王罡 劉大凱 趙鋼 遲曉飛

現(xiàn)已證明周圍神經(jīng)的再生能力主要歸因于雪旺細(xì)胞, 當(dāng)周圍神經(jīng)損傷時 , 雪旺細(xì)胞可通過分泌神經(jīng)因子、產(chǎn)生促突起生長因子、與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接對神經(jīng)再生發(fā)揮重要作用［1］。雪旺細(xì)胞的生物學(xué)特性決定了其是周圍神經(jīng)再生過程中的重要種子細(xì)胞, 并正成為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域中的研究熱點。七厘散由血竭、紅花、乳香、沒藥、兒茶、冰片、麝香等組成, 具有活血化瘀, 消腫止痛的功效,臨床多用于創(chuàng)傷后神經(jīng)組織出血、水腫、微循環(huán)障礙、減緩由缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［2］。為了解周圍神經(jīng)損傷后中藥七厘散是否可以促使雪旺細(xì)胞增殖分化, 從而促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)問題, 設(shè)計了本實驗?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡SD大鼠4只, 雌雄不限, 體重(180±30)g,均由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心提供。動物均為實驗用合格應(yīng)用, 處理原則符合動物實驗倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)及純化 無菌條件下分離SD大鼠臂叢神經(jīng), 用0.25%的胰蛋白酶消化, 用胎牛血清中止消化,離心以后加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。3～5 d后對細(xì)胞應(yīng)用免疫磁珠陽性分選方法進(jìn)行純化, 培養(yǎng)2 d后進(jìn)行傳代接種,培養(yǎng)過程中對提純后的大鼠臂叢神經(jīng)雪旺細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、并繪制其生長曲線, 采用細(xì)胞免疫熒光染色對細(xì)胞進(jìn)行S-100免疫熒光鑒定并且計算細(xì)胞純度。

1.2.2 七厘散含藥血清的制備 七厘散灌胃液按照0.15 g/1.5 ml配置, 每天每只大鼠灌胃2次, 間隔12 h, 連續(xù)灌胃, 取血當(dāng)日早晨在灌胃, 最后麻醉大鼠開腹, 取血清混合液, 離心后過濾除菌, 以存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同干預(yù)分組 雪旺細(xì)胞經(jīng)過貼壁培養(yǎng)及鑒定后P3代細(xì)胞接種于器皿中, 加入七厘散進(jìn)行干預(yù), 含量5%［3］, 設(shè)為實驗組；對照組加入等量生理鹽水。采用S-100免疫熒光法鑒定雪旺細(xì)胞及純度, 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞活力及增值情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雪旺細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)及鑒定 雪旺細(xì)胞經(jīng)S-100免疫熒光標(biāo)記染色提示陽性細(xì)胞率達(dá)90%以上, 純化后的大鼠臂叢雪旺細(xì)胞純度為(97.5±1.3)%。5%七厘散含藥血清可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖。

2.2 含藥血清干預(yù)后細(xì)胞活力 細(xì)胞計數(shù)顯示, 實驗組倍增時間為6 d, 明顯優(yōu)于對照組的8 d。且實驗組A490值為(0.385±0.037), 高于對照組的(0.347±0.045), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。

3 討論

臂叢神經(jīng)損傷是一種致殘性的疾病, 主要表現(xiàn)以肩胛帶肌為主的疼痛、無力和肌萎縮, 且預(yù)后較差。是一種很嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病, 對患者的影響也特別嚴(yán)重。因此, 對于臂叢神經(jīng)損傷患者的有效治療成為了一個急需解決的問題［4］。

雪旺細(xì)胞是一種神經(jīng)纖維層的外膜, 具有可以增加神經(jīng)元的存活率、促進(jìn)細(xì)胞軸突生長和提高神經(jīng)元再生的能力,保護(hù)正常神經(jīng)傳導(dǎo)性的作用。因此, 雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)再生和周圍神經(jīng)組織工程研究的重要細(xì)胞, 不僅為神經(jīng)修復(fù)提供支撐, 尚可誘導(dǎo)神經(jīng)纖維生長的方向［5］。如果能夠找到一種新的藥物, 能夠提高雪旺細(xì)胞的生物學(xué)活性, 將會對周圍神經(jīng)的修復(fù)與再生, 人工神經(jīng)的創(chuàng)建, 臨床上臂叢神經(jīng)損傷的治療巨大的幫助。

七厘散是《良方集腋》中的方劑, 是治療跌打損傷的名藥,臨床用于治療疾病甚多。有研究顯示, 七厘散含藥血清顯著促進(jìn)外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化, 表現(xiàn)在該組的堿性磷酸酶活性、骨鈣素、I型膠原、鈣鹽沉積量和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)高［3］。也有研究顯示超微粉碎七厘散對急性血瘀大鼠的活血化瘀作用和垂體后葉素(Pit)誘發(fā)大鼠心肌缺血損傷的保護(hù)作用增強, 可降低其給藥劑量［6］。本研究試想通過中藥七厘散對雪旺細(xì)胞增殖分化的影響, 進(jìn)一步探索其治療周圍神經(jīng)的損傷作用, 實驗結(jié)果表明七厘散在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖,從而為促進(jìn)活體神經(jīng)損傷的修復(fù)提供了一些研究基礎(chǔ)。應(yīng)用中藥治療周圍神經(jīng)的損傷在臨床上確有積極的療效。

［1］ 甄雪克, 梁劍峰, 楊文強, 等.丹紅注射液對雪旺細(xì)胞中BDNF表達(dá)的促進(jìn)作用研究.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2014,13(6):571-575.

［2］ 劉愛軍, 陳杏曄.七厘散含藥血清對乳鼠毛囊成纖維細(xì)胞增殖的影響.陜西中醫(yī), 2014, 35(3):375-377.

［3］ 謝興文, 徐世紅, 李寧, 等.七厘散含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化的影響.中國骨質(zhì)疏松雜志, 2012, 18(10):895-899.

［4］ 張柱基, 龐瑞明, 潘海文, 等.七厘散穴位貼敷對髖膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后深靜脈血栓形成的防治.陜西中醫(yī), 2016,37(12):1605-1607.

［5］ 李曉濤, 李長德, 解云川, 等.神經(jīng)干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞共移植對大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的療效.中國老年學(xué)雜志, 2014,33(4):974-975.

［6］ 趙國巍, 梁新麗, 王春柳, 等.超微粉碎七厘散對大鼠急性血瘀血液流變學(xué)及心肌缺血損傷保護(hù)作用的影響.中華中醫(yī)藥雜志, 2015, 30(1):299-301.