚肝原代細胞成圓形，細胞單個或數(shù)個聚集分布在培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h后雞胚肝原代細胞開始貼壁。培養(yǎng)24 h后，細胞呈多角形，細胞聚集成島嶼狀生長，排列整齊、形似梅花(圖5)。

A，C.12 h;B,D.24 h圖4 不同濃度雌激素處理10周齡母雞對肝組織中ApoVLDL II(A、B)和CYP2C8(C、D)基因表達的影響Fig.4 Effects of different doses of 17β-estradiol on the expression of ApoVLDL II (A,B) and CYP2C8 (C,D) genes in the liver of 10 weeks old pullets after they were treated

A.0 h；B.24 h圖5 雞胚肝原代細胞生長狀態(tài)Fig.5 The growth state of primary chicken hepatocytes

2.4.2 雌激素處理對雞胚肝原代細胞中CYP2C8基因表達的影響 不同濃度雌激素處理體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細胞24 h后，與對照組相比，雌激素反應的標記基因ApoVLDLII的表達水平都成劑量依賴性顯著升高(P<0.05)(圖6A)，表明17β-雌二醇發(fā)揮其正常生理功能。CYP2C8基因的表達水平在50和100 mg·L-1濃度處理組顯著高于對照組(P<0.05)(圖6B)。

2.5 雌激素受體拮抗劑處理對雞CYP2C8基因表達的影響

不同類型的雌激素受體拮抗劑與雌激素共同處理體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細胞24 h后CYP2C8基因的表達水平變化見圖7。CYP2C8基因的表達水平在雌激素單獨處理組顯著高于對照組(P<0.05)。雌激素分別與MPP、ICI 182,780和Tamoxifen共處理體外培養(yǎng)的雞胚肝原代細胞時，各組間CYP2C8基因的表達水平與對照組相比無顯著變化，但與雌激素單獨處理組相比則顯著下調(P<0.05)。因為MPP是ER-α的高度選擇性拮抗劑[32]，ICI 182,780和Tamoxifen主要是ER-α和ER-β受體的拮抗劑，且Tamoxifen對GPR30還表現(xiàn)出高親和力[33]，僅添加MPP時，雌激素處理組中CYP2C8基因的相對表達量恢復到對照組(正常細胞，無雌激素處理)相同的水平，說明ER-α拮抗劑可使雌激素完全不能發(fā)揮作用，當添加ICI 182,780時，雌激素處理組中CYP2C8基因的相對表達量與對照組和ER-α特異性拮抗劑處理組沒有差異，表明同時阻斷ER-α，ER-β受體的作用并不能使CYP2C8基因的相對表達量進一步下降，說明雌激素對CYP2C8基因表達的調控主要通過ER-α介導而實現(xiàn)。綜上表明，雌激素對CYP2C8表達的調控主要是通過ER-α介導實現(xiàn)。

圖6 ApoVLDLII(A)、CYP2C8(B)在不同雌激素處理的肝原代細胞中的表達量Fig.6 The expression difference of ApoVLDL II(A),CYP2C8(B) in different estrogen treatment in hepatocytes

圖7 雌激素受體拮抗劑MPP、ICI 182, 780(ICI)和Tamoxifen(Tam)與雌激素共處理肝細胞對CYP2C8基因表達的影響Fig.7 Effects of co-treatment of E2 and the ER antagonists ICI 182, 780(ICI), tamoxifen (Tam), and MPP on the expression of CYP2C8 mRNA in hepatocytes

3 討 論

基因的表達特性與它們在生物體生長發(fā)育過程中的功能緊密相關，因此研究基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達規(guī)律是研究其功能的基礎。本研究對CYP2C8基因在30周齡盧氏綠殼蛋雞14種組織的表達分析表明，CYP2C8基因在家禽脂類代謝旺盛的組織器官如肝、腎、小腸(十二指腸、空腸、回腸)[21]等的表達水平較高，且肝的表達水平最高，從而推斷CYP2C8基因可能參與產(chǎn)蛋期雞脂類代謝過程。這與有關CYP2C8基因在人的肝組織較高表達的研究[4-7]結果一致。

進一步對CYP2C8基因在不同生理期的盧氏綠殼蛋雞肝組織的時序表達分析表明，CYP2C8基因在產(chǎn)蛋前雞(1日齡～20周齡)肝組織表達水平較低,而在產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)顯著升高達10倍左右。與產(chǎn)蛋前期母雞相比，產(chǎn)蛋期母雞最明顯的生理變化是肝脂肪和蛋白代謝顯著加強，合成胚胎發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質，轉運到生長的卵母細胞形成蛋黃。CYP2C8基因在產(chǎn)蛋期母雞肝組織表達的顯著升高，進一步表明CYP2C8基因可能參與產(chǎn)蛋期雞脂類代謝過程。

產(chǎn)蛋期母雞體內脂類代謝是受激素調控的[22-24]。已有的研究表明，血清中雌激素水平隨著性成熟逐步升高，21周齡產(chǎn)蛋母雞血清中雌激素水平比6周齡青年母雞血清中雌激素水平升高450%[25]。為了進一步研究雌激素對CYP2C8基因表達調控的關系，構建了雌激素誘導的個體和雞胚肝原代細胞模型。由于ApoVLDLII基因啟動子區(qū)具有典型的雌激素反應元件(Estrogen response element ，ERE)[26-27]結合位點，其表達直接受雌激素的調控，因此被作為雌激素作用效應的標記基因。本研究中，10周齡青年母雞經(jīng)不同濃度雌激素處理12 h后，ApoVLDLII基因和CYP2C8基因的表達水平均顯著升高，血清中的TG和TC含量也顯著升高，但VLDL-c無顯著變化；處理24 h后，與對照組相比，ApoVLDLII基因的表達水平仍保持顯著高的水平，CYP2C8基因的表達水平以及血清中的TG、TC和VLDL-c含量卻只在1.0和2.0 mg·kg-1濃度處理組顯著高于對照組。1.0 mg·kg-1處理24 h是研究雌激素誘導的肝脂肪代謝較為適合的濃度和時間點。同樣，不同濃度的雌激素處理肝原代細胞24 h后，與對照組相比，ApoVLDLII基因的表達水平均顯著升高，但CYP2C8基因的表達水平只有在濃度為50 和100 mg·L-1處理組顯著高于對照組，因此，50 mg·L-1是雌激素處理細胞24 h的合適濃度。

選擇性雌激素受體激動劑和拮抗劑是除基因敲除外另一個研究受體功能的常用方法[28-29]，其中特異性拮抗劑能夠阻斷雌激素受體的作用，從而抑制雌激素對靶基因的作用。雌激素受體屬于核受體超家族中的成員，是一類由配體激活的轉錄因子[30]，主要包括核受體ER-α和ER-β，以及G蛋白耦聯(lián)受體30(GPR30)。雌激素的生物學功能主要通過ER-α、ER-β和GPR30介導實現(xiàn)的，如李軍等研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠通過核受體ER-α誘導雞肝生成ApoVLDLII和VTG2[31]。研究表明，MPP是ER-α的高度選擇性拮抗劑[32]，ICI 182,780和Tamoxifen主要是ER-α和ER-β受體的拮抗劑，且Tamoxifen對GPR30表現(xiàn)出高的親和力[33]，在人和石首魚的研究中表現(xiàn)出相當于雌二醇的活性。為了進一步研究雌激素對CYP2C8基因的調控機制。本試驗以3種雌激素拮抗劑MPP、ICI 182,780 和Tamoxifen分別與雌激素共同處理雞胚胎肝原代細胞，分析不同類型拮抗劑對CYP2C8基因表達的影響，結果表明，雌激素調控雞CY2CC8基因的表達是通過ER-α介導的。

雌激素通過雌激素受體發(fā)揮生理作用的方式主要有3種：一是通過激活雌激素受體后，直接與靶基因啟動子區(qū)域的雌激素受體反應元件(ERE)結合，并募集輔調控因子，形成轉錄起始復合物，從而順式激活靶基因調控區(qū)的增強子，促進靶基因的轉錄。二是通過結合或激活其他可直接結合DNA的轉錄因子來間接調控基因的轉錄，如激活蛋白AP-1、特異蛋白SP-1、P53等[34]。三是雌激素可通過膜受體介導快速的非基因型效應，激活細胞內的第二信使，間接調控一系列基因轉錄[35]。關于雌激素激活ER-α后具體是通過哪種信號轉導途徑調控雞CYP2C8基因表達的，還有待進一步研究。

[1] 楊海峰. 雞肝微粒體細胞色素P450的初步研究[D].南京：南京農業(yè)大學, 2006.

YANG H F. Preliminary study on microsomal cytochrome P450 enzymes in chicken[D]. Nanjing： Nanjing agricultural university,2006.

[2] BRINK H M, GORCOM R F, PUNT P J, et al. Cytochrome P450 enzyme systems in fungi[J].FungalGenetBiol, 1998, 23(1):1-17.

[3] MAKIA N L, GOLDSTEIN J A. CYP2C8 is a novel target of peroxisome proliferator-activated receptor α in human liver[J].MolPharmacol, 2016, 89(1): 154-164.

[4] FLEMING I. Cytochrome P450 2C is an EDHF synthase in coronary arteries[J].TrendsCardiovascMed, 2000, 10(4):166-170.

[5] KLOSE T S, BLAISDELL J A, GOLDSTEIN J A. Gene structure of CYP2C8, and extrahepatic distribution of the human CYP2Cs[J].JBiochemMolToxicol, 1999, 13(6):289-295.

[6] DING X, KAMINSKY L S. Human extrahepatic ctyochrome P450: function in xenobiotic metabolism and tissue-selective chemical toxicity in the respiratory and gastrointestinal tracts[J].AnnuRevPharmacolToxicol, 2003, 43(1):149-173.

[7] DELOZIER T C, KISSLING G E, COULTER S J, et al. Detection of human CYP2C8, CYP2C9 and CYP2J2 in cardiovascular tissues[J].DrugMetabDispos, 2007, 35(4):682-688.

[8] NIEMI M, NEUVONEN M, DALY A K, et al. Polymorphism in CYP2C8, is associated with reduced plasma concentrations of repaglinide[J].ClinPharmacolTher, 2003, 74(4):380-387.

[9] TORNIO A, NIEMI M, NEUVONEN P J, et al. Trimethoprim and the CYP2C8*3 allele have opposite effects on the pharmacokinetics of pioglitazone[J].DrugMetabDispos, 2008, 36(1):73-80.

[10] KIRCHHEINER J, THOMAS S, BAUER S, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of rosiglitazone in relation to CYP2C8 genotype[J].ClinPharmacolTher, 2006, 80(6):657-667.

[11] TOTAH R A, RETTIE A E. Cytochrome P450 2C8: substrates, inhibitors, pharmacogenetics, and clinical relevance[J].ClinPharmacolTher, 2005, 77(5):341-352.

[12] FLEMING I. Cytochrome P450 2C is an EDHF synthase in coronary arteries[J].TrendsCardiovascMed, 2000, 10(4):166-170.

[13] 張 震, 富文俊, 邢宇鋒，等. L-FABP/PPARα信號通路與非酒精性脂肪性肝炎關系的研究進展[J]. 山東醫(yī)藥, 2016, 56(8):98-100.

ZHANG Z, FU W J, XING Y F, et al. Research progress on L-FABP/PPARα signal pathway and non-alcoholic steatohepatitis[J].ShandongMedicalJournal, 2016, 56(8):98-100.

[14] DIOT C, DOUAIRE M. Characterization of a cDNA sequence encoding the peroxisome proliferator activated receptor alpha in the chicken[J].PoultSci, 1999, 78(8):1198-1202.

[15] 熊 敏. PPARs調控家禽脂肪代謝的基因網(wǎng)絡研究[D]. 武漢：華中農業(yè)大學, 2011.

XIONG M. Gene regulatory networks of PPARS on pourtry lipid metabolism[D]. Wuhan:Huazhong Agricultural University,2011.

[16] MAKIA N L, GOLDSTEIN J A. CYP2C8 is a novel target of peroxisome proliferator-activated receptor α in human liver[J].MolPharmacol, 2016, 89(1):154-164.

[17] LI H, WANG T, XU C, et al. Transcriptome profile of liver at different physiological stages reveals potential mode for lipid metabolism in laying hens[J].BMCGenomics, 2015, 16(1):1-13.

[18] SCHNEIDER W J. Lipid transport to avian oocytes and to the developing embryo[J].JBiomedRes, 2016, 30(3):174-180.

[19] WILLIAMS J, HARVEY S, LECLERCQ B. Plasma levels of luteinizing hormone, growth hormone, and estradiol from six weeks of age to sexual maturity in two lines of chickens selected for low or high abdominal fat content[J].PoultSci,1986, 65(9):1782-1786.

[20] TANABE Y, NAKAMURA T, TANASE H, et al. Comparisons of plasma LH, progesterone, testosterone and estradiol concentrations in male and female chickens (Gallusdomesticus) from 28 to 1141 days of age[J].EndocrinolJpn, 1981, 28(5):605-613.

[21] BUTLER E J. Lipid metabolism in the fowl under normal and abnormal circumstances[J].ProcNutrSoc, 1975, 34(1):29-34.

[22] SAARELA J, JUNG G, HERMANN M, et al. The patatin-like lipase family inGallusgallus[J].BMCGenomics, 2008, 9(1):1-15.

[23] SPEAKE B K, MURRAY A M, NOBLE R C. Transport and transformations of yolk lipids during development of the avian embryo[J].ProgLipidRes, 1998, 37(1):1-32.

[24] HERMIER D, CATHELINE D, LEGRAND P. Relationship between hepatic fatty acid desaturation and lipid secretion in the estrogenized chicken[J].CompBiochemPhysiolAPhysiol, 1996, 115(3):259-264.

[25] WILLIAMS J, HARVEY S. Plasma concentrations of luteinizing hormone growth hormone, oestradiol, testosterone and androstenedione in the domestic hen from 6 weeks of age to sexual maturity[J].ReprodNutrDev, 1986, 26(2A):515-522.

[26] KLEIN-HITPASS L, SCHORPP M, WAGNER U, et al. An estrogen-responsive element derived from the 5' flanking region of the xenopus vitellogenin A2 gene functions in transfected human cells[J].Cell, 1986, 46(7):1053-1061.

[27] KLEIN-HITPASS L, RYFFEL G U, HEITLINGER E, et al. A 13 bp palindrome is a functional estrogen responsive element and interacts specifically with estrogen receptor[J].NucleicAcidsRes, 1988, 16(2):647-663.

[28] ZHOU H B, CARLSON K E, STOSSI F, et al. Analogs of methyl-piperidinopyrazole (MPP): antiestrogens with estrogen receptor alpha selective activity[J].BioorgMedChemLett, 2009, 19(1):108-110.

[29] BORD S, HORNER A, BEAVAN S, et al. Estrogen receptors alpha and beta are differentially expressed in developing human bone[J].JClinEndocrinolMetab, 2001, 86(5):2309-2314.

[30] 李 軍. 海蘭蛋雞和振寧土雞間卵黃生成的比較及雌激素對卵黃蛋白生成的調節(jié)作用[D]. 杭州：浙江大學, 2014.

LI J. A comparative study of yolk synthesis between Hyline and Zhenning layers and stimulation of 17β-estradiol on yolk proteins synthesis[D]. Hangzhou:ZhejiangUniversity,2014.

[31] HARRINGTON W R, SHENG S, BARNETT D H, et al. Activities of estrogen receptor alpha- and beta-selective ligands at diverse estrogen responsive gene sites mediating transactivation or transrepression[J].MolCellEndocrinol, 2003, 206(1-2):13-22.

[32] MATTSSON A, OLSSON J A, BRUNSTROM B. Activation of estrogen receptor alpha disrupts differentiation of the reproductive organs in chicken embryos[J].GenCompEndocrinol, 2011, 172(2):251-259.

[33] KOLKOVA Z, CASSLEN V, HENIC E, et al. The G protein-coupled estrogen receptor 1 (GPER/GPR30) does not predict survival in patients with ovarian cancer[J].JOvarianRes, 2012, 5(1):1257-1261.

[34] MENENDEZ D, INGA A, RESNICK M A. Estrogen receptor acting in cis enhances WT and mutant p53 transactivation at canonical and noncanonical p53 target sequences[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2010, 107(4):1500-1505.

[35] TORAN-ALLERAND C D. Novel sites and mechanisms of oestrogen action in the brain[J].NovartisFoundSymp, 2000, 230(230):56-73.

(編輯 程金華)

Expression of CYP2C8 Is Regulated by Estrogen through ER-α in Liver of Chicken

LI Yan-min, LI Cui-cui, ZHENG Hang, TIAN Fang-yuan, WANG Tai-an,TIAN Ya-dong, LI Zhuan-jian, KANG Xiang-tao,LIU Xiao-jun*

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University,HenanInnovativeEngineeringResearchCenterofPoultryGermplasmResource,InternationalJointResearchLaboratoryforPoultryBreedingofHenan,Zhengzhou450002,China)

The objectives of the present study were to investigate the characteristics of expression and regulation ofCYP2C8 gene in chicken. A total of 14 tissues (including heart, liver, spleen, lung, kidney, pectoral muscle, abdominal fat, gizzard, glandular stomach, ovaries, pancreas, duodenum, jejunum and ileum) were collected from Lushi green-shelled-egg chickens at the age of 30 weeks old, and the liver tissues were obtained from the chickens at different development stages (from the age of 1 day to 30 weeks old) . The samples were used to detect the spatiotemporal expression profiles ofCYP2C8 gene using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) technology. In addition, the pullets (at the age of 10 weeks old) which were treated with 17β-estradiol, and chicken embryo primary hepatocytes which were treated with either 17β-estradiol alone or combination of 17β-estradiol and estrogen receptor (ER) antagonists were used to analysis the expression regulation mechanism of theCYP2C8 gene. The results showed thatCYP2C8 gene was expressed extensively in different tissues of chicken. The relative expression level ofCYP2C8 was higher in the main lipid metabolism tissues such as liver, kidney, and small intestine (duodenum, jejunum and ileum) than that in other tissues. The expression level ofCYP2C8 gene in liver of hens was significantly increased with the sexual maturity (P<0.01). Estrogen could significantly up-regulate the expression ofCYP2C8 in liver of chicken and hepatocytes (P<0.05). MPP, as an ER-α specific antagonist, could completely antagonize the expression ofCYP2C8 gene (P<0.05). Therefore we concluded thatCYP2C8 gene was expressed extensively in different tissues with higher expression levels in liver, kidney, and small intestine (duodenum, jejunum, and ileum) tissues, and the highest expression level in liver. It was suggested that the effect of estrogen on the expression ofCYP2C8 gene was predominantly mediated via ER-α in the chicken liver.

liver;CYP2C8 gene; expression regulation; estrogen

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.12.005

2016-06-06

河南省國際合作項目(162102410030)；地方雞種質資源保護與利用教育部創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT1236)；國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術體系遺傳育種崗位專項資金(CARS-41-K04)

李艷敏(1989-)，女，河南尉氏人，碩士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：15138656629@163.com

*通信作者：劉小軍，教授，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：xjliu2008@hotmail.com

S831.2

A

0366-6964(2016)12-2362-08