杜漸　綜述　譚廣　審校

（大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，遼寧 大連 116000）

膽管細胞癌（cholangiocarcinoma，CCA）是指起源于膽道系統(tǒng)的一類惡性腫瘤，可發(fā)生于從Hering管至膽總管之間的任何部位，根據(jù)解剖部位分為肝內（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）、肝門（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）、肝外（distal cholangiocarcinoma，dCCA）3型。盡管三者有諸多相似之處，但在發(fā)病機理及預后上仍有很大差異[1]。iCCA是肝臟內第二常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占所有消化道腫瘤的3%，其流行病學具有地域性差異，世界范圍內總體發(fā)病率較低（＜6/10萬），但在我國則普遍高于此水平，如上海為7.55/10萬。近10年來，iCCA的發(fā)病率逐年遞增，而pCCA和dCCA則有所下降[2]。CCA發(fā)病隱匿，早期無任何癥狀，確診時往往已屬晚期，目前的診斷方法主要包括血清非特異性腫瘤標志物、組織活檢以及影像學檢查等。由于CCA確診較晚，致使手術治療效果不佳，其對傳統(tǒng)化療亦不敏感，復發(fā)率較高[3]。若能更好地明確CCA的分子病理學機制，則對腫瘤的早期診斷、個體化治療及改善預后都至關重要。故而本文從基因異質性、表觀遺傳學、內分泌因子、信號傳導通路等以下幾個方面對CCA的分子病理學研究進展進行簡要綜述。

1　基因異質性

CCA的異質性不僅與腫瘤的解剖部位相關，同時也取決于不同的危險因素及分子病理學上的差異?，F(xiàn)已明確的對CCA發(fā)生起關鍵作用的基因突變有DNA修復，如tumor protein 53（TP53）[4]；W n t信號通路[5]；絡氨酸激酶信號通路，如κ-ras、B-raf、Smad4、成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）[6]、蛋白絡氨酸磷酸激酶[7]；表觀遺傳學改變，如異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、IDH2[8]；染色質重塑，如mixed-lineage leukemia protein 3（MLL3）[9]；SWI/SNF復合體，如protein polybromo-1（PBRM1）；以及Notch信號通路等[10]。多因素分析表明，TP53和κ-ras突變可作為影響CCA預后的獨立危險因素[11]；PBRM1突變則與dCCA骨轉移及不良預后相關[12]；而MLL3基因可激活G蛋白相關信號通路，與血吸蟲引起的CCA密切相關。最近研究[13]顯示CCA的端粒酶反轉錄酶基因發(fā)生改變，提示其與慢性肝炎相關。上述基因突變及信號通路為CCA的個體化治療提供了潛在治療靶點。

CCA的全基因組測序揭示了其更多的生物學特性。就iCCA而言，兩類獨特的基因類型已被闡明：一類為炎癥型，如IL-3、4、6、10等，主要活化炎癥通路；另一類為增殖型，如κ-ras、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等，主要活化原癌基因，與患者不良預后密切相關[14]。目前，新一代測序技術對CCA內的56個腫瘤相關基因進行了檢測，盡管CCA因解剖部位不同而基因各異，但普遍存在Ras等驅動基因的突變[11]；而Arai等[15]亦通過對CCA外顯子測序，發(fā)現(xiàn)了一個無Ras突變的獨特亞型。CCA的上述眾多亞型也許能夠解釋其生物學、危險因素及預后的多樣性，但如何實現(xiàn)臨床轉化仍需更深入的研究。

2　FGFR2基因融合

CCA細胞內已發(fā)現(xiàn)許多激酶受體FGFR2與其他基因的融合產物，而在肝癌中則無表達，可作為潛在的特異性診斷標志物。FGFR2融合基因產物包括FGFR2-BICC1、FGFR2-KIAA1598、FGFR2-TACC3、FGFR2-AHCYL1、FGFR2-MGEA5、FGFR2-KCTD1和FGFR2-TXLNA[16]。FGFR2-BICC1等選擇性融合基因能夠活化FGFR激酶，進而改變腫瘤細胞形態(tài)，促進其增殖。PD173074與BGJ398或帕唑帕尼等FGFR激酶抑制劑能夠有效抑制FGFR2融合蛋白的致癌能力，表明FGFR激酶可作為CCA的潛在治療靶點。有研究[6]證實，F(xiàn)GFR2-MGEA5與FGFR2-TACC3陽性的CCA患者使用普納替尼或帕唑帕尼可顯著獲益。最近，Sia等[17]使用RNA與外顯子聯(lián)合測序發(fā)現(xiàn)了一個嶄新的融合基因產物FGFR2-PPHLN1，同時證明該融合產物有可能成為CCA最有效的治療靶點。

3　表觀遺傳學

表觀遺傳學的調控方式主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化以及非編碼RNA，以表觀遺傳學為基礎的抗CCA研究仍十分有限[18-20]。在CCA的表觀遺傳學圖譜中，IDH1與IDH2基因頻繁發(fā)生突變[21]。研究[22-23]表明，IDH突變與CpG的高甲基化相關，提示轉錄過程存在異常，進而影響細胞分化過程。并且IDH突變能夠引起肝細胞核因子4α失調，從而抑制肝細胞分化，促進膽管癌的形成。

與正常組織相比，CCA組織內DNA羥甲基化顯著減少，而Wnt通路的基因啟動子則高甲基化[24]。大量研究已經證實，表觀遺傳學的改變發(fā)生于腫瘤生成早期，且與腫瘤進展及微環(huán)境密切相關，這為CCA的早期診斷提供了新的思路。Gradilone等[25]發(fā)現(xiàn)CCA中組蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase，HDAC6）過表達，使細胞初生纖毛減少，促使其過度增殖；而HDAC6靶向抑制劑能夠修復初生纖毛，進而抑制CCA細胞的生長，提示HDAC6靶向抑制劑可作為CCA的潛在治療手段之一。

4　內分泌因子

研究[26]表明，CCA為雌激素敏感型腫瘤，雌激素受體（estrogen receptors，ER）α、β均陽性表達。ER-α活化能夠刺激CCA細胞增殖，但選擇性活化ER-β卻可以通過誘導凋亡達到抗腫瘤的效果。通常雌激素敏感型腫瘤在發(fā)展過程中ER-β逐漸丟失，但CCA在進展期ER-β仍持續(xù)表達，提示其可作為潛在的臨床治療靶點。研究證實應用ER拮抗劑他莫西芬或ER-β選擇性激動劑KB9520能夠抑制CCA增殖；并且雌激素亦能夠刺激IL-6和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，兩者對CCA的生物學功能均起到至關重要的調控作用[27]。

除雌激素外，某些內分泌因子也能夠調節(jié)CCA細胞的生物學功能。如血管收縮素、多巴胺、瘦素、阿片肽等能夠促進CCA細胞增殖。血管收縮素或內源性內啡肽能夠抑制膽管上皮細胞損傷后的過度增殖，但在CCA發(fā)展過程中這一功能逐漸喪失，轉而刺激腫瘤細胞的生長和存活[28]。

神經內分泌因子如促胰液素、胃泌素、γ-氨基丁酸、內皮素-1等能夠通過抑制CCA細胞增殖或促使其凋亡達到抗腫瘤的效果。雖然激活組胺H3、H4受體能夠抑制CCA細胞增殖，但組胺本身被認為可通過自分泌促進腫瘤細胞的增殖和存活，而組胺的這一作用是通過組胺H1介導的[29]。

5　生長因子

免疫組化結果顯示EGFR在CCA標本中過表達。EGFR通過激活膽管細胞內MAPK-ERK信號通路誘導腫瘤的發(fā)生，使得該受體成為CCA的潛在治療靶點。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CCA中EGFR基因的突變和擴增率分別達到15%和5%[30]。

研究表明，肝細胞生長因子受體（hepatic growth factor receptor，HGFR/c-Met）在CCA中過表達，且與iCCA的不良預后相關。而HGF和EGF信號通路的活化與CCA的轉移潛能亦密切相關。同時EGFR活化會促進CCA上皮細胞間充質的轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），導致腫瘤侵襲和低分化[31]，HGF能夠通過激活AKT和ERK信號通路增強腫瘤細胞的侵襲能力。

6　膽汁酸

眾所周知，膽汁淤積是CCA的危險因素之一，膽汁酸能夠通過轉錄生長因子α依賴的途徑激活EGFR，進而刺激膽管細胞增殖。體內實驗發(fā)現(xiàn)結合膽汁酸通過下調膽汁酸受體以及活化鞘氨醇-1磷酸受體2促進CCA的生長[32-33]。Lozano等[34]研究發(fā)現(xiàn)淤積的膽汁酸通過誘導膽管細胞的增殖和炎癥反應致癌，而非直接誘導基因突變。

7　腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）

CAFs可能起源于肝臟內活化的星形細胞或導管周圍的纖維母細胞。CAFs內α-平滑肌肌動蛋白表達陽性，能夠促使CCA細胞增殖、遷移、侵襲及EMT，因此CCA組織中α-平滑肌肌動蛋白高表達的患者預后不良[35]。目前已證實與CAFs相關的主要信號軸包括PDGF/PDGFR、SDF-1/CXCR4、HB/EGF/EGFR、CXCL5/CXCR2/IL-1β[36]。研究[37]表明，將肝臟星形細胞轉化為肌成纖維細胞能夠增強其凋亡易感性，削弱其與腫瘤細胞的相互作用。應用navitoclax（Bcl-2，Bcl-XL，Bcl-w抑制劑）能夠促進CCA荷瘤小鼠體內CAFs的凋亡，并使細胞外間質蛋白減少，進而抑制腫瘤生長，延長宿主生存期。上述結果證明了以腫瘤間質中CAFs為靶點治療CCA的可行性。

8　信號傳導通路

8.1　Notch通路

Notch信號傳導通路在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應能夠通過誘導Notch通路失調導致iCCA的發(fā)生[10]。據(jù)報道[38]，CCA內Notch1以及Notch4通路可分別上調82.9%和56.1%。一項臨床前研究[39]顯示，誘導大鼠肝細胞內Notch1過表達能夠導致iCCA的形成?；谏鲜鲅芯拷Y果，Notch通路可作為一個新的CCA治療靶點。

8.2　Wnt通路

Wnt信號傳導通路是真核生物中普遍存在的高度保守的信號通路，在CCA細胞中高度活化，其下游靶基因Wnt7B和Wnt10A過度表達。研究[24]發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍間質中的炎性巨噬細胞對Wnt通路持續(xù)活化不可或缺。動物實驗證實隨著CCA的不斷進展，Wnt通路亦不斷強化，應用Wnt抑制劑（ICG001、C59）能夠有效抑制腫瘤生長[5]，因此Wnt信號通路可能成為比較重要的臨床治療手段之一。

9　分子靶向治療

目前臨床試驗正在評估針對CCA不同信號通路的分子靶向藥物的療效，如絡氨酸激酶抑制劑艾洛替尼、貝伐單抗、西妥昔單抗等，但并無數(shù)據(jù)表明CCA患者的生存率能從中顯著獲益，故仍需大量的相關研究。最近一項研究[3]發(fā)現(xiàn)約40%的CCA患者存在可作為潛在治療靶點的基因改變。多項臨床前及I期臨床實驗正在評估包括IDH、microRNA以及融合基因在內的新靶點的治療效果[40-41]。總之，CCA的個體化靶向治療仍需多學科聯(lián)合進行深入研究。

10　小結與展望

CCA是一類高度異質性的惡性腫瘤，受解剖部位、腫瘤微環(huán)境、干細胞、細胞間相互作用、基因及表觀遺傳學改變等多種因素的影響。近年來已將CCA按解剖位置、基因背景、病理學、危險因素和遺傳信息的不同進行詳細分類。但未來仍需大量研究工作對已知內容加以更新，并找尋CCA各亞型的特異性分子標記物，并以此為基礎研究針對不同亞型的特異性靶向治療?？傊瑐€體化靶向治療的基礎研究及臨床轉化是CCA未來研究的重點。隨著分子生物學技術的發(fā)展，CCA分子病理學的研究必將逐步深入，有望為臨床治療帶來關鍵性的突破。

[1]杭軼,楊小勇,李文美,等.肝內膽管癌與肝細胞癌臨床特征的比較研究[J].中國普通外科雜志,2015,24(2):175–179.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.02.004.Hang Y,Yang XY,Li WM,et al.Comparative study of clinical features between intrahepatic cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of General Surgery,2015,24(2):175–179.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2015.02.004.

[2]Global Burden of Disease Cancer Collaboration,Fitzmaurice C,Dicker D,et al.The Global Burden of Cancer 2013[J].JAMA Oncol,2015,1(4):505–527.doi: 10.1001/jamaoncol.2015.0735.

[3]Bridgewater J,Galle PR,Khan SA,et al.Guidelines for the diagnosis and management of intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Hepatol,2014,60(6):1268–1289.doi: 10.1016/j.jhep.2014.01.021.

[4]Jiao Y,Pawlik TM,Anders RA,et al.Exome sequencing identifies frequent inactivating mutations in BAP1,ARID1A and PBRM1 in intrahepatic cholangiocarcinomas[J].Nat Genet,2013,45(12):1470–1473.doi: 10.1038/ng.2813.

[5]Boulter L,Guest RV,Kendall TJ,et al.Wnt signaling drives cholangiocarcinoma growth and can be pharmacologically inhibited[J].Clin Invest,2015,125(3):1269–1285.doi: 10.1172/JCI76452.

[6]Borad MJ,Champion MD,Egan JB,et al.Integrated genomic characterization reveals novel,therapeutically relevant drug targets in FGFR and EGFR pathways in sporadic intrahepatic cholangiocarcinoma[J].PLoS Genet,2014,10(2):e1004135.doi:10.1371/journal.pgen.1004135.

[7]Gao Q,Zhao YJ,Wang XY,et al.Activating mutations in PTPN3 promote cholangiocarcinoma cell proliferation and migration and are associated with tumor recurrence in patients[J].Gastroenterology,2014,146(5):1397–1407.doi: 10.1053/j.gastro.2014.01.062.

[8]Fujimoto A,Furuta M,Shiraishi Y,et al.Whole-genome mutational landscape of liver cancers displaying biliary phenotype reveals hepatitis impact and molecular diversity[J].Nat Commun,2015,6:6120.doi: 10.1038/ncomms7120.

[9]Ong CK,Subimerb C,Pairojkul C,et al.Exome sequencing of liver fluke-associated cholangiocarcinoma[J].Nat Genet,2012,44(6):690–693.doi: 10.1038/ng.2273.

[10]Zou S,Li J,Zhou H,et al.Mutational landscape of intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Nat Commun,2014,5:5696.doi: 10.1038/ncomms6696.

[11]Simbolo M,Fassan M,Ruzzenente A,et al.Multigene mutational profiling of cholangiocarcinomas identifies actionable molecular subgroups[J].Oncotarget,2014,5(9):2839–2852.

[12]Churi CR,Shroff R,Wang Y,et al.Mutation profiling in cholangiocarcinoma: prognostic and therapeutic implications[J].PLoS One,2014,9(12): e115383.doi: 10.1371/journal.pone.0115383.

[13]Nakamura H,Arai Y,Totoki Y,et al.Genomic spectra of biliary tract cancer[J].Nat Genet,2015,47(9):1003–1010.doi: 10.1038/ng.3375.

[14]Sia D,Hoshida Y,Villanueva A,et al.Integrative molecular analysis of intrahepatic cholangiocarcinoma reveals 2 classes that have different outcomes[J].Gastroenterology,2013,144(4):829–840.doi:10.1053/j.gastro.2013.01.001.

[15]Arai Y,Totoki Y,Hosoda F,et al.Fibroblast growth factor receptor 2 tyrosine kinase fusions define a unique molecular subtype of cholangiocarcinoma[J].Hepatology,2014,59(4):1427–1434.doi:10.1002/hep.26890.

[16]Ross JS,Wang K,Gay L,et al.New routes to targeted therapy of intrahepatic cholangiocarcinomas revealed by next-generation sequencing[J].Oncologist,2014,19(3):235–242.doi: 10.1634/theoncologist.2013–0352.

[17]Sia D,Losic B,Moeini A,et al.Massive parallel sequencing uncovers actionable FGFR2–PPHLN1 fusion and ARAF mutations in intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Nat Commun,2015,6:6087.doi: 10.1038/ncomms7087.

[18]Udali S,Guarini P,Moruzzi S,et al.Global DNA methylation and hydroxymethylation differ in hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma and relate to survival rate[J].Hepatology,2015,62(2):496–504.doi: 10.1002/hep.27823.

[19]Chiang NJ,Shan YS,Hung WC,et al.Epigenetic regulation in the carcinogenesis of cholangiocarcinoma[J].Int J Biochem Cell Biol,2015,67:110–114.doi: 10.1016/j.biocel.2015.06.012.

[20]Andresen K,Boberg KM,Vedeld HM,et al.Four DNA methylation biomarkers in biliary brush samples accurately identify the presence of cholangiocarcinoma[J].Hepatology,2015,61(5):1651–1659.doi:10.1002/hep.27707.

[21]Wang P,Dong Q,Zhang C,et al.Mutations in isocitrate dehydrogenase 1 and 2 occur frequently in intrahepatic cholangiocarcinomas and share hypermethylation targets with glioblastomas[J].Oncogene,2013,32(25):3091–3100.doi: 10.1038/onc.2012.315.

[22]Saha SK,Parachoniak CA,Ghanta KS,et al.Mutant IDH inhibits HNF 4α to block hepatocyte differentiation and promote biliary cancer[J].Nature,2014,513(7516):110–114.doi: 10.1038/NATURE13441.

[23]Sica A,Invernizzi P,Mantovani A.Macrophage plasticity and polarization in liver homeostasis and pathology[J].Hepatology,2014,59(5):2034–2042.doi: 10.1002/hep.26754.

[24]Goeppert B,Konermann C,Schmidt CR,et al.Global alterations of DNA methylation in cholangiocarcinoma target the Wnt signaling pathway[J].Hepatology,2014,59(2):544–554.doi: 10.1002/hep.26721.

[25]Gradilone S,Radtke BN,Bogert PS,et al.HDAC6 inhibition restores ciliary expression and decreases tumor growth[J].Cancer Res,2013,73(7):2259–2270.doi: 10.1158/0008–5472.CAN–12–2938.

[26]Marzioni M,Torrice A,Saccomanno S,et al.An oestrogen receptor β-selective agonist exerts anti-neoplastic effects in experimental intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Dig Liver Dis,2012,44(2):134–142.doi: 10.1016/j.dld.2011.06.014.

[27]Isse K,Specht SM,Lunz JG 3rd,et al.Estrogen stimulates female biliary epithelial cell interleukin 6 expression in mice and humans[J].Hepatology,2010,51(3):869–880.doi: 10.1002/hep.23386.

[28]Coufal M,Invernizzi P,Gaudio E,et al.Increased local dopamine secretion has growth-promoting effects in cholangiocarcinoma[J].Int J Cancer,2010,126(9):2112–2122.doi: 10.1002/ijc.24909.

[29]Francis H,DeMorrow S,Venter J,et al.Inhibition of histidine decarboxylase ablates the autocrine tumorigenic effects of histamine in human cholangiocarcinoma[J].Gut,2012,61(5):753–764.doi:10.1136/gutjnl–2011–300007.

[30]Harder J,Waiz O,Otto F,et al.EGFR and HER2 expression in advanced biliary tract cancer[J].World J Gastroenterol,2009,15(36):4511–4517.

[31]Clapéron A,Mergey M,Nguyen Ho-Bouldoires TH,et al.EGF/EGFR axis contributes to the progression of cholangiocarcinoma through the induction of an epithelial–mesenchymal transition[J].J Hepatol,2014,61(2):325–332.doi: 10.1016/j.jhep.2014.03.033.

[32]Maroni L,Alpini G,Marzioni M.Cholangiocarcinoma development: the resurgence of bile acids[J].Hepatology,2014,60(3):795–797.doi: 10.1002/hep.27223.

[33]Liu R,Zhao R,Zhou X,et al.Conjugated bile acids promote cholangiocarcinoma cell invasive growth through activation of sphingosine 1 phosphate receptor 2[J].Hepatology,2014,60(3):908–918.doi: 10.1002/hep.27085.

[34]Lozano E,Sanchez-Vicente L,Monte MJ,et al.Cocarcinogenic effects of intrahepatic bile acid accumulation in cholangiocarcinoma development[J].Mol Cancer Res,2014,12(1):91–100.doi:10.1158/1541–7786.MCR–13–0503.

[35]陳雷,尚培中.膽管癌患者癌組織與血清中XIAP、SMAC水平的變化及其臨床意義[J].中國普通外科雜志,2016,25(9):1296–1301.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.09.012.Chen L,Shang PZ.Changes in XIAP and SMAC levels in tumor tissue and serum of patients with cholangiocarcinoma and their clinical significance[J].Chinese Journal of General Surgery,2016,25(9):1296–1301.doi:10.3978/j.issn.1005–6947.2016.09.012.

[36]Kim Y,Kim MO,Shin JS,et al.Hedgehog signaling between cancer cells and hepatic stellate cells in promoting cholangiocarcinoma[J].Ann Surg Oncol,2014,21(8):2684–2698.doi: 10.1245/s10434–014–3531–y.

[37]Mertens JC,Fingas CD,Christensen JD,et al.Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma[J].Cancer Res,2013,73(2):897–907.doi: 10.1158/0008–5472.CAN–12–2130.

[38]Wu WR,Shi XD,Zhang R,et al.Clinicopathological significance of aberrant Notch receptors in intrahepatic cholangiocarcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(6):3272–3279.

[39]Zender S,Nickeleit I,Wuestefeld T,et al.A critical role for notch signaling in the formation of cholangiocellular carcinomas[J].Cancer Cell,2016,30(2):353–356.doi: 10.1016/j.ccell.2016.07.005.

[40]Rizvi S,Borad MJ,Patel T,et al.Cholangiocarcinoma: molecular pathways and therapeutic opportunities[J].Semin Liver Dis,2014,34(4):456–464.doi: 10.1055/s–0034–1394144.

[41]Rizvi S,Gores GJ.Molecular pathogenesis of cholangiocarcinoma[J].Dig Dis,2014,32(5):564–569.doi:10.1159/000360502.