羅本華， 陳周婧， 王 燕， 張亞飛， 郭雅雯

廣西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，南寧 530001

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實驗研究

3種針法對PCPA誘導的失眠大鼠海馬5-HT1A、5-HT2A蛋白表達的影響*

羅本華， 陳周婧， 王 燕， 張亞飛， 郭雅雯

廣西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，南寧 530001

目的 觀察針刺失眠方、臍內(nèi)環(huán)穴及失眠方加臍內(nèi)環(huán)穴對對氯苯丙氨酸(PCPA)失眠大鼠海馬5-HT1A、5-HT2A蛋白表達的影響。方法 將造模成功的30只PCPA失眠大鼠隨機分為5組(每組6只)：模型組、針刺失眠方組、針刺臍內(nèi)環(huán)穴組、針刺失眠方加臍內(nèi)環(huán)穴組、針刺非穴組；另設(shè)正常組(6只)。治療6 d后取大鼠海馬勻漿，采用免疫印跡法檢測5-HT1A、5-HT2A蛋白含量。結(jié)果 PCPA模型大鼠海馬5-HT1A蛋白表達下降，而5-HT2A蛋白表達上調(diào)；3種針法均顯著上調(diào)PCPA失眠大鼠海馬5-HT1A蛋白表達、下調(diào)5-HT2A蛋白表達；而失眠方加臍內(nèi)環(huán)穴針刺作用更明顯，優(yōu)于單一針刺方法。結(jié)論 PCPA失眠大鼠存在中樞5-HT受體信號機制異常，3種針法可能通過調(diào)節(jié)海馬內(nèi)5-HT1A、5-HT2A蛋白表達而改善失眠；實驗支持失眠方加臍內(nèi)環(huán)穴針刺為失眠癥的優(yōu)選干預(yù)方法。

失眠； 臍內(nèi)環(huán)針； 失眠方； 5-HT1A； 5-HT2A

5-羥色胺(5-HT)在睡眠調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用，是失眠癥發(fā)病的公認機制之一，然而其中關(guān)于5-HT跨膜信號轉(zhuǎn)導機制仍不是很明確，目前研究也相對較少。針刺失眠方[1]、臍內(nèi)環(huán)穴[2]針刺是流行于廣西地域的治療失眠癥臨床有效的針刺驗方；筆者常將二者結(jié)合用于失眠癥治療，取得更好療效[3-4]。為了解其對睡眠活動的調(diào)節(jié)機制，探討3種針刺方法的差異，本實驗研究3種針刺對對氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)失眠模型大鼠海馬5-HT1A、5-HT2A蛋白表達的影響，旨在探討失眠癥中5-HT跨膜信號轉(zhuǎn)導機制，并為該針刺方法在失眠癥的臨床運用、方法優(yōu)選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物 健康SPF級Wistar雄性大鼠46只，體重(250±15)g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供；室溫20～25℃飼養(yǎng)，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，定時喂食，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)15 d。

1.1.2 試劑 PCPA試劑盒(Alfa Aesar公司，H30Y014)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海生工生物工程有限公司,SK3021)，Anti-5-HT1ARat Monoclonal Antibody(Abcam公司，ab85615)，Anti-5-HT2ARat Monoclonal Antibody(Abcam公司，ab66049)，辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG(H+L)(碧云天公司,A0192)，Aprotinin(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；蛋白酶抑制劑Cocktail(北京泛基諾生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器 低溫高速離心機(Sigma公司,SIGMA3-18K)，ELX800酶標儀(BIO-TEK)，UVP凝膠成像系統(tǒng)(Thermo公司，CA91786 U.S.A UVP GDS-8000 System)，電泳儀系統(tǒng)(北京六一儀器廠，DYCZ-24 DN)，半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(ATTO)，勻漿儀(FLUKO-PRO200)，PVDF膜(Millipore公司,0.22 μm孔徑)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將46只Wistar大鼠隨機分為正常組6只、擬造模大鼠40只。擬造模大鼠在造模成功后篩選出30只，按隨機數(shù)字表法分為模型組、針刺失眠方組、臍內(nèi)環(huán)針組、失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組、非穴組等5組，每組各6只。

1.2.2 PCPA失眠模型制作 PCPA臨用前用弱堿性生理鹽水(pH7～8)配置成45 mg/mL混懸液備用。于上午8：00左右將大鼠按l mL/100 g體重腹腔注射PCPA混懸液，1次/d，連續(xù)注射2 d，在第2次腹腔注射PCPA 28～30 h后，動物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動不停，整體觀察與正常組有明顯不同者，表明模型復(fù)制成功。正常組腹腔注射相同體積的弱堿性生理鹽水。

1.2.3 針刺干預(yù)方法及療程 6組于造模成功次日開始實驗干預(yù)治療，1次/d，共6次。

①正常組與模型組：不予任何治療，只給予同臍內(nèi)環(huán)針組相同時間(4 min)及相同強度的抓摸刺激。

②針刺失眠方組：給予針刺失眠方穴治療。取穴[5]：雙側(cè)神門、支溝、足三里、三陰交。大鼠的神門在前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣，直刺1 mm；三陰交在后肢內(nèi)踝尖直上10 mm，直刺5 mm；足三里即后三里，在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處，直刺7 mm；支溝穴在前肢外側(cè)，距腕關(guān)節(jié)4.5 mm左右的尺橈骨間，直刺1 mm。針刺方法以25 mm×13 mm粗細的毫針，刺入穴位相應(yīng)的深度，針后行捻轉(zhuǎn)角度90°以內(nèi)90～180次/min的高頻小幅度捻轉(zhuǎn)手法，每穴行30 s后出針，每次共治療4 min。

③臍內(nèi)環(huán)針組：給予針刺臍內(nèi)環(huán)穴治療。取穴：臍內(nèi)環(huán)穴，取心肝脾肺腎六穴點。臍內(nèi)環(huán)穴在大鼠神闕穴[5]旁開2.5 mm處作一圓環(huán)，環(huán)線上均是穴位(據(jù)上書神闕至中脘約20 mm折算)；以正上方為心，正下方為腎，右為肝，左為脾胃，左上、右上均為肺，共6個穴點。針刺方法以25 mm×13 mm粗細的毫針，由內(nèi)向外以10～15°刺入2～4 mm，針后不行捻轉(zhuǎn)提插手法，每穴點留針30 s，共3 min；繼續(xù)抓摸1 min，每次共治療4 min。

④失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組：給予以上失眠方針刺加臍內(nèi)環(huán)針刺治療，每穴行30 s后出針，共治療7 min。

⑤非穴組：針刺雙側(cè)肋下各兩個固定非穴點[6]，約相當于乳正中線外開2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；每穴行90 s后出針，繼續(xù)抓摸1 min，每次共4 min。

1.2.4 大鼠海馬取材方法 針灸干預(yù)方案完成后第2天，處死各組動物，開顱迅速取出整腦，冰上分離各組大鼠海馬，冷生理鹽水中洗去血液，電子天平上稱重待檢。

1.2.5 大鼠海馬5-HT1A、5-HT2A蛋白表達檢測 采用免疫印跡法檢測5-HT1A、5-HT2A蛋白含量，主要步驟如下：①大鼠迅速斷頭后，分離新鮮海馬組織，加適量蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上研磨、勻漿，靜置60 min，勻漿液12 000 g 4℃離心10 min；吸取上清液分裝，-80℃保存?zhèn)溆?；②檢測時，取凍融蛋白標本，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；③取樣本20 μL，總蛋白量約50 μg，SDS聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳；④半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；⑤0.5%脫脂牛奶TBST溶劑封閉；⑥一抗孵育；⑦辣根過氧化物酶二抗孵育；⑧洗凈的膜浸泡在ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HEP Substrate混和液1 mL中約30～60 s，在凝膠成像分析儀選用化學發(fā)光法進行顯色，保存圖片或?qū)⒛づ恼?，用Quantity One 4.3.1軟件(Bio-Rad Laboratories)檢測各組目標條帶的灰度值，以目標條帶與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目標蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬5-HT1A蛋白的表達

大鼠海馬5-HT1A/β-actin蛋白相對表達量各組如下：正常組為(0.756±0.058)，模型組為(0.356±0.070)，針刺失眠方組為(0.494±0.049)，臍內(nèi)環(huán)針組為(0.570±0.032)，失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組為(0.739±0.055)，非穴組為(0.377±0.060)；經(jīng)單因素方差分析得F=58.547，P<0.01，提示組間差異有統(tǒng)計學意義。兩兩比較結(jié)果顯示：模型組PCPA失眠大鼠海馬5-HT1A蛋白相對表達量顯著低于正常組大鼠(P<0.01)，而與非穴組之間差異無統(tǒng)計學意義；針刺失眠方組、臍內(nèi)環(huán)針組及失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組5-HT1A蛋白相對表達量均顯著高于模型組大鼠(均P<0.01)；失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組5-HT1A蛋白相對表達量均顯著高于其他針刺組(均P<0.01)，而與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

A：正常組；B：模型組；C：針刺失眠方組；D：臍內(nèi)環(huán)針組；E：失眠方加臍內(nèi)環(huán)針刺組；F：非穴組；陽性：標準蛋白組的蛋白印跡；5-HT1A蛋白分子量約46 kD；與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組比較，* P<0.01圖1 各組大鼠5-HT1A蛋白的表達Fig.1 Expression of 5-HT1A protein in each group

2.2 各組大鼠海馬5-HT2A蛋白的表達

大鼠海馬5-HT2A/β-actin蛋白相對表達量各組如下：正常組為(0.195±0.044)，模型組為(0.617±0.089)，針刺失眠方組為(0.446±0.081)，臍內(nèi)環(huán)針組為(0.406±0.068)，失眠方加臍內(nèi)環(huán)針刺組為(0.224±0.045)，非穴組為(0.594±0.088)；經(jīng)單因素方差分析得F=37.098，P<0.01，提示組間比較差異有統(tǒng)計學意義。兩兩比較結(jié)果顯示：模型組PCPA失眠大鼠海馬5-HT2A蛋白相對表達量顯著高于正常組大鼠(P<0.01)，而與非穴組之間差異無統(tǒng)計學意義；針刺失眠方組、臍內(nèi)環(huán)針組及失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組5-HT2A蛋白相對表達量均顯著低于模型組大鼠(均P<0.01)；失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組5-HT2A蛋白相對表達量均顯著低于其他針刺組(均P<0.01)，而與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

A：正常組；B：模型組；C：針刺失眠方組；D：臍內(nèi)環(huán)針組；E：失眠方加臍內(nèi)環(huán)針刺組；F：非穴組；陽性：標準蛋白組的蛋白印跡；5-HT2A蛋白分子量約55 kD；與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與失眠方加臍內(nèi)環(huán)針組比較，* P<0.01圖2 各組大鼠5-HT2A蛋白的表達Fig.2 Expression of 5-HT2A protein in each group

3 討論

中醫(yī)認為失眠的病機關(guān)鍵為水火失調(diào)，陰陽失衡。失眠穴方是治療失眠癥的針刺驗方，主穴為神門、支溝、足三里、三陰交，立意瀉火補水，是針對失眠水火失調(diào)病機而設(shè)。臍內(nèi)環(huán)針是壯醫(yī)針刺的基礎(chǔ)針法和調(diào)氣方法，而臍內(nèi)環(huán)穴五臟點同取法是壯醫(yī)針刺頗具療效和研究基礎(chǔ)的失眠效方；究其理，臍內(nèi)環(huán)穴位于臍旁開0.5寸，能溝通任沖和調(diào)節(jié)先天后天；臍是機體三部人部所在，是臟腑信息全息處，結(jié)合針向迎隨，能調(diào)理全身臟腑和氣血；臍通五臟之神、善調(diào)五臟之氣，又起最基本的調(diào)氣調(diào)神作用；因而，針刺臍內(nèi)環(huán)穴能整體調(diào)理臟腑陰陽氣血神氣，廣泛用于全身諸多疾病的整體調(diào)理。數(shù)年來，筆者驗證了單用臍內(nèi)環(huán)五臟點同取法和失眠穴方針刺治療失眠癥的療效，而發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合針刺療效更優(yōu)，該法既能有效地發(fā)揮臍內(nèi)環(huán)針整體治神調(diào)氣和近部臟腑調(diào)節(jié)的作用，又發(fā)揮失眠穴方肢體經(jīng)穴的遠治作用，更整體而全面地顧及失眠癥的臟腑經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)、水火陰陽平衡。前期我們關(guān)于大鼠神經(jīng)行為學實驗證實：PCPA失眠大鼠存在全面的認知功能障礙，臍內(nèi)環(huán)穴針刺和失眠穴方針刺均一定程度改善了PCPA失眠大鼠認知功能障礙，作用與安定藥物相當；而臍內(nèi)環(huán)合失眠穴方針法起全面改善PCPA失眠大鼠認知功能障礙作用，明顯優(yōu)于安定藥物，為3種針法中的優(yōu)選干預(yù)方法[7]。

睡眠發(fā)生與睡眠-覺醒機制相關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生改變密切相關(guān)[8]。5-HT是公認的參與睡眠-覺醒機制的神經(jīng)遞質(zhì)，對慢波睡眠的發(fā)生和維持起著重要作用，是腦內(nèi)的“致眠因子”[9]，故中樞5-HT遞質(zhì)改變是失眠障礙發(fā)病的公認機制之一。5-HT作用通過與其相應(yīng)受體結(jié)合，實現(xiàn)神經(jīng)信息傳遞和信號轉(zhuǎn)導功能，發(fā)揮其應(yīng)有的生物學作用，反映其在睡眠機制中的生理功能和病理機制；5-HT1A、5-HT2A是目前研究較多的與睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)關(guān)系較密切的5-HT受體亞型；5-HT1A受體在腦內(nèi)海馬、中縫核有較多分布，激活該受體可緩解焦慮癥狀，影響大腦的喚醒、情緒等功能，一般低劑量的5-HT1A激動劑可增加深睡眠和淺睡眠[10]。激動5-HT2A可抑制漫波睡眠、引起覺醒增加[11]。許峰[12]發(fā)現(xiàn)腹腔注射PCPA的失眠大鼠，正常睡眠消失，大鼠下丘腦及海馬內(nèi)的5-HT含量降低，5-HT1A表達減弱，5-HT2A表達增強，提示“熟眠方”可能是通過影響下丘腦及海馬內(nèi)5-HT1A、5-HT2A表達引起下丘腦及海馬內(nèi)5-HT含量的改變，從而起到治療失眠的作用。腦內(nèi)5-HT1A、5-HT2A是中樞5-HT神經(jīng)遞質(zhì)信號的直接下游，是直接反映中樞5-HT睡眠調(diào)節(jié)功能的指標之一。PCPA是5-HT合成抑制劑，腹腔注射PCPA能造成睡眠晝夜節(jié)律消失，達到完全失眠，故PCPA失眠大鼠模型是目前公認的、廣泛用于失眠癥中樞5-HT遞質(zhì)研究的經(jīng)典動物模型。中樞5-HT能神經(jīng)元胞體大部分位于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的中縫核群，其纖維投射到丘腦、下丘腦、海馬、基底神經(jīng)節(jié)和大腦皮層。海馬在睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)中起重要作用[13]。本實驗中模型組大鼠海馬5-HT1A含量較正常組大鼠顯著降低、5-HT2A含量較正常組大鼠顯著升高，說明PCPA失眠大鼠模型不僅存在中樞5-HT含量的降低，而且其下游的5-HT1A、5-HT2A表達也存在異常；而針刺失眠穴方、臍內(nèi)環(huán)針刺和二者結(jié)合針刺均顯示有上調(diào)PCPA失眠大鼠海馬5-HT1A蛋白表達以及下調(diào)5-HT2A蛋白表達的作用，從而恢復(fù)PCPA所致失眠大鼠的睡眠-覺醒周期，提示該3種針法均對失眠癥有效，都與中樞突觸5-HT遞質(zhì)信號后的受體信息轉(zhuǎn)導機制有關(guān)；而二者結(jié)合針法顯示了明確的疊加作用，優(yōu)于單一針刺方法；結(jié)合前期神經(jīng)行為實驗[7]，本實驗進一步支持其為失眠癥治療的優(yōu)選方法。

綜上，PCPA失眠模型大鼠存在中樞突觸5-HT遞質(zhì)信號后的受體信息機制異常，3種針法均可能通過上調(diào)PCPA失眠大鼠海馬5-HT1A蛋白表達、下調(diào)5-HT2A蛋白表達，從而恢復(fù)PCPA所致失眠大鼠的睡眠-覺醒周期，起到調(diào)治失眠的作用；實驗支持針刺失眠穴方加臍內(nèi)環(huán)穴方法為失眠癥優(yōu)選干預(yù)方法。

[1] 羅本華.針刺失眠穴方治療失眠癥56例療效觀察[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(2)：274-275.

[2] 羅本華，韋俐.臍內(nèi)環(huán)針刺治療原發(fā)性失眠癥28例觀察[J].大眾科學，2014，16(1)：78-79.

[3] 羅本華，覃斌寧，范小婷，等.臍內(nèi)環(huán)針與安定片治療原發(fā)性失眠癥療效觀察[J].針灸臨床雜志，2014，30(11)：8-11.

[4] 羅本華，覃斌寧，范小婷，等.臍內(nèi)環(huán)針與安定片對失眠癥心理量表影響的比較研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42(1)：27-30.

[5] 李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中草藥出版社，2003：327-329.

[6] 吳幫啟，劉存志，于建春，等.針刺研究中假針刺組的設(shè)置概況[J].上海針灸雜志，2009，28(1)：63-65.

[7] 羅本華，張亞飛，王燕，等.三種針法對PCPA失眠大鼠神經(jīng)行為學影響的對照研究[J].大眾科技，2016，18(6)：57-60.

[8] 朱國慶.5-羥色胺和環(huán)磷酸腺苷對睡眠的影響[J].中國藥理學通報，1999，15(2)：141-143.

[9] 林殷利.五羥色胺與睡眠[J].上海第二醫(yī)科大學學報，1988，8(2)：185-188.

[10] Monti J M，Jantos H，Monti D，et al.Dorsal raphe nucleus administration of 5-HT1Areceptor agonist and antagonists：effecton rapid eye movement sleep in the rat[J].Sleep Res Online，2000，3(1)：29-34.

[11] Ritka T，Bagdy G.Effect of 5-HT2A/2B/2C receptor agonists and antagonists on sleep and waking in laboratory animals and humans[M]//Monti J M，Pandi-Perumal S R，Jacobs B L，et al.Serotonin and sleep：molecular，functional and clinical aspects.Basel：Birkh?user，2008：387-414.

[12] 許峰.基于5-HT1a，5-HT2a，DD2受體系統(tǒng)及HPA軸的“熟眠方”治療失眠機制研究[D].長春：長春中醫(yī)藥大學，2014：42-52.

[13] 張瑾，張景行，朱國慶，等.海馬在慢波睡眠調(diào)節(jié)中的作用研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學，2002：2-3.

(2016-06-22 收稿)

Effect of Three Kinds of Acupuncture on Protein Expression of 5-HT1Aand 5-HT2Ain Hippocampus of Para-chlorophenylalanine-induced Insomnia Rats

Luo Benhua，Chen Zhoujing，Wang Yanetal

FacultyofAcupunctureandMassageofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanning530001，China

Objective To observe the effects of three kinds of acupuncture (the acupoint-prescription of insomnia，acupuncture of umbilical inner acupoints，combined method of acupoint-prescription of insomnia and acupuncture of umbilical inner acupoints)on the protein expression of 5-HT1Aand 5-HT2Ain hippocampus of para-chlorophenylalanine(PCPA)-induced insomnia rat model，and to select the optimal acupuncture method.Methods Totally，30 PCPA-induced insomnia male rats were randomly divided into five groups，and there was still another normal group(6 of each group).The normal group and the model group were given no special treatment；the three observation groups received acupuncture treatment of the umbilical inner acupoints，the acupoint-prescription of insomnia，and the combined method，respectively.The non-acupoint group was treated with acupuncture on non-acupoint.After six days of treatment，in the hippocampus homogenates of the rats，the protein expression levels of 5-HT1Aand 5-HT2Awere detected by Western blotting.Results The protein expression level of 5-HT1Ain hippocampus of PCPA-induced insomnia rats was significantly reduced，and that of 5-HT2Awas significantly elevated.Three acupuncture methods can improve the protein expression level of 5-HT1Aand reduce the protein expression level of 5-HT2Ain hippocampus of rats.The combined method displayed a more significant effect in increasing or reducing the protein expression levels than each single method of acupuncture.Conclusion In PCPA-induced insomnia rats，5-HT receptor signal in central nervous system is abnormal；the three kinds of acupuncture methods might take effects on insomnia by improving the protein expression level of 5-HT1Aand reducing the protein expression level of 5-HT2Ain hippocampus.The combined method of the acupoint-prescription of umbilical inner acupoints and the insomnia acupoint-prescription therefore is the preferred acupuncture method.

primary insomnia； the acupuncture of umbilical inner acupoints； the acupoint-prescription of insomnia； 5-HT1A； 5-HT2A

*廣西自然科學基金資助項目(No.2013 GXNSFAA019133)

R749.052

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.016

羅本華，男，1968年生，主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，E-mail：luobenhua1968@163.com