楊 斐，趙建寧，徐海棟 （南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇南京210002）

椎間盤髓核細胞修飾的相關研究進展

楊 斐，趙建寧，徐海棟 （南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇南京210002）

椎間盤退變性疾病是臨床常見疾病，目前臨床的治療方法只能解除癥狀，無法從根本上治愈該?。韬私M織工程研究能夠重建髓核組織，修復和逆轉退變椎間盤．在組織工程研究中，同種異體的髓核細胞常被用作種子細胞，為了使種子細胞在移植后獲得更高的活性，更長的存活時間以及更好的功能表達，要對髓核細胞進行一系列的修飾，主要包括：抗凋亡、調節(jié)自噬以及永生化修飾．抗凋亡和調節(jié)自噬的目的都是使種子細胞在移植后具有較高的活性，能夠長期有效地行使功能，從而保證治療的長期效果．永生化是為了解決髓核細胞傳代次數有限，數量不足的問題．本文主要圍繞以上三個方面展開綜述．

椎間盤；髓核細胞；細胞修飾；凋亡；自噬；永生化

0 引言

椎間盤退變性疾病是臨床較為常見的疾病，也是引起腰背部疼痛的主要原因［1］．椎間盤退變從20歲時就可以發(fā)生．不良的生活習慣、長期的大量載荷通過脊柱、應激、遺傳以及抽煙等因素都與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關［2－3］，其臨床表現為頸部、胸部、腰背部的疼痛以及其對應神經支配區(qū)域出現的運動和感覺障礙．其最主要的病理變化為正常椎間盤組織結構的改變．正常的椎間盤組織是由三個部分組成的：終板、纖維環(huán)以及髓核．終板與椎體相連，被一層透明軟骨覆蓋，富含有毛細血管，為椎間盤提供營養(yǎng)物質．纖維環(huán)位于椎間盤外層，由多個薄層纖維組織排列組成，最外層為成纖維細胞和Ⅰ型膠原纖維，內層為類軟骨細胞和Ⅱ型膠原纖維，纖維環(huán)具有較強的抗拉伸能力，具有維持椎間盤恒定高度的作用．髓核位于椎間盤中央，被纖維環(huán)包繞，呈凝膠狀，含有髓核細胞，主要包括脊索細胞和類軟骨細胞，其基質主要包括Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等，具有較高的親水性，能夠保證髓核內部穩(wěn)定的含水量、滲透壓、pH以及離子濃度，維持正常代謝，同時承載部分椎間盤應力，維持椎間盤的形態(tài)和靜水壓力，協(xié)同纖維環(huán)共同實現生物學效應［4－5］．椎間盤退變發(fā)生的機制目前還不是很清楚，但是大部分學者認為髓核細胞退變和凋亡是該病的始動因素．在人體椎間盤發(fā)育過程中，椎間盤的血管網逐漸消失，脊索細胞逐漸減少，至成人時已無脊索細胞，主要的髓核細胞為類軟骨細胞，它具有合成細胞外基質蛋白聚糖以及Ⅱ型膠原的作用，而細胞外基質蛋白對維持椎間盤正常生理功能至關重要．正常的椎間盤不含有血管，為低氧環(huán)境．髓核細胞所需的營養(yǎng)物質、氧以及產生的代謝產物主要通過擴散作用進出髓核．隨著長期的應力刺激和低氧狀態(tài)下的代謝異常蓄積，髓核細胞開始出現凋亡、自噬等一系列變化，細胞活性降低，細胞外基質合成功能減退，細胞外基質代謝異常又進一步影響營養(yǎng)物質和氧代謝，加劇髓核細胞外環(huán)境酸化，形成惡性循環(huán)．最終出現纖維環(huán)膠原纖維薄層結構紊亂、裂隙生成，椎間盤生物力學功能喪失，相應的臨床癥狀也逐步出現［6］．

目前對于椎間盤退變性疾病的臨床治療可大致分為保守治療及手術治療．非手術治療主要是通過休息或者藥物治療緩解局部炎癥刺激，而手術治療中無論是脊柱融合手術還是非融合手術，也主要是為了緩解臨床癥狀，而非根本性的治療［7］．針對該病的始動因素，逆轉髓核細胞凋亡以及自噬，促進髓核細胞活性以及其功能表達成為根治椎間盤退變性疾病的主要方向．現階段較多的組織工程研究將同種異體髓核細胞作為種子細胞用于研究治療椎間盤退變性疾病，在研究中往往需要對髓核細胞進行一系列修飾，以使其獲得更高的活性，更長的存活時間以及更好的功能表達［8］．修飾的主要方向大致可以分為三類：抗凋亡、調節(jié)自噬以及永生化修飾．本文通過對髓核細胞的抗凋亡、調節(jié)自噬以及永生化修飾等三方面進行綜述，旨在探討：①不同修飾方法所基于的具體機制是否合理；②運用于臨床的可能性；③其臨床治療的真正價值．

1 髓核細胞抗凋亡修飾

髓核細胞移植成功的關鍵在于其抗凋亡能力，即如何保證在已經出現椎間盤退變的宿主體內實現大量移植髓核細胞的長期存活，并實現其功能表達．早期的研究著重于提高髓核細胞的抗凋亡能力．髓核細胞移植后，在已經發(fā)生退變的椎間盤中，移植受體細胞產生的NO、過氧化物、自由基等因素均可誘發(fā)內質網應激反應（ERS），進而導致髓核細胞出現凋亡［9］．真核細胞的大多數功能蛋白一般需轉位至內質網腔內進行修飾和折疊．氧化應激、缺血、鈣穩(wěn)態(tài)的失衡等諸多因素均可影響內質網的功能，導致未折疊或錯誤折疊蛋白的積累，這一過程即稱之為ERS［10］．ERS又可進一步激活未折疊蛋白反應（UPR），早期表現為蛋白質翻譯和轉運的抑制，促進分子伴侶的表達，誘導內質網相關性降解（ERAD），維持ER的正常功能．當長期持續(xù)的應激或刺激強度超過內質網自身處理能力時，UPR便會啟動細胞凋亡信號，導致細胞凋亡的發(fā)生［11］，其中，X盒結合蛋白1（X?box binding protein 1，XBP1）是ERS反應的關鍵信號調控因子，XBP1 mRNA經過需肌醇酶1（inositol?requiring kinase 1，IRE1）的剪接，由原本具有261個氨基酸的未剪接型 XBP1（X?box binding protein?1 unsplicing，XBP1u）轉錄激活成為由376個氨基酸構成的剪接型XBP1（X?box binding protein?1 splicing，XBP1s）．XBP1s可調控內質網相關蛋白的降解和分子伴侶的合成，促進髓核細胞的生存［12］．其具體機制目前尚未完全闡明，需要更多研究來揭示XBP1在保護椎間盤髓核細胞抗凋亡過程中作用的分子機制及相關信號通路．

SOX9基因屬于SOX基因大家族成員之一，是軟骨細胞合成Ⅱ型膠原過程中重要的因子．在椎間盤退變過程中出現Ⅱ型膠原的減少，其過程與SOX9基因的表達減少有關［13］．有學者通過脂質體將SOX9基因和GDF5基因同時轉染到骨髓間充質干細胞，發(fā)現顯著提高了骨髓間充質干細胞向髓核細胞分化增殖的能力，同時，髓核細胞獲得了較高的活性和抗凋亡能力［14］．將慢病毒作為載體轉染SOX9基因的骨髓間充質干細胞同樣也能高度表達Ⅱ型膠原以及蛋白聚糖并向髓核樣細胞分化，這些實驗充分說明了經過SOX9基因修飾的髓核類細胞具有更完整的細胞表型，更優(yōu)秀的蛋白合成能力以及更良好的抗凋亡活性，可進一步用于椎間盤組織工程的研究當中．

PcG蛋白是一種通過染色質修飾調控靶基因的轉錄抑制子的蛋白，具有細胞記憶功能，可以保證細胞傳代的穩(wěn)定．CBX8為PcG蛋白的核心組成部分，能夠通過相關結合位點以及信號通路如INK4A?ARF通路來調整細胞的增殖，延緩細胞的衰老［15］．同時，也有報道稱CBX8參與了細胞DNA損傷的修復［16］．為了研究CBX8對椎間盤髓核退變的相關作用機制，國內有學者干擾髓核細胞CBX8表達后發(fā)現髓核細胞增殖能力減弱，細胞周期進程減慢，慧尾實驗證實當CBX8表達降低后，髓核細胞的DNA修復能力將會受到抑制．相反，調高CBX8表達后髓核細胞活性升高，增殖相對活躍，多次傳代培養(yǎng)后表型保持相對完整，可作為髓核組織工程種子細胞的選擇［17］．

在椎間盤退變過程中，TGF?β1在早期能夠促進髓核細胞外基質的生成，減慢退變發(fā)生的速度，然而隨著成纖維細胞不斷增多取代髓核細胞，在TGF?β1作用下合成Ⅰ型以及Ⅲ型膠原，Ⅱ型膠原合成減少，髓核生理結構破壞，退變加速，最終導致整個椎間盤纖維環(huán)失去原有力學性質［18］．TGF?β3在TGF?β家族中屬于正向調節(jié)因子，在降低TGF?β1表達的同時能夠促進Ⅱ型膠原的合成［19］．腺病毒載體技術能夠將TGF?β3轉染至退變的髓核細胞，體外實驗發(fā)現細胞活性得到明顯改善，Ⅱ型膠原及蛋白聚糖表達升高，在進一步的動物實驗中，TGF?β3轉染修飾的髓核細胞被移植到新西蘭兔退變動物模型中，14周后組織學觀察發(fā)現缺損的椎間盤部分得到新生髓核的填充，髓核細胞數目增多，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖增多，并且使用該種方法轉染的髓核細胞，其目的基因可保持穩(wěn)定表達的時間長達3個月，可以有效運用于組織工程研究［20］．

2 髓核細胞自噬調節(jié)

凋亡和自噬是細胞程序性死亡的兩種形式．繼抗凋亡研究之后，后續(xù)的研究發(fā)現自噬對調節(jié)髓核細胞程序性死亡也同樣重要．與凋亡相比，自噬不出現凋亡所特有的凋亡小體以及核固縮現象，但會在細胞胞質內形成自噬體．在正常情況下，自噬對細胞是有利的，能夠促進細胞在應激狀態(tài)下的存活，清除細胞內由應激產生的氧自由基、錯誤折疊蛋白等．但是過度自噬將會超出細胞的代償能力，溶酶體將無法降解全部自噬體，由此誘發(fā)細胞Ⅱ型程序性死亡或者觸發(fā)細胞凋亡最終導致細胞死亡［21］髓核細胞處在缺血、缺氧的椎間盤環(huán)境中，同樣也存在著自噬現象，而且其水平會隨著年齡的增長以及退變程度的加重而不斷地提高［22］．有研究發(fā)現自噬對于髓核細胞有兩方面的作用：一方面在正常椎間盤組織中，自噬能夠保證髓核細胞在低血供、低氧狀態(tài)下的穩(wěn)定，而發(fā)生重度椎間盤退變的動物模型中，其自噬水平要明顯低于正常，相反凋亡水平明顯升高．另一方面，在椎間盤退變早期，由于代償作用使自噬水平明顯升高，超過溶酶體代償能力，過度自噬導致了髓核細胞的死亡［23］．因此，針對組織工程中髓核細胞自噬水平的調控應該以維持其平衡為目標，既要保證一定的自噬水平以維持細胞的穩(wěn)定，同時又要避免自噬過度對細胞產生損傷．目前髓核細胞自噬水平的調節(jié)機制還不清楚，有研究［24］發(fā)現在通過血清剝奪誘導SD大鼠椎間盤細胞發(fā)生自噬后，IL?1β能促進其自噬水平進一步的升高．椎間盤本身存在的低氧環(huán)境對自噬也具有重要的調節(jié)作用，髓核細胞在低氧環(huán)境中能夠通過下調ROS來避免過度自噬，促進其在血清剝離下的存活［25］．因此，在髓核組織工程構建中，應盡可能保證髓核細胞處于相對低氧環(huán)境．

3 椎間盤髓核細胞永生化

目前，隨著基因轉染技術的不斷發(fā)展，髓核細胞永生化的構建成為了新的研究方向．正常細胞在體外經過有限次數的傳代后便會衰老死亡，髓核細胞在體外培養(yǎng)傳代時間平均為21 d，經過10次左右傳代后便停止增殖．在組織工程研究中，為了獲得更多的髓核細胞資源，往往會對種子細胞進行永生化修飾．細胞永生化是指細胞在一定條件干預下逃離增殖衰老危機，獲得無限增殖能力的過程，但人類細胞很少會出現自發(fā)永生化［26］．研究中，可以將永生化基因通過基因轉染技術導入髓核細胞，建立永生化髓核細胞株，從而獲得豐富的種子細胞來源．現階段研究發(fā)現，永生化的發(fā)生主要與細胞端粒以及端粒酶有關．因此，針對髓核細胞永生化的修飾，主要是通過修飾端粒以及端粒酶來完成．端粒的長度決定了細胞的有絲分裂次數，而端粒酶能夠維持端粒長度的恒定［27］．因此，通過活化端粒酶，提高其表達可以誘導髓核細胞發(fā)生永生化．有學者運用人端粒酶反轉錄酶轉染髓核細胞，成功地構建了永生化髓核細胞，并且在構建的永生化髓核細胞中加入重組綠色熒光蛋白示蹤，具有較高的轉染效率，同時永生化髓核細胞的表型及活性在多次傳代后能夠保持穩(wěn)定，該技術能夠為髓核組織工程的研究提供豐富的種子細胞［28］．

髓核細胞修飾的發(fā)展大致經歷了抗凋亡、自噬調節(jié)以及目前的永生化這一系列過程．三者之間也存在著緊密聯(lián)系．①三類修飾方法中抗凋亡修飾最早出現，也是基礎，自噬調節(jié)是對抗凋亡修飾的補充，永生化研究則是目前的新的研究方向；②三者的目的都是為了提高髓核細胞在移植后的細胞活性；③三者基于不同的機制，存在各自的優(yōu)點和缺陷，聯(lián)合運用相關方法或許能夠達到更好的效果．

4 總結與展望

髓核組織工程研究對于治療椎間盤退變性疾病是一種新的思路，能夠從根本上修復甚至逆轉退變過程．它主要包含三個要素：種子細胞，細胞支架以及生長因子．其中，種子細胞是整個組織工程研究中最重要的對象，如何能夠獲得大量表型穩(wěn)定，功能和活性良好的種子細胞一直是組織工程研究的問題．同種異體的髓核細胞因為其不需要誘導分化，適應低氧環(huán)境等優(yōu)點被用作種子細胞，為了保證移植后的活性和功能，髓核細胞需要進一步修飾．抗凋亡和調節(jié)自噬的目的都是使種子細胞在移植后具有較高的存活率，能夠長期有效地行使功能，從而保證治療的長期效果．永生化則是為了解決髓核細胞傳代次數有限，數量不足的問題，組織工程治療椎間盤退變需要運用大量種子細胞，只有在保證充足的髓核細胞數量前提下，才能實現進一步的研究和治療．在解決了以上問題后，髓核組織工程治療椎間盤退變性疾病才能最終實現臨床運用．

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Advances in research of nucleus pulposus cell modification in intervertebral discs

YANG Fei，ZHAO Jian?Ning，XU Hai?Dong
Nanjing General Hospital of PLA，Nanjing 210002，China

Degenerative disc disease is a common clinical dis?ease．The current clinical treatment can only relieve symptoms．However，nucleus pulposus tissue engineering can reconstruct the nucleus pulposus，repair and reverse degenerative disc．In tissue engineering studies，allogeneic nucleus pulposus cells are often used as seed cells．In order to make seed cells obtain higher viability，longer survival time and better functional expression after transplantation，a series of modifications have to be applied to nucleus pulposus cells，including：anti?apoptosis，regulation of autophagy and cellular immortality．The purpose of anti?apoptosis and autophagy regulation is to make seed cells have high viability after transplantation，and to ensure the long?term effect of treat?ment．Cellular immortality can solve the problem of limited pas?sage number and insufficient cell resources．This article mainly focuses on the above three aspects．

intervertebral disc；nucleus pulposus cells；cell modification；apoptosis；autophagy；immortalization

R681．5

A

2095?6894（2017）02?53?04

2016－12－27；接受日期：2017－01－12

國家自然科學基金青年基金項目（81501925）

楊 斐．E?mail：1415619503＠qq．com

徐海棟．博士，副主任醫(yī)師．研究方向：脊柱外科、骨科基礎與轉化．E?mail：xuhaidong1980＠163．com