姚 麗，鞏 麗，朱少君，韓秀娟，蘭 淼，張 偉 （第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院病理科，陜西西安710038）

·檢驗與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

肺癌與HPV感染相關(guān)性的初步研究

姚 麗，鞏 麗，朱少君，韓秀娟，蘭 淼，張 偉 （第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院病理科，陜西西安710038）

目的：應(yīng)用液相芯片技術(shù)分析肺癌患者與HPV感染的相關(guān)性．方法：重組質(zhì)粒表達(dá)HPV16 E6和E7蛋白，同微球偶聯(lián)后作為抗原，應(yīng)用Luminex系統(tǒng)檢測肺癌患者血清中的相應(yīng)抗體．結(jié)果：肺癌組HPV16 E6／E7抗體水平顯著高于正常對照組，肺鱗狀細(xì)胞癌與腺癌腫瘤組對比，肺鱗狀細(xì)胞癌HPV16 E6／E7抗體陽性率顯著高于肺腺癌組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）．結(jié)論：HPV感染與肺鱗狀細(xì)胞癌具有一定的相關(guān)性，為進一步研究肺鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的分子機制提供了依據(jù)．

肺癌；HPV；液相芯片

0 引言

肺癌從組織學(xué)上分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌［1］，而非小細(xì)胞肺癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌．人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）病毒為DNA病毒，通常感染人體特定部位的皮膚和粘膜的基底細(xì)胞．根據(jù)其與人類腫瘤的關(guān)系，HPV可分為高危型（HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35）、中危型（HPV31，HPV33，HPV35）和低危型（HPV6，HPV11）［2－3］．眾所周知 HPV感染可以導(dǎo)致宮頸癌，HPV感染與陰道、肛門和陰莖癌等外陰部癌癥的發(fā)生存在明顯的相關(guān)性［4］．本研究應(yīng)用高通量的Luminex 100 液相芯片技術(shù)檢測肺癌與HPV病毒感染的關(guān)系以及相關(guān)的HPV類型，為肺癌的預(yù)測及預(yù)防提供理論基礎(chǔ)及臨床方法，現(xiàn)報道如下．

1 材料和方法

1．1 實驗標(biāo)本患者血清標(biāo)本選自唐都醫(yī)院，經(jīng)臨床及病理診斷為肺癌的患者82例，正常對照血清選自健康獻(xiàn)血者67例．

1．2 主要試劑酪蛋白及谷胱甘肽購自sigma公司，蛋白酶抑制劑購自Roche公司，CBSK及濾膜板均購自millipore公司，鏈霉素標(biāo)記的藻紅蛋白購自Invitrogen公司，其他試劑均為進口分析純．pGEX?HPV16?tag質(zhì)粒由本實驗室保存．

1．3 方法

1．3．1 高度危險型HPV16 E6和E7蛋白表達(dá) 質(zhì)粒pGEX?GST?HPV16 E6／E7?tag電轉(zhuǎn)化 E．coli BL21（DE3），挑單克隆的菌落，在含有氨芐霉素的5 mL LB中37℃震蕩培養(yǎng)12 h，然后接種于60 mL LB中，37℃震蕩過夜，加入 350 mL LB，當(dāng)室溫培養(yǎng)至OD600＝0．5時，加IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達(dá)6 h，離心收集菌體，重懸于PBS，超聲裂解，14000 rpm離心，收集上清液．用Bradford法測量蛋白濃度．

1．3．2 G?C微球包被HPV16 E6／E7蛋白及純化1 mg／mL含GST?HPV16 E6／E7?tag蛋白的菌體裂解液加適量的G?C微球，室溫避光搖床孵育1 h，阻斷緩沖液洗滌3次，其他的菌液雜蛋白由于不含有GST蛋白無法與G?C微球結(jié)合，故通過洗滌過程被清除，加適量阻斷緩沖液重懸．

1．3．3 血清檢測 血清1∶50孵育于阻斷緩沖液，室溫1 h．濾膜96孔板加50 μL HPV16 E6／E7蛋白包被的G?C微球和50 μL孵育后的血清，室溫1 h，真空泵阻斷緩沖液洗滌3次，1∶1000生物素標(biāo)記的羊抗人IgG100 μL，室溫1 h，洗滌3次，1∶1000鏈霉素標(biāo)記的藻紅蛋白100 μL，室溫1 h，洗滌3次，100 μL阻斷緩沖液重懸，Luminex系統(tǒng)檢測MFI．

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，行t檢驗，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 應(yīng)用Luminex系統(tǒng)檢測肺癌患者及正常對照血清中HPV16 E6／E7抗體Luminex系統(tǒng)檢測的優(yōu)點在于不同的微球具有不同的光譜，能夠被單獨識別，故本次實驗應(yīng)用兩種微球分別包被兩種HPV抗原（HPV16 E6和E7蛋白），置于1個反應(yīng)體系中同時檢測1份血清中的HPV16的兩種抗體．結(jié)果顯示，肺癌組HPV16 E6／E7抗體水平顯著高于正常對照組（圖1）．

圖1 肺癌患者及正常對照血清中HPV16抗體檢測結(jié)果

2．2 應(yīng)用Luminex系統(tǒng)檢測肺鱗狀細(xì)胞癌及肺腺癌患者血清中HPV16 E6／E7抗體選取肺癌患者82例作為研究對象，其中肺鱗狀細(xì)胞癌患者50例，肺腺癌患者32例，通過Luminex系統(tǒng)檢測肺鱗狀細(xì)胞癌及肺腺癌患者血清中HPV16 E6／E7抗體，結(jié)果顯示，肺鱗狀細(xì)胞癌患者血清中HPV16 E6／E7抗體陽性率顯著高于肺腺癌組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）．

表1 肺鱗狀細(xì)胞癌及肺腺癌患者血清中HPV16抗體水平檢測

3 討論

1979年，Syrj?nen［5］首次在肺癌中觀察到 HPV感染病灶的形態(tài)學(xué)改變．隨后，不同的研究機構(gòu)應(yīng)用不同方法檢測肺癌組織中是否含有HPV DNA，如斑點印記、原位雜交、Sourthern bolt及PCR法［6－7］．但由于方法的不同及實驗室之間的差異，不同的個案報道中，HPV DNA的檢出率相差很大［8］．肺癌從組織學(xué)上分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌［9］，而非小細(xì)胞肺癌又包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌［10］．肺鱗狀細(xì)胞癌通常的發(fā)病模式為在各種因素作用下支氣管的纖毛柱狀上皮鱗狀上皮化生，然后經(jīng)過不同階段的不典型增生，最后癌變形成鱗狀細(xì)胞癌［11－12］．這個過程同HPV易感染宮頸的鱗柱交界處有相似之處．HPV病毒含有兩個主控轉(zhuǎn)化過程的原癌基因：E6和E7［13］，其蛋白的抗體在健康人群中少有發(fā)現(xiàn)，只同浸潤性癌高度相關(guān)，具有很好的特異性和敏感性，這可能是因為在初次感染和隱性感染中HPV病毒E6和E7蛋白表達(dá)的量少或未接觸到免疫系統(tǒng)［3，14］．

本研究應(yīng)用高通量Luminex系統(tǒng)檢測肺癌患者血清中的HPV16抗體，結(jié)果顯示，與正常健康人群血清相比，肺癌患者血清中HPV16抗體水平明顯增高，并且肺鱗狀細(xì)胞癌患者血清HPV16抗體陽性率高于腺癌患者，這提示HPV可能參與肺鱗狀細(xì)胞癌的癌變過程，為肺鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)防、診斷和治療提供了新的思路和靶點．

［1］Sullivan I，Planchard D．ALK inhibitors in non?small cell lung cancer：the latest evidence and developments［J］．Ther Adv Med Oncol，2016，8（1）：32－47．

［2］Choi YJ，Park JS．Clinical significance of human papillomavirus genotyping［J］．J Gynecol Oncol，2016，27（2）：e21．

［3］Xu Y，Liu S，Yi H，et al．Low prevalence of human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma in Chinese patients［J］．J Med Virol，2015，87（2）：281－286．

［4］Chen J，Zhao KN．HPV?p53?miR?34a axis in HPV?associated cancers［J］．Ann Transl Med，2015，3（21）：331．

［5］Syrj?nen KJ．Condylomatous changes in neoplastic bronchial epitheli?um．Report of a case［J］．Respiration，1979，38（5）：299－304．

［6］Galvan A，Noci S，Taverna F，et al．Testing of human papillomavirus in lung cancer and non?tumor lung tissue［J］．BMC Cancer，2012，12：512．

［7］Syrjanen KJ．HPV infections and lung cancer［J］．J Clin Pathol，2002，55（12）：885－891．

［8］Zhai K，Ding J，Shi HZ．HPV and lung cancer risk：a meta?analysis［J］．J Clin Virol，2015，63：84－90．

［9］Couraud S，Zalcman G，Milleron B，et al．Lung cancer in never smokers??a review［J］．Eur J Cancer，2012，48（9）：1299－1311．

［10］利基林．血管內(nèi)皮生長因子在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)意義［J］．轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志，2015，2（4）：18－19．

［11］郭楠楠，李珊珊，張 文，等．血清標(biāo)志物（NSE、CEA、CA?125、CYFRA21?1）和分子標(biāo)志物（MDR?1、LRP、RRM?1、EGFR、ERCC?1、BRCA?1）在非小細(xì)胞肺癌患者原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的表達(dá)［J］．轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志，2014，1（1）：24－29．

［12］Clément?Duchêne C，Alla F，Gauchotte G，et al．Is there a relationship between the presence of lung mucosa preinvasive lesions and lung cancer incidence？Influence of tobacco consumption［J］．Lung Cancer，2014，84（2）：134－138．

［13］Zang B，Huang G，Wang X，et al．HPV?16 E6 promotes cell growth of esophageal cancer via downregulation of miR?125b and activation of Wnt／beta?catenin signaling pathway［J］．Int J Clin Exp Pathol，2015，8（10）：13687－13694．

［14］Grm HS，Bergant M，Banks L．Human papillomavirus infection，cancer＆therapy［J］．Indian J Med Res，2009，130（3）：277－285．

Primary study on the correlation between lung cancer and HPV infection

YAO Li，GONG Li，ZHU Shao?Jun，HAN Xiu?Juan，LAN Miao，ZHANG Wei
Department of Pathology，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medi?cal University，Xi'an 710038，China

AIM：To analyze the correlation between lung cancer and HPV infection by Luminex technology．METHODS：HPV16 E6／E7 proteins binding to microparticle were expressed with recombinant plasmid．The corresponding antibodies in serum of patient with lung cancer were detected by Luminex technology．RESULTS：The level of HPV16 E6／E7 antibodies in lung cancer group were significantly higher than those of normal control group，and the difference was statistically significant（P＜0．05）．The antibody positive rate of HPV16 E6／E7 in squamous cell carcinoma of lung group was significantly higher than that of adenocarcinoma group，and the difference was statistically significant（P＜0．05）．CON?CLUSION：There was a correlation between HPV infection and lung squamous cell carcinoma，which will be helpful for the further study of molecular mechanism of lung squamous cell carcinoma．

lung cancer；HPV；liquichip

R734．2

A

2095?6894（2017）02?46?02

2016－11－25；接受日期：2016－12－10

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目（2013JQ4039）

姚 麗．博士，主治醫(yī)師．研究方向：腫瘤分子病理學(xué)．Tel：029?84777744 E?mail：yaoli＠fmmu．edu．cn

張 偉．主任醫(yī)師，教授．E?mail：zhangyi＠fmmu．edu．cn