趙洪慶 杜青 凌佳 楊琴 徐雅嵐 王宇紅

摘要：目的 研究糖尿病并發(fā)抑郁癥（DD）大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況，探討其可能的分子機制。方法 采用高脂灌胃聯(lián)合尾靜脈注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，隨機分為糖尿病模型組和DD模型組，另取正常大鼠隨機分為空白對照組和抑郁癥模型組，抑郁癥模型組和DD模型組繼續(xù)給予28 d慢性不可預見性應激。造模結(jié)束后，采用Open-field實驗和Morris水迷宮實驗評價大鼠行為活動能力，HE染色觀察大鼠海馬病理改變，Western blot檢測大鼠海馬p-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase8、Caspase3蛋白表達。結(jié)果 Open-field實驗結(jié)果顯示，各模型組大鼠自主活動能力顯著下降，其中DD模型組大鼠較糖尿病模型組明顯下降；Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，各模型組大鼠逃避潛伏期延長，其中DD模型組大鼠較糖尿病模型組明顯延長；HE染色結(jié)果顯示，DD模型組大鼠海馬損傷最為嚴重；Western blot結(jié)果顯示，各模型組大鼠較空白對照組p-JNK、Bax、Caspase8、Caspase3表達顯著升高，Bcl-2表達顯著降低，其中DD模型組差異更顯著。結(jié)論 基于糖尿病，DD引起海馬神經(jīng)元凋亡，其機制可能與細胞凋亡相關蛋白p-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase8、Caspase3等異常表達相關。

關鍵詞：糖尿??；抑郁癥；糖尿病并發(fā)抑郁癥；神經(jīng)元凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.014

中圖分類號：R228 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）12-0055-04

Study on Hippocampal Neuronal Apoptosis and Its Potential Mechanisms in Diabetic Rats with Depression ZHAO Hong-qing， DU Qing， LING Jia， YANG Qin， XU Ya-lan， WANG Yu-hong （Hunan University of Chinese Medicine， Training Bases， Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To study hippocampal neuronal apoptosis in rats with diabetes mellitus and depression （DD）； To explore its potential molecular mechanisms. Methods High-fat fed combined with intravenous injection of STZ was used to establish the models of diabetic rats， and then the models were divided into diabetes group and DD group after modeling successfully. Normal rats were randomly divided into control group and depression group. Chronic unforeseeable stress was continuously given to depression group and DD group. Open-field test and Morris water maze were used to evaluate the behavior activity of rats in each group； HE staining was used to detect pathological changes in hippocampus of rats； Western blot was used to disclose the protein expression of p-JNK， Bax， Bcl-2， Caspase8， and Caspase3. Results Open-field test results showed that the independent activity of rats decreased significantly in each model group， which decreased significantly in the DD group； Morris water maze results showed longer escape latency in model rats， which increased obviously in DD group； HE staining results suggested that the damage of hippocampus was the most severe in DD rats. Western blot results showed that compared with normal group， the expressions of apoptosis protein of p-JNK， Bax， Caspase8， and Caspase3 in each model group increased significantly and Bcl-2 expression decreased significantly， among which the difference in the DD group was the most obvious. Conclusion Hippocampal neuronal apoptosis caused by DD is based on diabetes， which mechanism may be related to abnormal expressions of p-JNK， Bax， Bcl-2， Caspase8， and Caspase3.

Key words： diabetes mellitus； depression； diabetes mellitus with depression； neuronal apoptosis

基金項目：國家自然科學基金（81373578、81403379、81573965）

通訊作者：王宇紅，E-mail：wyh107@126.com

糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD）繼發(fā)于糖尿病，具有危害大、自殺率高的特點。海馬是與學習記憶密切相關的大腦組織，同時也是大腦中一個容易受到攻擊的部位，其是腦內(nèi)受糖尿病影響的首個組織，而且是抑郁癥發(fā)生的首要部位。本課題組前期研究表明，糖尿病并發(fā)抑郁癥的病變部位主要集中在大腦海馬區(qū)，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元萎縮、凋亡、可塑性降低[1]。國內(nèi)外研究表明，糖尿病與抑郁癥均能引起不同程度的海馬損傷，并且都與JNK信號通路的異常活化，導致凋亡相關蛋白的異常表達相關[2-3]。本實驗通過HE染色觀察海馬神經(jīng)元凋亡情況，Western blot檢測海馬p-JNK、Bcl-2、Bax、Caspase8、Caspase3蛋白表達，以糖尿病、抑郁癥模型為對照，比較分析DD所致海馬神經(jīng)元凋亡的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物

7～8周齡SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于室溫（25±1）℃、相對濕度（50±5）%環(huán)境。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗體，美國Santa公司；兔抗鼠p-JNK、Caspase3、Caspase8多克隆抗體，英國abcam公司；HRP標記的羊抗兔IgG二抗，武漢博士德公司；RIPA組織細胞快速裂解液，上?；鶢栴D生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，美國Thermo公司。One Touch Ⅱ血糖儀及血糖試紙（美國強生公司），動物行為學習記憶系統(tǒng)（Viewpoint），5417R冷凍離心機（Eppendorf），GS-6R離心機（Beckman），MK3型酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀公司），Mini Protean 3 cell電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 實驗方法

2.1 分組

50只大鼠隨機分為2部分：其中20只作為空白對照組和抑郁模型組，每組10只；另外30只用于糖尿病造模。制備方法：14 d高脂飼料（20%豬油、20%吐溫80、20%丙二醇、10%膽固醇、2%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶）飼養(yǎng)聯(lián)合尾靜脈注射STZ 38 mg/kg，造模3 d后，大鼠禁食不禁水6 h，測定空腹血糖。去除造模過程中死亡大鼠，選取空腹血糖≥16.00 mmol/L大鼠為成模大鼠，并依據(jù)血糖值隨機分為糖尿病模型組12只和DD模型組13只。

2.2 造模及取材

空白對照組大鼠正常飼養(yǎng)，抑郁模型組大鼠采用慢性不可預見性應激的方法造模，慢性應激包括4 ℃冰水浴、45 ℃熱刺激、電擊、傾籠、噪音、潮濕墊料、晝夜顛倒、夾尾，每日采用1種刺激，同種刺激不連續(xù)使用，共28 d，期間大鼠均孤籠飼養(yǎng)。糖尿病模型組給予正常飲水飲食，DD模型組繼續(xù)給予28 d慢性不可預見性應激，方法同抑郁癥模型組。應激第24日開始對大鼠進行Morris水迷宮訓練，每日1次，連續(xù)4 d，于第28日先對各組大鼠進行Open-field測試，測試結(jié)束進行水迷宮實驗，記錄各組大鼠逃避潛伏期時間，用以評價大鼠抑郁情況。行為學測試結(jié)束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，部分大鼠取腦組織保存于10%甲醛溶液中用于HE染色，剩余大鼠取海馬組織于液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 行為學檢測

2.3.1 Open-field實驗 測試所用敞箱為80 cm×80 cm×40 cm，底面平均劃分為25個小方格。實驗前1 h將待測大鼠放入測試房間，測試期間關閉房間燈光，將大鼠從敞箱中央放入，觀察并記錄大鼠4 min內(nèi)水平運動格數(shù)和垂直豎立次數(shù)。

2.3.2 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮被均分為4個象限，平臺置于西南象限水面下2 cm。造模24 d開始對所有大鼠進行水迷宮訓練，訓練時將大鼠從平臺另側(cè)面向池壁放入，2 min內(nèi)找到平臺則訓練結(jié)束，未找到平臺則將其引導至平臺，停留數(shù)秒。連續(xù)訓練4 d，于第5日進行水迷宮測試，記錄大鼠逃避潛伏期。

2.4 HE染色

取固定于4%甲醛溶液腦組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟水洗，洗后蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗至干凈，經(jīng)鹽酸乙醇分化和自來水浸泡后置伊紅液中2 min，100%乙醇脫水，二甲苯透明，加拿大樹膠封固。

2.5 Western blot檢測

取冷凍保存的海馬組織，每1 mg組織加入RIPA裂解液5 μL，冰上勻漿，離心制備組織蛋白提取液，BCA法測定其蛋白含量。根據(jù)目的蛋白分子量選擇配制不同濃度的分離膠，上樣，電泳，至溴酚蘭抵達凝膠底時，停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，37 ℃、5%脫脂牛奶封閉1 h后，裁剪目的蛋白所在的條帶。將目的條帶分別置于原位雜交袋中，加入相應的一抗（按說明書稀釋），4 ℃過夜。TBST洗膜，然后加入稀釋過的二抗（1∶1000），室溫孵育1～2 h。TBST洗膜，ECL法進行顯色。應用Image J圖像處理軟件對條帶進行掃描，測量灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 Open-field實驗結(jié)果

與空白對照組比較，各模型組大鼠自主活動數(shù)均明顯減少（P<0.01）；與糖尿病模型組比較，DD模型組大鼠自主活動數(shù)明顯減少（P<0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 Morris水迷宮實驗結(jié)果

與空白對照組比較，各模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.01）；與糖尿病模型組比較，DD模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 病理觀察結(jié)果

空白對照組大鼠海馬錐體細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，細胞間隙正常；各模型組大鼠均可見海馬椎體細胞排列紊亂，細胞間隙增大，胞體深染并呈一定空泡性損傷，其中以DD模型組大鼠海馬損傷最為顯著。結(jié)果見圖1。

4.4 Western blot檢測結(jié)果

5 討論

研究表明，糖尿病大鼠伴有學習記憶功能受損，其與海馬神經(jīng)元損傷有關，抑郁模型大鼠存在明顯的海馬萎縮，神經(jīng)元凋亡顯著，神經(jīng)營養(yǎng)低下等特點[4-5]。本課題組前期研究顯示，DD大鼠海馬神經(jīng)元存在萎縮、凋亡、胞體腫脹等病理改變[1]，而DD是基于糖尿病產(chǎn)生的并發(fā)癥，其對海馬神經(jīng)元的損傷與糖尿病、抑郁癥可能存在相似且有差異的情況。

Open-field實驗是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用行為學方法。實驗結(jié)果表明，抑郁癥大鼠與DD大鼠的自主活動和探索功能受到比糖尿病大鼠更為嚴重的損害。Morris水迷宮主要用于考察實驗動物的空間學習記憶能力，廣泛應用于與大腦海馬組織病變相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。結(jié)果表明，與空白對照組比較，各模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，其中DD狀態(tài)下大鼠空間學習記憶功能損害最為嚴重。Open-field實驗和Morris水迷宮實驗結(jié)果表明，DD大鼠行為學損害比糖尿病大鼠嚴重，而相比于抑郁大鼠則無明顯的改變，說明DD是基于糖尿病對海馬損傷的進一步加重，最終發(fā)展成抑郁狀態(tài)。此外，各組大鼠海馬病理觀察結(jié)果顯示，抑郁大鼠海馬損傷比糖尿病大鼠嚴重，而DD大鼠海馬損傷則比這2種模型大鼠均嚴重。

JNK激活在多種疾病介導的神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用。p-JNK可直接調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性，從而介導線粒體途徑的細胞凋亡[6]。Bcl-2家族是目前公認與凋亡密切相關的基因，主要包括凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進基因Bax等?？沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax之間的比例能決定細胞是否發(fā)生凋亡[7]。Bax、Bcl-2蛋白能在線粒體完整性的基礎上通過激活Caspase來調(diào)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生[8]。其中，Caspase8起始于Caspase，在細胞凋亡過程中扮演著重要角色，Caspase3則是細胞凋亡過程中最關鍵的執(zhí)行者之一。Western blot結(jié)果表明，p-JNK、Bax、Caspase8、Caspase3蛋白在各模型組中表達均顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2顯著下降，表明糖尿病和抑郁癥均能通過激活JNK調(diào)節(jié)各凋亡蛋白表達介導海馬神經(jīng)元凋亡。實驗結(jié)果顯示，DD模型組Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達較糖尿病模型組有顯著變化，說明在糖尿病導致海馬損傷的基礎上，通過調(diào)控上述蛋白的表達進一步使海馬損傷，進而并發(fā)抑郁癥。與抑郁癥模型組比較，除Bcl-2蛋白外，其他蛋白表達均無顯著差異，說明抑郁大鼠海馬神經(jīng)元凋亡十分顯著，與文獻報道相符[9-10]。本實驗結(jié)果表明，在糖尿病的基礎上，DD引起的海馬神經(jīng)元凋亡機制可能與凋亡相關蛋白p-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase8、Caspase3等異常表達有關。

綜上所述，DD大鼠在行為學、海馬病理以及凋亡蛋白表達各項指標上與正常大鼠和糖尿病大鼠均有顯著差異。本研究表明，DD對海馬的損傷是在糖尿病基礎上進一步加重的，其與抑郁癥造成的海馬神經(jīng)元凋亡無異，這也符合DD的臨床發(fā)病規(guī)律。

參考文獻：

[1] 王宇紅，譚小雯，柴上，等.左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬谷氨酸及N-甲基-D-天冬氨酸受體2A、2B的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2015，22（10）：70-73.

[2] GU Z， JIANG Q， ZHANG G. C-Jun N-terminal kinase activation in hippocampal CA1 region was involved in ischemic injury[J]. Neuroreport，2001，12（5）：897-900.

[3] GASEML R， ZARIFKAR A， RASTERGAR K， et al. Insulin protects against Aβ-induced spatial memory impairment， hippocampal apoptosis and MAPKs signaling disruption[J]. Neuropharmacology， 2014，85（10）：113-120.

[4] LIU Y， TIAN X， GOU L S， et al. Luteolin attenuates diabetes- associated cognitive decline in rats[J]. Brain Research Bulletin， 2013，94：23-29.

[5] HUANG X， MAO Y S， LI C， et al. Venlafaxine inhibits apoptosis of hippocampal neurons by up-regulating brain-derived neurotrophic factor in a rat depression model[J]. International Journal of Clinical and Experimental Pathology，2014，7（8）：4577- 4586.

[6] 項文娟，張英杰，朱明偉.JNK介導的細胞凋亡在發(fā)育與疾病中的作用[J].細胞生物學雜志，2009，31（1）：21-27.

[7] HUI H， DOTTA F， MARIO U D， et al. Role of caspases in the reglulation of apototic pancreatic islet beta-cells death[J]. J Cell Physiol，2004，200：177-200.

[8] 張勤麗，牛僑.細胞凋亡機制概述[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學，2007，24（2）：102-107.

[9] WANG Y M， ZHANG H M， CHAI F X， et al. The effects of escitalopram on myocardial apoptosis and the expression of Bax and Bcl-2 during myocardial ischemia/reperfusion in a model of rats with depression[J]. BMC Psychiatry，2014，14：349.

[10] Miguel-Hidalgoa J J， Whittoma A， Villarreal A， et al. Apoptosis-related proteins and proliferation markers in the orbitofrontal cortex in major depressive disorder[J]. Journal of Affective Disorders，2014，158（10）：62-70.

（收稿日期：2016-02-26）

（修回日期：2016-03-19；編輯：華強）