文建霞，王 建，張 璐,2，楊玉雪,2，陸小華,2，趙艷玲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137； 2.解放軍第302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039)

大鼠慢性心力衰竭模型研究現(xiàn)狀Δ

文建霞1,2*，王 建1，張 璐1,2，楊玉雪1,2，陸小華1,2，趙艷玲2#

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137； 2.解放軍第302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各類心血管疾病發(fā)展至終末階段的共同表現(xiàn)，因其具有較高的發(fā)病率和病死率，近年來備受關(guān)注[1]。據(jù)2016歐洲心臟病學(xué)會統(tǒng)計，發(fā)達(dá)國家成年人心力衰竭的發(fā)病率約為1%～2%，>70歲的人群高達(dá)10%；55歲男性心力衰竭發(fā)生的終生風(fēng)險為33%，高于女性的28%[2]。隨著人口老齡化等諸多因素的影響，心力衰竭發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。而合理應(yīng)用中醫(yī)藥治療CHF的報道亦逐年增加[4]。大量循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)表明，中藥聯(lián)合西藥常規(guī)治療CHF可顯著提高臨床療效和中醫(yī)證候積分，改善CHF相關(guān)結(jié)局指標(biāo)。中藥復(fù)方制劑如參附注射液、參芪扶正注射液等均可作為CHF的輔助用藥[5-6]。為深入探討中醫(yī)藥治療CHF的作用機(jī)制，選擇合理的方式構(gòu)建具有中醫(yī)藥特色的動物模型至關(guān)重要。目前，建立體內(nèi)模型的手術(shù)造模方法有腹主動脈縮窄術(shù)[7]、冠狀動脈結(jié)扎術(shù)[3]等，藥物造模方法有阿霉素(adriamycin,ADR)[8]、異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)[9]等；建立體外模型的方法有戊巴比妥鈉致心力衰竭模型[10]。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，CHF的辨證為本病在心、久病及腎，主要與心陽虛證相關(guān)[11]。研究結(jié)果顯示，CHF的形成與能量代謝障礙、ATP生成不足密切相關(guān)。能量代謝主要依靠脂肪酸的氧化提供能量，機(jī)體存在CHF時則轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕揽刻墙徒馓峁┠芰縖12]，而能量代謝異常又是CHF病情發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[11]。因此，建立一種確切的CHF動物模型對于探討CHF病因、發(fā)病機(jī)制、預(yù)防及治療均有重要意義?，F(xiàn)對近年來CHF大鼠模型的建立方法進(jìn)行綜述，為后期探討基于能量代謝通路、采用中藥治療CHF大鼠的生物學(xué)機(jī)制提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 CHF大鼠模型的基本情況

由于小鼠不易操作，故建立CHF模型一般選用大鼠或清潔級大鼠[10，13]。大鼠的品種以Sprague Dawley(SD)大鼠為主，也有選用Wistar大鼠的報道[14-16]。大鼠的性別一般為雄性，可能與雄性大鼠的耐受力更強(qiáng)相關(guān)，而楊喆等[17]采用雌雄各半的大鼠進(jìn)行造模。動物的存活率因造模方法不同而有所區(qū)別。因此，動物一般選用SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g。

2 CHF模型的分類與制備方法

2.1腹主動脈縮窄術(shù)

采用腹主動脈縮窄術(shù)(abdominal aortic coarctation，AAC)建立的大鼠CHF模型具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，應(yīng)用廣泛，是CHF的理想建模方法[18]。韓曼等[3]探討了AAC與改良冠狀動脈結(jié)扎術(shù)所建立大鼠CHF模型的區(qū)別，結(jié)果顯示，兩種方法均為建立CHF模型的有效方法，均可使模型大鼠的血漿腦鈉肽水平(BNP)顯著升高。徐攀等[14]和楊喆等[17]遵循中醫(yī)整體觀念，采用AAC，參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002年版)[19]中有關(guān)心力衰竭和心陽虛證的分級量化表，并從生物學(xué)特征和客觀指標(biāo)檢測等方面評價模型，成功建立了特色的CHF心陽虛證大鼠模型。唐斌等[20]采用AAC建立大鼠CHF模型，探討了黃芪甲苷對CHF大鼠心肌纖維化及能量代謝的影響。王健等[21]采用腎上AAC法制備CHF大鼠模型，探討了溫陽活血方對CHF大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響。

2.2藥物造模

(1)腹腔注射ADR法：該方法操作簡單、對大鼠損傷較小，大鼠病死率低[22]。與手術(shù)或創(chuàng)傷較大的模型相比，ADR給藥造模是較理想的模型。徐建虎等[16]探討了ADR制備CHF模型的合適劑量，分別腹腔注射ADR 1.25、1.50、2.00 mg/kg，達(dá)到相應(yīng)的累積劑量，結(jié)果顯示，ADR累計劑量<12 mg/kg時不易導(dǎo)致心力衰竭。王楚盈等[23]探討了附子和人參不同比例配伍后對腹腔注射ADR誘導(dǎo)的CHF大鼠血流動力學(xué)的影響，以評估附子和人參對心力衰竭的保護(hù)機(jī)制。(2)皮下注射ISO法：ISO造模法具有無創(chuàng)傷、操作簡便、不需要呼吸機(jī)支持、可重復(fù)性高等特點。羅時珂等[24]和朱云仙等[9]通過ISO法建立CHF模型，并評估了不同劑量ISO對CHF的療效，結(jié)果顯示，皮下注射ISO誘導(dǎo)建立大鼠CHF模型的方法簡便、可靠，日劑量為2.5 mg/kg時較為合適。王曉燕等[15]和Li等[25]均以ISO法建立了大鼠CHF模型。

2.3體外模型制備法

CHF模型的建立大多以在體實驗為主，體外造模的研究相對較少。彭成等[10，26]采用0.8%戊巴比妥鈉建立了體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的CHF模型，倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞搏動明顯減弱或停止為造模成功。

3 CHF模型的評價方法與指標(biāo)

3.1心臟超聲檢查評價心功能

超聲心動圖被廣泛用于心血管疾病相關(guān)指標(biāo)的檢測，通過測定左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室后壁舒張末期厚度(LVPWD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)等參數(shù)，判斷CHF模型是否復(fù)制成功。朱云仙等[9]采用超聲心動圖測定結(jié)果顯示，模型組的LVEF、左心室短軸縮短率(LVFS)明顯低于對照組，LVESD、LVEDD明顯高于對照組，從而判斷CHF模型復(fù)制成功。唐斌等[20]采用AAC法建立了CHF模型大鼠，6周后通過超聲心動圖結(jié)合大鼠癥狀和體征判斷模型是否建立成功，結(jié)果顯示，AAC組大鼠LVESD、LVEDD、LVPWD明顯高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且AAC組大鼠表現(xiàn)出疲乏、呼吸困難、精神萎靡、食欲降低等癥狀，基本符合實驗動物心力衰竭標(biāo)準(zhǔn)[27]，表明心力衰竭復(fù)制成功。

3.2左心室舒張末壓(LVEDP)

LVEDP作為判斷心功能最直接的指標(biāo)，常被用于判斷大鼠CHF模型是否構(gòu)建成功。方煥松等[28]采用AAC復(fù)制大鼠CHF模型，造模8周后檢測血流動力學(xué)指標(biāo)，結(jié)果顯示，LVEDP>15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)時，大鼠逐漸出現(xiàn)倦怠無力、食欲減退、呼吸加快、心跳加速等表現(xiàn)，故以LVEDP≥15 mm Hg作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)[29]。

3.3BNP

CHF時，患者心室合成和分泌的BNP增加，導(dǎo)致血中BNP水平升高。隨著心力衰竭嚴(yán)重程度的增強(qiáng)，血清BNP水平對CHF患者的危險程度及終末期心力衰竭短期預(yù)后具有重要價值，為精確反映心力衰竭程度、評估大鼠CHF模型的重要指標(biāo)[30]。郁淼等[31]觀察了老年CHF患者紐約心臟學(xué)會心功能分級情況與血漿BNP水平的關(guān)系，結(jié)果顯示，血漿BNP水平的升高程度與心功能分級成正比。文獻(xiàn)報道，BNP水平對CHF患者的診斷靈敏度和特異度均>90%，對CHF的療效評價、預(yù)后評估均有較好的指導(dǎo)價值[32]。

3.4其他

其他指標(biāo)如血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、射血分?jǐn)?shù)等亦可反應(yīng)出心力衰竭的病理狀態(tài)。趙京生等[33]采用腹腔注射ADR法建立CHF模型，與空白組比較，模型組血清大鼠Ang-Ⅱ、BNP、cTnⅠ水平均顯著升高，ATP水平顯著降低，表明CHF造模成功。王曉燕[11]等采用皮下注射ISO法復(fù)制大鼠CHF模型，連續(xù)14 d，采用L-400彩色超聲心動儀進(jìn)行心功能檢測，射血分?jǐn)?shù)<60%為造模成功。

4 CHF模型建立方法的討論

4.1ACC建立的壓力超負(fù)荷型CHF模型

ACC法是通過手術(shù)使腹主動脈發(fā)生縮窄，從而升高主動脈壓力，增加心臟后負(fù)荷。術(shù)后早期，心肌組織通過增加脂肪酸(FA)氧化，起到代償性保護(hù)心臟的作用，使心室容積增加，雖然可發(fā)生心肌肥厚，但無法從指標(biāo)上檢測。后期FA和線粒體的氧化活性降低，導(dǎo)致心臟ATP水平顯著降低，心臟發(fā)生失代償，心力衰竭模型形成。該類模型較穩(wěn)定，在國內(nèi)應(yīng)用廣泛，經(jīng)濟(jì)實用，大鼠死亡率較低，逐漸增加的后負(fù)荷與臨床心力衰竭的演變過程相近。

4.2藥物造模

利用某些藥物對心肌的靶向毒性造模：造模過程中給予致毒量的相應(yīng)藥物，使心肌失去正常的收縮和舒張功能，導(dǎo)致心功能下降，從而建立心力衰竭模型。該模型的優(yōu)點是簡便易行，缺點是可能無法全面反映臨床心力衰竭的病理變化，尤其難以體現(xiàn)中醫(yī)的證候模型。(1)腹腔注射ADR法：ADR為廣譜、高效的蒽醌類化療藥，是臨床上常用的抗腫瘤藥，其作用廣泛、選擇性低，會損傷正常機(jī)體的組織器官。該藥與心肌組織的親和力高于其他組織，具有嚴(yán)重的心臟毒性，可造成劑量依賴性不可逆的慢性心肌損傷和CHF，具有時間累積效應(yīng)，作用機(jī)制可能與自由基釋放、增加損傷器官有關(guān)[34]。文獻(xiàn)采用ADR誘導(dǎo)建立CHF模型的方法大多通過設(shè)定給藥劑量、多次給藥以達(dá)到一定的累積劑量，但死亡率均較高。(2)戊巴比妥鈉：該藥為選擇性中樞系統(tǒng)抑制劑，大劑量使用可抑制電壓依賴性心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性，抑制心肌動作電位，以達(dá)到心力衰竭的效果[35]。而與離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的ATP酶在心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的分布較多，與心肌細(xì)胞功能關(guān)系緊密[36]。徐菲飛等[10]采用戊巴比妥鈉體外誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞CHF模型，于顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞搏動停止為造模成功。該方法簡單、可重復(fù)性好，用于原發(fā)心肌病變的心力衰竭研究尤為合適。(3)ISO法：ISO可使大鼠心率加快并持續(xù)增強(qiáng)心肌收縮力，從而使心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死、纖維化和凋亡，導(dǎo)致心室重構(gòu)，最終引發(fā)心力衰竭。而ISO建立的CHF模型存在給藥方式、劑量、注射時間上的差異，導(dǎo)致大鼠死亡率和病變情況有所不同[37]。有研究采用皮下注射ISO，日劑量分別為2.0、2.5、3.0 mg/kg，大鼠成活率分別為100%、90%、30%。朱云仙等[9]采用皮下注射ISO，日劑量1mg/kg、連續(xù)14 d，第15日起日劑量改為0.5 mg/kg、連續(xù)14 d，建模時間28 d，成功復(fù)制了大鼠CHF模型，存活率為46.2%。因此，仍需綜合建模時間，積累經(jīng)驗，提高建模的成功率和可復(fù)制性。

5 討論

目前，建立CHF動物模型的方法包括手術(shù)造模法和藥物造模法。手術(shù)造模包括冠狀動脈結(jié)扎術(shù)、AAC等；藥物造模法包括給予ISO、戊巴比妥鈉、ADR等。正確建立符合中醫(yī)證候的動物模型對于中醫(yī)學(xué)的研究至關(guān)重要，也是中醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個難題。CHF與中醫(yī)學(xué)理論上的陽虛證相關(guān)[38]，主要以機(jī)體陽氣不足、器官功能衰退為主要表現(xiàn)，而陽虛證大鼠會出現(xiàn)體溫下降、精神不振、少動、水腫、全身變涼等現(xiàn)象。結(jié)合大鼠的體質(zhì)量、心率、呼吸頻率及超聲心動圖檢測等相關(guān)指標(biāo)，可更加全面地評估陽虛證大鼠的模型。該評估方法符合中醫(yī)學(xué)理論和辨證論治原則，對于運用現(xiàn)代藥理學(xué)和分子生物學(xué)方法等進(jìn)行中醫(yī)藥理論的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

CHF模型的建立涉及手術(shù)操作，而減少手術(shù)操作的失誤，可提高動物存活率。手術(shù)或藥物對于動物的刺激程度不同，對于實驗數(shù)據(jù)的影響程度也不同。選擇合適的造模方法、評價指標(biāo)及模型評價標(biāo)準(zhǔn)的意義重大。

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R99

A

1672-2124(2017)09-1157-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.09.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81573631、No.81303120)

*博士研究生。研究方向：中藥基礎(chǔ)理論研究。E-mail：wenjx2048@163.com

#通信作者：主任藥師，博士，研究員。研究方向：中藥藥性理論研究、配伍研究。E-mail：zhaoyl2855@126.com

2017-08-02)