李 東，湯貝貝，王穎潔，紀(jì)艷芹，王 飛，路鎮(zhèn)宇，王 曼，張亞妮，李碧春

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/江蘇省動物繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009）

蛋白質(zhì)代謝通路對雞雄性生殖細(xì)胞分化的調(diào)控

李 東，湯貝貝，王穎潔，紀(jì)艷芹，王 飛，路鎮(zhèn)宇，王 曼，張亞妮，李碧春

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/江蘇省動物繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009）

【目的】探究蛋白質(zhì)代謝在雞雄性生殖細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制，為完善雞胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）體外向雄性生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系研究提供依據(jù)。【方法】采用流式分選的方法獲取高純度的ESC、原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）和精原干細(xì)胞（spermatogonia stem cell，SSCs），分別提取細(xì)胞的總 RNA，采用 RNA-Seq方法對 3種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行深度測序，然后進(jìn)行 WEGO（web gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，篩選出雞雄性生殖細(xì)胞分化過程中參與蛋白質(zhì)代謝的關(guān)鍵通路及其關(guān)鍵基因，RT-qPCR (Real time Quantitative PCR) 檢測部分關(guān)鍵差異基因的表達(dá)變化，并與RNA-Seq（RNA sequencing）結(jié)果進(jìn)行比較分析，同時(shí)分別從體內(nèi)和體外水平對關(guān)鍵基因NOS2進(jìn)行抑制，觀察各分組不同天數(shù)的細(xì)胞形態(tài)變化及檢測NOS2和C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因表達(dá)變化情況?！窘Y(jié)果】在雄性生殖細(xì)胞分化的整個(gè)階段，有697個(gè)差異基因參與生物代謝，顯著富集于精氨酸-脯氨酸代謝通路、酪氨酸代謝通路以及色氨酸代謝通路，在這3條通路上篩選出NOS2、FAH和IDO等關(guān)鍵性基因，這些基因的在ESCs向SSCs分化過程中表達(dá)變化趨勢與其在RNA-Seq中的結(jié)果一致。體內(nèi)抑制NOS2基因后，NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因在空白組和對照組之間無顯著性的差異，而在抑制劑組中，NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)了降低；而體外抑制NOS2基因后，對照組中的ESCs在2、4、6、8和10d內(nèi)細(xì)胞不斷增殖，但是未出現(xiàn)類胚體；RA誘導(dǎo)組中，2d出現(xiàn)小的類胚體，4d類胚體增大，且數(shù)量增多，6d類胚體邊緣開始出現(xiàn)破裂，8d類胚體解體，10d出現(xiàn)類精原樣細(xì)胞；抑制劑組中，ESCs在 2、4、6、8和 10d內(nèi)無類胚體出現(xiàn)，且相較于對照組細(xì)胞增殖緩慢；RA+抑制劑組中，2和4d內(nèi)無類胚體出現(xiàn)，細(xì)胞增殖緩慢，6d出現(xiàn)小的類胚體，8d類胚體數(shù)量少量增多，且體積稍顯增大，10d類胚體開始裂解。并且經(jīng)過抑制劑的抑制后，NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β 1等生殖標(biāo)記基因的表達(dá)量在RA誘導(dǎo)組、抑制劑組和RA+抑制劑組中相對于對照組均呈顯著性或極顯著性的下調(diào)趨勢?！窘Y(jié)論】基于RNA-Seq技術(shù)及生物信息學(xué)方法篩選出ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化過程中精氨酸-脯氨酸代謝通路及關(guān)鍵基因NOS2的基礎(chǔ)上，通過對NOS2基因在雞體內(nèi)和體外的抑制，發(fā)現(xiàn)NOS2在被抑制后，ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化的過程受到抑制。說明了精氨酸-脯氨酸代謝通路及關(guān)鍵基因NOS2對ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

RNA-Seq；雞胚胎干細(xì)胞；原始生殖細(xì)胞；精原干細(xì)胞；雄性生殖細(xì)胞；一氧化氮合成酶2；抑制劑；分化

0 引言

【研究意義】生殖細(xì)胞在生命循環(huán)和傳承中有著不可替代的作用，因?yàn)槠淇梢詫⑦z傳信息傳遞至下一代，這一特性使其迅速成為生命科學(xué)研究的重要課題之一。多年來，科研工作者一直致力于將ESC體外誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞，以解決不孕不育的問題，并通過生殖細(xì)胞的研究來探索細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制[1]。【前人研究進(jìn)展】細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育與細(xì)胞內(nèi)代謝水平息息相關(guān)，蛋白質(zhì)代謝在細(xì)胞分化過程中具有重要的作用。韓明權(quán)[2]等在研究藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)代謝失常，S+G2/M 期細(xì)胞比例降低，從而影響了腫瘤細(xì)胞的分化和增殖情況；Fei等[3-6]分別發(fā)現(xiàn)Smad 蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在多種細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)分化過程具有重要的調(diào)控作用。TAN等[7]在研究精氨酸對新生仔豬小腸細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，外源添加精氨酸能夠調(diào)節(jié)新生仔豬體內(nèi)精氨酸代謝，從而影響小腸細(xì)胞的增殖、分化和功能。這些研究都充分說明蛋白質(zhì)代謝在細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育過程中扮演非常重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此，本研究基于前期RNA-Seq深度測序的基礎(chǔ)上，通過WEGO分析（http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）和KEGG（http://www.funnet.ws/）通路顯著富集分析篩選與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的通路和關(guān)鍵性差異基因，并對關(guān)鍵基因進(jìn)行體內(nèi)和體外抑制，旨在初步探究蛋白質(zhì)代謝及其關(guān)鍵基因?qū)π坌陨臣?xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，為建立固定、規(guī)范、有效的體外細(xì)胞誘導(dǎo)體系打下良好的基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)初步探究蛋白質(zhì)代謝通路對雄性生殖細(xì)胞分化的影響，還需要通過 RNA干擾、基因敲除或敲入、免疫共沉淀等一系列的方法進(jìn)一步探究其具體的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

試驗(yàn)于2012年8月24日分離細(xì)胞起至2014年12月20日完成稿件，于揚(yáng)州大學(xué)推廣樓320課題組完成。試驗(yàn)受精蛋來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所實(shí)驗(yàn)禽場如皋黃雞群，共使用18 340枚，分3個(gè)重復(fù)組，在37.5°C，相對濕度為60%的條件下孵化。孵化分期采用文獻(xiàn)[12]和[13]建立的方法。

DMEM培養(yǎng)液（Gibco）、小牛血清（Gibco）、絲裂霉素-C（Roche）、β-琉基乙醇（BBI）、雞血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、胰蛋白酶、膠原酶I、堿性成纖維生長因子（bFGF）、人胰島素樣生長因子（hIGF）、人干細(xì)胞因子（hSCF）、小鼠白血病抑制因子（mUF）均源自Sigma公司、NOS2抑制劑S-Methylisothiourea sulfate（Santa Cruz）、維甲酸（RA）（Sigma）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞ESCs的分離、培養(yǎng)、傳代及分選 ESCs的分離、培養(yǎng)及傳代方法參見文獻(xiàn)[13, 14]的方法。采用PCR方法對其進(jìn)行雌雄鑒定，以排除雌性樣本的干擾。

采用流式細(xì)胞分選技術(shù)，對運(yùn)用抗體標(biāo)記的ESC、PGC和SSC進(jìn)行分選，確保獲得高純度的細(xì)胞。其中選擇SSEA-1、SOX2干細(xì)胞表面特異抗原及分子標(biāo)記物標(biāo)記ESC，酪氨酸激酶受體C-kit及SSEA-1標(biāo)記PGC，精原干細(xì)胞重要表面標(biāo)志 integrin α6及integrinβ1雙重標(biāo)記SSC。

1.2.2 RNA-Seq 參照Illumina公司mRNA-Seq步驟進(jìn)行 RNA建庫，在上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司公司使用Illumina公司HisSeq2000進(jìn)行測序，上樣量為50ng。測序結(jié)果同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。RNA標(biāo)準(zhǔn)為RIN≥7，28S/18S＞0.7。

1.2.3 QRT-PCR檢測 利用RNeasy kit試劑盒提取細(xì)胞總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以此為模版進(jìn)行RT-qPCR。按照熒光定量PCR試劑盒說明，使用SYBR熒光試劑和7900 System熒光定量儀器進(jìn)行Real-time PCR試驗(yàn)，最后在Microsoft Excel軟件內(nèi)用2-ΔΔCt相對定量法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。引物具體信息見表1。 Table 1 Primers of related genes in RT-qPCR

表1 RT-QPCR相關(guān)基因的引物

1.2.4 NOS2體內(nèi)、外抑制試驗(yàn)

1.2.4.1 NOS2體內(nèi)抑制試驗(yàn) 取剛受精的雞胚，注射方法參考文獻(xiàn)[15]，分組情況為：①空白組：不經(jīng)任何處理，直接孵化；②對照組：中端注射100 μL ddH2O；③ 抑制組：中端注射100 μL 1μmol·L-1的NOS2抑制劑。分別取各組第0天的雞胚、第5.5天的生殖脊、第18天的睪丸組織，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR檢測NOS2、C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrinα6和integrin β1等基因的mRNA表達(dá)情況。

1.2.4.2 NOS2體外抑制試驗(yàn) 取培養(yǎng)至 2代雞ESCs，分組情況為：①對照組：添加普通培養(yǎng)基；②RA誘導(dǎo)組：采用RA誘導(dǎo)；③抑制劑組：對照組的基礎(chǔ)上添加1μmol·L-1的：④RA+抑制劑組：在RA誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上添加工作液濃度1μmol·L-1的抑制劑。觀察各組第2、4、6、8和10天的細(xì)胞的形態(tài)變化，并分別取各組第2、4、6、8和10天的細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR檢測NOS2、C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等基因的mRNA表達(dá)情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（X± SEM）表示，應(yīng)用GraphPad Prism5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用兩樣本均數(shù)間t檢驗(yàn)的方法，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 RNA-Seq分析

在ESC vs PGC和PGC vs SSC兩組中分別存在7 967和6 496個(gè)差異基因，通過VENNY（http:// bioinfogp. cnb.csic.es/tools/venny/）分析發(fā)現(xiàn)，有3 580個(gè)差異基因同參與了雄性生殖細(xì)胞分化的整個(gè)過程，并通過DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行GO功能注釋分類，發(fā)現(xiàn)有697個(gè)差異基因參與到生物代謝過程。

針對這697個(gè)差異基因，再通過KEGG富集通路分析發(fā)現(xiàn)，參與雄性生殖細(xì)胞整個(gè)分化過程的代謝差異基因主要富集于精氨酸-脯氨酸代謝通路、酪氨酸代謝通路和色氨酸代謝通路。3條代謝通路中，在雄性生殖細(xì)胞分化的全過程中均差異顯著的基因分別有 5個(gè)（LOC777369、LOC776984、P4Hα3、P5CSL和NOS2）、2個(gè)（HGD和FAH）和1個(gè)（IDO）（表2）。

表2 雄性生殖細(xì)胞分化過程相關(guān)調(diào)控差異基因Table 2 Related regulatory genes in differentiation process of male germ cells

2.2 RT-qPCR驗(yàn)證通路基因

針對部分關(guān)鍵基因進(jìn)行 RT-qPCR驗(yàn)證，以其在ESC中表達(dá)量為對照，檢測出其在PGC和SSC中的相對表達(dá)量（圖1）。

根據(jù)RT-qPCR結(jié)果顯示，在ESC分化為SSC的整個(gè)階段中，LOC776984、P4Hα3、P5CSL、HGD、FAH和IDO均先上調(diào)后下調(diào)，LOC777369和NOS2為先下調(diào)后上調(diào)。這些基因表達(dá)趨勢與其在RNA-Seq中的表達(dá)趨勢基本一致。

圖1 相關(guān)差異基因相對表達(dá)量Fig. 1 Relative expression of related differentiation genes

2.3 NOS2體內(nèi)、外抑制

2.3.1 NOS2體內(nèi)抑制 體內(nèi)抑制后，針對NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因進(jìn)行RT-qPCR檢測，以其在第0天雞胚的表達(dá)量為對照，檢測其第5.5天生殖脊、第18天睪丸組織的mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，NOS2及C-kit、 Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因在空白組和對照組之間無顯著性的差異，而在抑制劑組中，NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)了不同程度的降低，說明NOS2在被抑制后，ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化過程也受到了抑制（圖2）。

圖2 體內(nèi)抑制中NOS2及相關(guān)生殖標(biāo)記基因相對表達(dá)變化Fig. 2 Relative expression of NOS2 and related reproductive marker genes in inhibitory experitment in vivo

2.3.2 NOS2體外抑制 取傳至2代的ESCs進(jìn)行不同分組處理，每隔2 d進(jìn)行觀察細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，對照組中，ESCs在2、4、6、8和10 d內(nèi)細(xì)胞不斷增殖，但是未出現(xiàn)類胚體；RA誘導(dǎo)組中，2 d出現(xiàn)小的類胚體，4 d類胚體增大，且數(shù)量增多，6 d類胚體邊緣開始出現(xiàn)破裂，8 d類胚體解體，10 d出現(xiàn)類精原樣細(xì)胞；抑制劑組中，ESCs在2、4、6、8和10d內(nèi)無類胚體出現(xiàn)，且相較于對照組細(xì)胞增殖緩慢；RA+抑制劑組中，2和4 d內(nèi)無類胚體出現(xiàn)，細(xì)胞增殖緩慢，6d出現(xiàn)小的類胚體，8d類胚體數(shù)量少量增多，且體積稍顯增大，10d類胚體開始裂解。說明NOS2在被抑制后，ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化過程受到阻礙（圖3）。

圖3 不同處理組不同天數(shù)的ESCs形態(tài)變化Fig. 3 Morphological observation of chicken ESCs on different days among different groups (400×)

每隔2 d分別取以上不同分組的細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，對NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因進(jìn)行RT-qPCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過抑制劑的抑制后，NOS2及C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因的表達(dá)量在 RA誘導(dǎo)組、抑制劑組和 RA+抑制劑組中相對于對照組均呈顯著性或極顯著性的下調(diào)趨勢，這說明 NOS2在受到抑制劑抑制后，ESCs向雄性生殖細(xì)胞的分化受到抑制（圖4）。

3 討論

圖4 體外抑制中NOS2及相關(guān)生殖標(biāo)記基因相對表達(dá)變化Fig. 4 Relative expression of NOS2 and related reproductive marker genes in inhibitory experitment in vitro

雞雄性生殖細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育與其各類代謝過程密切相關(guān)，目前已有報(bào)道稱 BMP4/Smad蛋白通路[16-17]、RA代謝[18]等通路對雄性生殖細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡具有重要的作用。在這些代謝過程中，蛋白質(zhì)是生物細(xì)胞賴以生存的各種代謝和調(diào)控途徑的主要執(zhí)行者，因此蛋白質(zhì)的代謝對于雄性生殖細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育至關(guān)重要。一氧化氮合成酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）與PGCs的發(fā)育和正常生殖細(xì)胞的分化密切相關(guān)。作為Nanos的同系物，NOS2是在秀麗隱桿線蟲（C. Elegans）中首次發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)與Nanos結(jié)構(gòu)類似，都包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域[19-20]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，NOS2能夠在生物體內(nèi)催化生成NO，低濃度的NO對生殖細(xì)胞的的功能具有保護(hù)作用，而高濃度的NO反而具有損壞效應(yīng)，這說明NOS2通過催化生成NO，在生殖細(xì)胞的各種活動中可能起重要的作用[21-24]。YUMIKO[25]等發(fā)現(xiàn)NOS2能夠啟動小鼠雄性生殖細(xì)胞的分化，而抑制雌性生殖細(xì)胞分化；該研究還發(fā)現(xiàn)NOS2表達(dá)于SSCs中，是精子形成時(shí)維持干細(xì)胞數(shù)量的一個(gè)內(nèi)因；BARRIOS等[26]發(fā)現(xiàn)敲除NOS2的雄性小鼠表現(xiàn)不育，原因是由于在胚胎期缺乏生殖細(xì)胞，說明NOS2具有維持生殖細(xì)胞數(shù)量的作用，然而RA可以下調(diào)NOS2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)有絲分裂；CHILDS[27]等發(fā)現(xiàn) Cyp26b1基因敲除，小鼠胚胎生殖細(xì)胞中Stra8的表達(dá)急劇上調(diào)，從而誘導(dǎo)雄性生殖細(xì)胞啟動減數(shù)分裂，這與TSUDA[28]等在NOS2基因敲除小鼠模型中發(fā)生的現(xiàn)象一致；NAKAMURA等[29]在以成年青鳉魚為動物模型，獲得NOS2-eGFP標(biāo)記的卵源干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)卵源干細(xì)胞能夠連續(xù)產(chǎn)生具備受精能力的干細(xì)胞，說明NOS2對生殖細(xì)胞的增殖、分化起到重要作用；K?PRUNNER等[30]以斑馬魚為試驗(yàn)對象，發(fā)現(xiàn)缺少NOS1和NOS2時(shí)導(dǎo)致PGCs無法維持其功能，并大量死亡；K?PRUNNER還發(fā)現(xiàn)NOS2在PGCs與性腺有效結(jié)合過程中也起到重要作用。這些都說明NOS2在生殖細(xì)胞自我增殖及其向SSCs分化中的重要作用。

本研究探索出在ESCs向SSCs分化的整個(gè)過程中，蛋白質(zhì)代謝的主要信號通路是精氨酸-脯氨酸代謝通路、酪氨酸代謝通路以及色氨酸代謝通路，其中有大量的研究表明精氨酸-脯氨酸代謝通路上的關(guān)鍵基因NOS2參與了生殖細(xì)胞的各種活動，在此理論基礎(chǔ)上，以NOS2特異性抑制劑分別在體內(nèi)和體外對NOS2進(jìn)行抑制，結(jié)果表明NOS2在被抑制后，引起C-kit、Cvh、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖標(biāo)記基因表達(dá)量的顯著下降，使得ESCs向SSCs方向的分化明顯受到抑制。然而，NOS2對ESCs向生殖方向分化的具體調(diào)節(jié)機(jī)制、以及精氨酸-脯氨酸代謝通路與其他的信號通路是否有互作等問題還需要進(jìn)一步的探究。

另外，亦有多項(xiàng)研究[31-34]表明，F(xiàn)AH和IDO等基因也參與細(xì)胞的增殖、分化及其發(fā)育，但尚未有其關(guān)于影響雄性生殖細(xì)胞生成、分化的報(bào)道，因此，關(guān)于這些基因的具體調(diào)節(jié)機(jī)理還需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

本研究基于前期探究出NOS2及其所在的精氨酸-脯氨酸代謝通路在雞雄性生殖細(xì)胞分化過程中起到重要調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)上，以抑制劑對NOS2進(jìn)行體內(nèi)、外的抑制，發(fā)現(xiàn)NOS2在被抑制后，ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化的過程受到抑制。說明了精氨酸-脯氨酸代謝通路及關(guān)鍵基因NOS2對ESCs向雄性生殖細(xì)胞分化過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

[1] 孫敏, 施青青, 李碧春. 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為雄性生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展. 生命科學(xué)，2012, 24(1):37-42.

SUN M, SHI Q Q, LI B C. Research progress on differentiation of embryonic stem cells into male germ cells. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2012, 24(1): 37-42. (in Chinese)

[2] 韓明權(quán), 劉嘉湘, 高虹, 陳善香, 朱晏偉, 許玲. 益肺抗瘤飲對實(shí)驗(yàn)性肺癌細(xì)胞周期及核酸和蛋白質(zhì)合成的影響. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2003, 1(3):205-208.

HAN M Q, LIU J X, GAO H, CHEN S X, ZHU Y W, XU L. Effects of Yifei Kangliu Qral Liquid on cell cycle and protein-nucleic acid synthesis of experimental lung cancer. Journal China of Integrative Medicine, 2003, 1(3):205-208. (in Chinese)

[3] FEI T, XIA K, LI Z W, ZHOU B, ZHU S S, CHEN H, ZHANG J P, CHEN Z, XIAO H S, HAN J D J, CHEN Y G. Genome-wide mapping of SMAD target genes reveals the role of BMP signaling in embryonic stemcell fate determination. Genome Research, 2010, 20( 1) : 36-44.

[4] CHEN W, JIA W W, WANG K, ZHOU Q, LENG Y, DUAN T, KANG J H. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 418(3): 571-577.

[5] NISHIMURA Y, KURISAKI A, NAKANISHI M, OHNUMA K, NINOMIYA N, KOMAZAKI S, ISHIURA S, ASASHIMA M. Inhibitory Smad proteins promote the differentiation of mouse embryonic stem cells into ependymal-like ciliated cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010, 401(1): 1-6.

[6] HELLINGMAN C A, DAVIDSON E N, KOEVOET W, VITTERS E L, VAN DEN BERG W B, VAN OSCH G J V M, VAN DER KRAAN P M. Smad signaling determines chondrogenic differentiation of bonemarrow-derived mesenchymal stem cells: inhibition of Smad1/5/8Pprevents terminal differentiation and calcification. Tissue Engineering: Part A, 2011, 17(7-8): 1157-1167.

[7] TAN B, YIN Y L, KONG X F, LI P, LI X L, GAO H J, LI X G, HUANG R L, WU G Y. L-Arginine stimulates proliferation and prevents endotoxin-induced death of intestinal cells. Amino Acids, 2009, 38(4): 1227-1235.

[8] SULTAN M, SCHULZ M H, RICHARD H, MAGEN A, KLINGENHOFF A, SCHERF M, SEIFERT M, BORODINA T, SOLDATOV A, PARKHOMCHUK D, SCHMIDT D, O'KEEFFE S, HAAS S, VINGRON M, LEHRACH H, YASPO M L. A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome. Science, 2008, 321(5891): 956-960.

[9] TANG F C, BARBACIORU C, BAO S Q, LEE C, NORDMAN E, WANG X H, LAO K Q, SURANI M A. Tracing the derivation of embryonic stem cells from the inner cell mass by single-cell RNA-Seq analysis. Cell Stem Cell, 2010, 5(6): 397-398.

[10] TRAPNELL C, WILLIAMS B A, PERTEA G, MORTAZAVI A, KWAN G, VAN BAREN M J, SAIZBERG S L,WOLD B J, PACHTER L. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology, 2010, 28: 511-515.

[11] TANG F C, BARBACIORU C, NORDMAN E, LI B, XU N L, BASHKIROV V I, LAO K Q, SURANI M A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols, 2010, 5: 516-535.

[12] HAMBURGER V, HAMILTON H L. A series of normal stages in the development of the chicken. Morphology, 1951, 88(1): 49-92.

[13] 李碧春, 陳國宏, 趙東偉, 王克華, 錢菊芬. 雞胚 PGCs遷移與性腺發(fā)育關(guān)系的研究. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23(1): 18-26.

LI B C, CHEN G H, ZHAO D W, WANG K H, QIAN J F. Relationship between PGCs migration and gonad development in the earlu chicken embryo. Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition), 2002, 23(1): 18-26. (in Chinese)

[14] 孫敏, 施青青, 傅德智, 陰彥輝, 張亞妮, 李碧春. 雞胚 ESCs 和

SSCs 特定基因表達(dá)差異的研究. 生物技術(shù), 2011, 21(3): 16-19. SUN M, SHI Q Q, FU D Z, YIN Y H, ZHANG Y N, LI B C. Study of the expression of gene cell differentiation associated gene on chicken ESC and SSCs. Biotechnology, 2011, 21(3): 16-19. (in Chinese)

[15] 汪怡臨, 靳鍇, 蔣舒穎, 趙瑞豐, 左其生, 李東, 王穎潔, 張蕾, 張亞妮, 李碧春. 不同注射部位和劑量對雞胚發(fā)育的影響. 中國家禽, 2014, 36(17): 7-10.

WANG Y L, JIN K, JIANG S Y, ZHAO R F, ZUO Q S, LI D, WANG Y J, ZHANG L, ZHANG Y N, LI B C. Effects of different injection location and dose on chicken embryos. China Poultry, 2014, 36(17): 7-10. (in Chinese)

[16] 陳兵, 易斌, 魯開智. Smad 蛋白家族調(diào)控細(xì)胞分化的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào), 2013, 26 (5): 544-547.

CHEN B, YI B, LU K Z. Advances in researches on Smad proteins in cell differentiation. Journal of Medical Postgraduates, 2013, 26 (5): 544-547. (in Chinese)

[17] ANDREA V C, DIANA J L. Wnt and Bmp fit germ cells to a T. Developmental Cell. 2013, 27(5): 485-487.

[18] SUGIMOTO R, NABESHIMAB Y, YOSHIDA S. Retinoic acid metabolism links the periodical differentiation of germ cells with the cycle of Sertoli cells in mouse seminiferous epithelium. Mechanisms of Development, 2012, 128(11-12): 610-624.

[19] SUBRAMANIAM K, SEYDOUX G. nos-1 and nos-2, two genes related to Drosophilananos, regulate primordial germ cell development and survival in Caenorhabditis elegans. Development, 1999, 126: 4861-4871.

[20] GALLO C M, WANG J T, MOTEGI F, SEYDOUX G. Cytoplasmic partitioning of P granule components is not required to specify the germline in C. elegans. Science, 2010, 330(6011): 1685-1689.

[21] ZINI A, DE LAMIRANDE E. Low levels of nitric oxide promote human sperm capacitation in vitro. Journal of Andrology, 1995, 16 (5): 424-431.

[22] ZINI A, O’BRYAN M K, SCHLEGEL P N. Nitric oxide synthase activity in human seminal plasma. Urology, 2001, 58 (1) :85-89.

[23] HERRERO M B, DE LAMIRANDE E, GAGNON C. Nitric oxide regulates human sperm capacitation and protein-tyrosine phosphorylation in vitro. Biology of Reproduction, 1999, 61(3): 575-581.

[24] MITROPOULOS D, DELICONSTANTINOS G. Nitric oxide synthase and xanthine oxidase activities in the spermatic vein of patients with varicocele: apotential role for nitric oxide and peroxynitrite in sperm dysfunction. The Journal of Urology, 1996, 156(6): 1952-1958.

[25] YUMIKO S. Function of Nanos2 in the male germ cell lineage in mice. Cellular and Molecular Life Sciences, 2010, 67(22): 3815-3822.

[26] BARRIOS F, FILIPPONI D, PELLEGRINI M, PARONETTO M P, SIEN S D, GEREMIA R, ROSSI P, DE FELICI M, JANNINI E A, DOLCI S. Opposing effects of retinoic acid and FGF9 on Nanos2 expression and meiotic entry of mouse germ cells. Journal of Cell Science, 2010, 123: 871-880.

[27] CHILDS A J, COWAN G, KINNELL H L, ANDERSON R A, SAUNDERS P T K. Retinoic acid signalling and the control of meiotic entry in the human fetal gonad. PLoS One, 2011, 6(6): e20249.

[28] TSUDA M, SASAOKA Y, KISO M, ABE K, HARAGUCHI S, KOBAYASHI S, SAGA Y. Conserved role of nanos proteins in germ cell development. Science, 2003, 301(5637): 1239-1241.

[29] NAKAMURA S, KOBAYASHI K, NISHIMURA T, HIGASHIJIMA S, TANAKA M. Identification of germline stem cells in the ovary of the teleost medaka. Science, 2010, 328: 1561-1563.

[30] K?PRUNNER M, THISSE C, THISSE B, RAZ E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes & Development, 2001, 15: 2877-2885.

[31] 劉秀紅, 李寧. 肝病與肝癌的新療法：干細(xì)胞研究的最新進(jìn)展. 北京醫(yī)學(xué), 2013, 35(9): 813-814.

LIU X H, LI N. New therapy of Liver disease and liver cancer: the latest progress in the study of stem cells. Beijing Medical Journal, 2013, 35(9): 813-814. (in Chinese)

[32] JANG Y Y, Collector M I, Baylin S B, Deihl A M, Sharkis S J. Hematopoietic stem cells convert into liver cells within days without fusion. Nature Cell Biology, 2004; 6: 532-539.

[33] TAKIKAWA O, KUROIWA T, YAMAZAKI F, KIDO R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry, 1988, 263(4): 2041-2048.

[34] Viola A, Bronte V. Metabolic mechanisms of cancer inducedinhibition of immune responses. Seminars in Cancer Biology, 2007, 17(4): 309-316.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Regulatory Study of Protein Metabolism During the Differentiation Process of Chicken Male Germ Cells

LI Dong, TANG Bei-bei, WANG Ying-jie, JI Yan-qin, WANG Fei, LU Zhen-yu, WANG Man, ZHANG Ya-ni, LI Bi-chun

(Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province, College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu)

【Objective】 The aim of this study was to explore the regulatory mechanism of protein metabolism during the differentiation process of chicken male germ cells and provide a basis for improving the induction system of chicken embryonic stem cells (ESCs) differentiation to male germ cells in vitro. 【Method】RNA sequencing was performed using FACS-sorted cells from ESCs, PGCs(primordial germ cells) and SSCs(spermatogonial stem cells), and enrichment analysis, WEGO (Web Gene ontology) and KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), were carried out to find out the relevant pathways and the key genes, the expression level of which was analyzed by qRT-PCR. Moreover, NOS2 both in vitro and in vivo with NOS2 inhibitor was inhibited, and the morphologic changes of ESCs were observed and the mRNA expressions of NOS2 and other germ genes, C-kit, Cvh, Stra8, Dazl, integrin α6 and integrin β1 were detected in different groups and in different days with RT-qPCR. 【Result】 Final results showed that 697 differentially expressed genes were involved in biological metabolism and significantly enriched in arginine-proline metabolic pathway, tyrosine metabolic pathway and tryptophan metabolic pathway and screened some key genes, like NOS2, FAH and IDO. It was found that the expression trends of NOS2, FAH and IDO were the same as that of RNA-Seq. In inhibitory experiment in vivo, the mRNA expression of NOS2, C-kit, Cvh, Stra8, Dazl, integrin α6 and integrin β1 between blank group and control group showed no significant difference. However, in inhibited group, NOS2, C-kit, Cvh, Stra8, Dazl, integrin α6 and integrin β1 expressions were down-regulated inordinately. Moreover, in inhibitory experiment in vitro, ESCs always proliferated on the 2, 4, 6, 8 and 10d, but disappeared the embryonic bodies in the control group. In induced group, small embryonic bodies appeared on the 2d and became bigger and increased on the 4d. Embryonic bodies started to burst in edges on the 6d, break up on the 8d and appeared spermatogonia-like cells. In inhibited group, no embryonic body appeared in the whole process and ESCs proliferated more slow than the control group. In induced-inhibited group, no embryonic body appeared on the 2d and 4d and ESCs proliferated slowly. Small embryonic bodies appeared on the 6d and the number and volume increased slightly on the 8d. On the 10d, the embryonic bodies started to break up. In vitro, NOS2, C-kit, Cvh, Stra8, Dazl, integrin α6 and integrin β1 expressions in induced group, inhibited group and induced-inhibited group were significantly down-regulated compared with the control group. 【Conclusion】In this study, based on the screening of arginine-proline metabolic pathway and NOS2 with RNA-Seq and Bioinformatics, it was found that the process of ESCs differentiation to male germ cell was inhibited after the inhibition of NOS2，which suggested that arginine-proline metabolic pathway and NOS2 has an important regulatory effect on differentiation of ESCs to male germ cells.

RNA-Seq; ESCs; PGCs; SSCs; male germ cells; NOS2; inhibitor; differentiation

2015-08-03；接受日期：2016-11-02

國家自然科學(xué)基金（31272429）、高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題（20103250110006）、江蘇省“六大人才高峰”、江蘇省優(yōu)勢學(xué)科

聯(lián)系方式：李東，E-mail：lidongyzu@hotmail.com。通信作者李碧春，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn。通信作者張亞妮，E-mail：ynzhang@yzu.edu.cn