何春燕， 劉慶中

金黃色葡萄球菌小菌落突變株研究進(jìn)展及其臨床意義

何春燕， 劉慶中

金黃色葡萄球菌； 小菌落突變株； 臨床意義

金黃色葡萄球菌（金葡菌）能夠引起從癥狀輕微的皮膚軟組織感染到威脅生命的膿毒血癥等各種臨床感染。在感染過程中，該菌能夠形成一種特殊的變體——小菌落突變株（small colony variants， SCV）。金葡菌SCV早在100多年前就已報(bào)道，20年前因發(fā)現(xiàn)其與持續(xù)性、復(fù)發(fā)性難治金葡菌感染相關(guān)而受到關(guān)注[1]。與正常菌株相比，金葡菌SCV生長緩慢、菌落形態(tài)不典型、生化反應(yīng)不活躍，給臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分離和鑒定帶來很大挑戰(zhàn)[2-3]。金葡菌 SCV能適應(yīng)胞內(nèi)生存。這種生存方式的改變同時(shí)伴隨著細(xì)菌代謝的深刻變化，顯著影響病原菌與宿主間的相互作用，結(jié)果常導(dǎo)致以SCV感染為特征的慢性難治性感染[1]。另外，胞內(nèi)生存方式還可保護(hù)細(xì)菌免受抗菌藥物和宿主防御系統(tǒng)的攻擊，加之SCV自身對(duì)一些抗菌藥物敏感性的降低[2]，使得金葡菌SCV感染的危害更為嚴(yán)重。當(dāng)前，金葡菌SCV感染不僅存在于人類，在畜牧獸醫(yī)學(xué)和食品微生物學(xué)領(lǐng)域也有報(bào)道[3]。本文就當(dāng)前研究文獻(xiàn)，對(duì)金葡菌SCV的特征、分類、抗菌藥物敏感性、實(shí)驗(yàn)室分離鑒定、形成機(jī)制、臨床意義及治療方案等方面綜述如下。

1 金葡菌 SCV特征

金葡菌SCV典型特征是生長代謝緩慢、菌落細(xì)?。檎＞甑?/10左右）、色素合成能力低下、溶血性下降、凝固酶反應(yīng)遲緩、毒力基因表達(dá)下調(diào)，與生物膜形成和黏附相關(guān)的主要基因常常表達(dá)增加[4]。菌落細(xì)小多由細(xì)菌缺乏甲萘醌（維生素K3）、氯化血紅素和/或胸腺嘧啶核苷等生長因子所致[2]。SCV常常不太穩(wěn)定，生存于宿主細(xì)胞內(nèi)的SCV可恢復(fù)成高毒力、快速生長的正常形態(tài)菌株，使宿主細(xì)胞裂解導(dǎo)致復(fù)發(fā)或慢性感染[5]。

2 金葡菌SCV的營養(yǎng)缺陷分類

盡管細(xì)菌代謝途徑中的很多變化都可以導(dǎo)致緩慢生長，但目前為止，臨床上已發(fā)現(xiàn)并能明確具體營養(yǎng)缺陷類型的SCV主要是電子傳遞鏈缺陷型（血紅素和甲萘醌缺陷型）、胸腺嘧啶合成缺陷型和CO2依賴型。

2.1 電子傳遞鏈缺陷型

功能性或遺傳性甲萘醌和氯化血紅素合成缺陷導(dǎo)致電子傳遞鏈缺陷，進(jìn)而ATP合成顯著降低，從而形成SCV表型。以往臨床報(bào)道的此種類型SCV常分離自氨基糖苷類抗菌藥物治療的患者，它們可以通過補(bǔ)充甲萘醌或血紅素回復(fù)至親本株表型。幾個(gè)基因的突變與電子傳遞鏈缺陷型SCV形成密切相關(guān)。hemB（編碼膽色素原合酶）和menD [編碼2-琥珀酰-6-羥基-24-環(huán)巳二烯-1-甲酸（SHCHC）合成酶]突變可阻斷甲萘醌和血紅素的生物合成；ctaA突變可阻斷血紅素A（HemA，與細(xì)胞色素生物合成相關(guān)）的生物合成，進(jìn)而影響細(xì)胞色素的合成。電子傳遞鏈缺陷型SCV在代謝上的主要特征為三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA循環(huán)）減弱或缺乏。研究顯示，在這類SCV菌株中主要是acnA基因（編碼順烏頭酸酶）表達(dá)降低，導(dǎo)致TCA循環(huán)途徑碳通量減少[1，6-7]。電子傳遞鏈缺陷型SCV另一特點(diǎn)是不表達(dá)金葡菌附屬基因調(diào)節(jié)子（accessory gene regulator，agr）的效應(yīng)分子RNA III[1，7]。另外，金葡菌SCV和其親本株的cDNA文庫數(shù)據(jù)顯示，表型特異的非編碼蛋白R(shí)NA（non-proteinencoding RNA，npcRNA）的表達(dá)可能也在SCV的形成中發(fā)揮作用[8]。

2.2 胸腺嘧啶脫氧核苷（TD）合成缺陷型

2.3 依賴型SCVCO2

CO2依賴型SCV可分離自不同感染的患者（如手術(shù)傷口感染、醫(yī)療裝置相關(guān)感染、皮膚軟組織感染等）[10]，當(dāng)其處于5% CO2環(huán)境中時(shí)又可恢復(fù)為正常形態(tài)的菌株。但是目前有關(guān)金葡菌CO2依賴型SCV的形成機(jī)制及代謝上的變化還是空白。

另外，臨床上還分離到一些目前仍不能確定具體營養(yǎng)缺陷類型的SCV，其機(jī)制可能涉及呼吸鏈的其他環(huán)節(jié)障礙導(dǎo)致SCV表型產(chǎn)生。

3 影響金葡菌SCV形成的其他因素

雖然在感染進(jìn)程中，金葡菌能夠自發(fā)形成SCV表型[11]，但臨床上分離的金葡菌SCV主要還是與抗菌藥物的長期使用有關(guān)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的體內(nèi)外因素與SCV形成密切相關(guān)。

3.1 喹諾酮類藥物

體外用亞抑菌濃度喹諾酮類藥物作用金葡菌24 h后出現(xiàn)SCV和正常菌株的混合表型。該種SCV在補(bǔ)充氯化血紅素、甲萘醌或胸腺嘧啶脫氧核苷后仍不能回復(fù)為正常形態(tài)的親本菌株，表明其不是傳統(tǒng)概念上的SCV（電子傳遞鏈缺陷型或胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型）。此種SCV形成的機(jī)制可能是影響ATP生成的其他途徑（如TCA循環(huán)酶）相關(guān)基因發(fā)生突變所致[12]。

3.2 三氯生

三氯生是一種人工合成的雙酚類消毒劑，作為抗菌添加劑廣泛應(yīng)用于健康衛(wèi)生保健領(lǐng)域。研究顯示，亞致死劑量的三氯生能夠誘導(dǎo)金葡菌形成非氯化血紅素、甲萘醌或胸腺嘧啶脫氧核苷缺陷型的SCV表型，推測(cè)細(xì)胞壁形成缺陷可能是其產(chǎn)生機(jī)制[13]。

3.3 銅綠假單胞菌（共生細(xì)菌）

金葡菌與銅綠假單胞菌共同生長時(shí)，后者的胞外產(chǎn)物4-羥基-2-庚基喹啉氮氧化合物（HQNO）會(huì)對(duì)金葡菌的呼吸產(chǎn)生抑制效應(yīng)，繼而導(dǎo)致金葡菌SCV的產(chǎn)生。一種名為多重耐藥-ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶（multidrug resistant-ABC transporter permease）的蛋白可能參與了SCV的形成。這種通透酶通過將外源性分子排出胞外以減少后者對(duì)細(xì)菌的損傷作用。金葡菌與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)，能夠上調(diào)并大量表達(dá)多重耐藥-ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶的金葡菌存活下來并表現(xiàn)為SCV表型[1，14]。

4 調(diào)節(jié)金葡菌SCV形成的分子

4.1 agr群感系統(tǒng)

agr（accessory gene regulator system，附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)）是金葡菌上調(diào)胞外毒素和胞外酶表達(dá)的重要雙組份系統(tǒng)。在感染急性期，agr系統(tǒng)過表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)毒力因子的表達(dá)，使得細(xì)菌能夠?qū)姑庖呒?xì)胞攻擊、破壞侵入組織，并進(jìn)一步在深部組織建立感染。侵入宿主細(xì)胞后，細(xì)菌agr系統(tǒng)表達(dá)下調(diào)，使得細(xì)菌獲得長期生存和形成SCV的能力[15]。

4.2 SigB

SigB（sigma factor B）是應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，有助于細(xì)菌應(yīng)對(duì)各種不利的壓力條件。研究表明，sigB基因缺失株不具有形成SCV的能力，而在一些特殊環(huán)境下，如金葡菌與銅綠假單胞菌共存時(shí)，后者的胞外產(chǎn)物就能激活前者的SigB，抑制其呼吸作用，從而誘導(dǎo)金葡菌SCV形成；另外，在慢性感染過程中SigB促進(jìn)生物膜形成和黏附素的表達(dá)。由此認(rèn)為，SigB與細(xì)菌胞內(nèi)長期生存和SCV動(dòng)態(tài)形成具有重要相關(guān)性[1，15]。

4.3 RelA水解酶

Gao等[16]報(bào)道了一種金葡菌SCV形成的新機(jī)制。該菌株relA基因上的1個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致RelA水解酶活性降低，從而給細(xì)菌造成了長期的與SCV形成相關(guān)的嚴(yán)苛應(yīng)激條件。

4.4 活性氧

亞致死濃度過氧化氫產(chǎn)生的活性氧自由基能夠抑制金葡菌增殖，誘導(dǎo)編碼菌株DNA修復(fù)系統(tǒng)RexAB、重組酶A和多聚酶V蛋白的基因發(fā)生突變，進(jìn)而導(dǎo)致慶大霉素耐藥SCV的形成[17]。

4.5 陽離子蛋白

金葡菌進(jìn)入胞內(nèi)后被吞噬形成吞噬體，吞噬體內(nèi)的酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)SCV形成[18]，由于宿主胞內(nèi)主要是陽離子環(huán)境，故而推測(cè)可能是胞內(nèi)的陽離子蛋白對(duì)SCV進(jìn)行了選擇。不過，目前并不清楚具體的物質(zhì)類型，有待進(jìn)一步探究。

5 臨床意義

金葡菌感染的一個(gè)顯著特征是即使進(jìn)行了正確適當(dāng)?shù)目咕幬镏委?，感染也?huì)轉(zhuǎn)為慢性或經(jīng)常復(fù)發(fā)，這一現(xiàn)象與其形成SCV密切相關(guān)。因?yàn)镾CV表型菌株毒力減弱，易于在宿主細(xì)胞內(nèi)生存從而逃避免疫系統(tǒng)攻擊和抗菌藥物作用[4]。即使沒有任何選擇性壓力存在，金葡菌在連續(xù)的復(fù)制分裂過程中也可形成SCV[11]，但未見有其SCV分離自急性感染的報(bào)道。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氨基糖苷類治療金葡菌感染易于形成電子傳遞鏈缺陷型SCV，而甲氧芐啶-磺胺甲唑治療則與TD-SCV的形成密切相關(guān)[1，19]。Tuchscherr等[20]研究顯示，莫西沙星和克林霉素也能促進(jìn)SCV的形成。不過，當(dāng)前仍有許多SCV的形成與抗菌藥物治療間關(guān)系不明。

金葡菌SCV可分離于多種類型的臨床標(biāo)本，表明其與多種感染相關(guān)。目前，各有1例金葡菌SCV引起的起搏器相關(guān)感染和人工心臟瓣膜感染性心內(nèi)膜炎的報(bào)道[1，21]。有3項(xiàng)研究報(bào)道了金葡菌SCV導(dǎo)致的持續(xù)性、復(fù)發(fā)性人工關(guān)節(jié)感染[1]。Sendi等[22]和Tande等[23]報(bào)道分別有6.0%（5/83）和33.6%（38/113）的人工關(guān)節(jié)感染與金葡菌SCV有關(guān)。金葡菌SCV與皮膚、黏膜、軟組織和傷口等的慢性感染也有一定的關(guān)系[1]。Tan等[24]和Kim等[25]在慢性鼻竇炎組織標(biāo)本中也分離出黏膜內(nèi)金葡菌SCV。此外，已有金葡菌SCV分離自Darier?。医腔。┑钠つw感染標(biāo)本[1]。不過，金葡菌SCV還是最常分離自囊性纖維化（cystic fi brosis）患者的氣道感染標(biāo)本。囊性纖維化是一種先天性遺傳性疾病，主要發(fā)病于歐美國家的白種人，患者多死于慢性細(xì)菌感染導(dǎo)致的呼吸衰竭。囊性纖維化患者的氣道具有一種獨(dú)特的環(huán)境，如中性粒細(xì)胞聚集、缺氧、共感染細(xì)菌間的競(jìng)爭及抗菌藥物的選擇壓力等，在這種情況下細(xì)菌易于形成各種適應(yīng)形式，如形成SCV[1]。此外，在乳腺導(dǎo)管閉鎖導(dǎo)致的乳腺膿腫及2型糖尿病病足中也有分離到金葡菌SCV的報(bào)道[26-27]。

6 實(shí)驗(yàn)室診斷

金葡菌SCV不典型的生理、代謝和形態(tài)特征給常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)帶來挑戰(zhàn)。及時(shí)、正確的分離鑒定SCV在臨床上具有重要意義，一是可以提示慢性感染的存在，二是為制定針對(duì)性的治療方案提供依據(jù)。因此，為了正確分離鑒定出金葡菌SCV應(yīng)該遵循以下原則。

6.1 臨床標(biāo)本

組織樣本優(yōu)于拭子，并立即送至實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，確保SCV得以正確培養(yǎng)并避免因細(xì)胞崩裂SCV從胞內(nèi)釋放而發(fā)生表型轉(zhuǎn)換復(fù)原。對(duì)非囊性纖維化相關(guān)感染，標(biāo)本質(zhì)量至關(guān)重要，如關(guān)節(jié)抽出液、術(shù)中留取的組織標(biāo)本、活檢標(biāo)本或液體標(biāo)本最佳，盡量避免采用拭子采樣送檢；對(duì)醫(yī)療裝置或骨樣本，超聲處理能夠提高SCV培養(yǎng)的陽性率。對(duì)囊性纖維化感染，除了常用的痰液外，深部喉拭子也可用于SCV培養(yǎng)[1]。

6.2 培養(yǎng)和鑒定

金葡菌SCV的特性給臨床檢測(cè)帶來不少困難，常常被忽視或錯(cuò)誤鑒定。SCV菌株的分裂時(shí)間大約是正常形態(tài)菌株的6倍，在固體培養(yǎng)基上需要培養(yǎng)24 h以上（大多要48～72 h）才能長成肉眼可見的菌落。血平皿上培養(yǎng)24 h，對(duì)于針尖樣大小[正常菌落大小（1～3 mm）的1/10左右］、無或減少的金黃色色素（白色菌落）、無或減少的β溶血現(xiàn)象的菌落應(yīng)高度懷疑為SCV。對(duì)于TDSCV還會(huì)出現(xiàn)邊緣半透明中間色素偏深的“油煎蛋”樣菌落。由于金葡菌SCV菌落形態(tài)容易與生長緩慢的棒狀桿菌、無溶血現(xiàn)象的鏈球菌或凝固酶陰性葡萄球菌混淆，需注意鑒別。尤其是SCV與形態(tài)正常的親本菌株混合存在時(shí)更容易認(rèn)為是雜菌而被忽視[1]。另外，在金葡菌選擇或顯色培養(yǎng)基上，大多數(shù)SCV不發(fā)生顏色變化。

SCV為厭氧代謝，TCA循環(huán)途徑碳通量減少，加之生長緩慢，導(dǎo)致其生化反應(yīng)減弱或缺乏，致使一些經(jīng)典的鑒定反應(yīng)如發(fā)酵、氧化及多種底物分解不能正常發(fā)生，從而發(fā)生菌株的錯(cuò)誤鑒定甚至是不能鑒定，即使是現(xiàn)代的微生物鑒定系統(tǒng)也是如此。另外，觸酶、凝固酶試驗(yàn)及其他用于初步鑒定的試驗(yàn)也會(huì)陽性時(shí)間延遲甚或陰性。所以基于生化反應(yīng)方法鑒定金葡菌SCV的結(jié)果非常不可靠。種特異性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)和種系標(biāo)志性基因測(cè)序?qū)τ阼b定SCV是一個(gè)比較好的方法，如16S rRNA或rpoB基因測(cè)序，nuc、clfA、eap、coa和sodM等基因的PCR檢測(cè)都可以用于金葡菌SCV的鑒定[1]。隨著質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物學(xué)中的應(yīng)用，也是鑒定金葡菌SCV的可靠方法[1]。

7 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

由于SCV生理和代謝上的特點(diǎn)，影響常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法的培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)菌密度都會(huì)發(fā)生改變，因此檢測(cè)SCV菌株的抗菌藥物敏感性比較困難。對(duì)MIC的解釋應(yīng)當(dāng)十分謹(jǐn)慎。某些特殊菌株其SCV和親本菌株的MIC值一致，但藥效學(xué)研究顯示藥物的抗SCV效果卻顯著下降[2]。對(duì)于金葡菌SCV菌株甲氧西林耐藥性的檢測(cè)，PCR擴(kuò)增mecA、mecC基因或膠乳凝集法檢測(cè)PBP2a比較可靠。能為SCV抗菌藥物敏感性提供指導(dǎo)作用的是瓊脂稀釋法或E試驗(yàn)。藥敏檢測(cè)時(shí)平皿需放置5% CO2培養(yǎng)箱2～3 d[2]。即使如此也要注意結(jié)果的判讀，因?yàn)閷?duì)某些藥物很難獲得清晰可靠的藥敏結(jié)果[1-2]。

8 金葡菌SCV耐藥性

對(duì)于SCV的耐藥性目前尚無大樣本量的流行病學(xué)調(diào)查研究。零星的報(bào)道顯示，SCV菌株對(duì)大多數(shù)抗菌藥物的MIC與其正常表型的親代菌株類似。但由于導(dǎo)致缺陷機(jī)制的原因，氨基糖苷類和抗葉酸類抗菌藥物分別在電子傳遞鏈缺陷型和胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SCV中幾乎全部喪失活性[2]。某些菌株的SCV和親本菌株MIC相比較雖然沒有差別，但藥效學(xué)研究顯示抗菌藥物的抗SCV效果顯著下降，如達(dá)托霉素（需高濃度延長治療時(shí)間才能起到殺菌作用）、萬古霉素和β內(nèi)酰胺類（抗電子傳遞鏈缺陷型SCV效果減弱）[2]。喹諾酮類藥物對(duì)電子傳遞鏈缺陷型和胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SCV高度有效，而慶大霉素只對(duì)胸腺嘧啶脫氧核苷合成缺陷型SCV發(fā)揮作用[2]。

9 金葡菌SCV相關(guān)感染的治療

目前，臨床上仍無葡萄球菌SCV感染的最佳治療方案。但根據(jù)SCV菌株的特點(diǎn)有以下因素需要考慮：①根據(jù)營養(yǎng)缺陷類型判斷SCV的總體耐藥特性；②宿主細(xì)胞內(nèi)的定位；③親本菌株和/或SCV菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果；④感染部位的藥效學(xué)特點(diǎn)。由于SCV菌株常與親本菌株共同出現(xiàn)或是可回復(fù)為正常表型菌株，在治療時(shí)抗菌藥物的使用應(yīng)該覆蓋2種表型的菌株。理想的抗SCV菌株的治療方案應(yīng)該包括能夠穿透宿主細(xì)胞，并具有抗這種緩慢生長表型的抗菌藥物。在臨床實(shí)踐中，經(jīng)常將利福平或氟喹諾酮類聯(lián)合其他種類抗菌藥物治療SCV感染，這種聯(lián)合治療對(duì)清除胞內(nèi)SCV非常有效[1]。對(duì)于青霉素耐藥甲氧西林敏感金葡菌SCV感染，可用耐酶β內(nèi)酰胺類青霉素或第一、二代頭孢菌素治療。對(duì)青霉素敏感SCV感染，青霉素就可用于治療。而對(duì)青霉素敏感性不確定的SCV，在選用青霉素治療的同時(shí)，可增添β內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗菌藥物。對(duì)于甲氧西林耐藥金葡菌（MRSA）SCV感染，則可用萬古霉素治療，持續(xù)嚴(yán)重感染者需用糖肽類抗菌藥物聯(lián)合方案或其他抗MRSA活性的抗菌藥物治療（對(duì)SCV，萬古霉素不是殺菌劑）[1]。

10 展望

SCV是一種異質(zhì)性很大的細(xì)菌群體，其形成機(jī)制多樣、毒力及耐藥水平各異、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)困難。在感染期間，不同的SCV形成機(jī)制以時(shí)間依賴性方式發(fā)揮作用。感染早期，細(xì)菌借助其對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)性的調(diào)節(jié)機(jī)制快速形成SCV。通過這種方式，病原菌能夠侵入宿主細(xì)胞，從而逃避免疫系統(tǒng)攻擊及抗菌藥物的殺傷作用。如果宿主免疫機(jī)制和抗菌藥物不能有效清除細(xì)菌，根據(jù)感染類型和抗菌藥物的選擇性壓力，細(xì)菌可以在電子傳遞鏈系統(tǒng)或嘧啶合成上進(jìn)一步發(fā)生突變，形成持久的SCV。所以，為了有效地治療SCV感染，如何提高實(shí)驗(yàn)室診斷（如鑒定、藥敏）技術(shù)水平及探索出既能清除SCV又能防止產(chǎn)生SCV的治療方案是一個(gè)有待深入研究的領(lǐng)域。目前，我們正在探索模擬臨床抗感染用藥，利用臨床菌株誘導(dǎo)獲得穩(wěn)定金葡菌SCV表型的方法，當(dāng)下已獲得甲氧芐啶-磺胺甲唑藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的穩(wěn)定型金葡菌SCV，繼而對(duì)其進(jìn)行包括基因水平、轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白質(zhì)水平的研究，從而為發(fā)展更為有效的SCV鑒定及治療方法探索新思路、新靶點(diǎn)。

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Research updates and the clinical implications of Staphylococcus aureus small colony variants

HE Chunyan, LIU Qingzhong. （Department of Laboratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 201620, China）

R378.11

A

1009-7708 ( 2017 ) 04-0468-06

10.16718/j.1009-7708.2017.04.023

2016-10-11

2016-12-30