黃艷燕，周言君，余 輝，鐘 揚

(1. 復(fù)旦大學(xué) 中華古籍保護研究院，上海 200433；2. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

紙表微生物的簡易模型與DNA提取方法評價

黃艷燕1,2，周言君2，余 輝1，鐘 揚2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 中華古籍保護研究院，上海 200433；2. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

微生物是造成古籍善本和紙質(zhì)檔案損傷的主要原因之一，近年來不依賴于實驗室培養(yǎng)的高通量測序成為研究紙表微生物的常用方法．但是紙表微生物的含量往往偏低，DNA提取常依賴于昂貴的進口試劑盒，成本過高．本文首先構(gòu)建了一個標準的紙表微生物體系，用傳統(tǒng)棉簽擦拭法獲取該紙表微生物樣品，再利用改良的化學(xué)法、機械破壁法、酶消解法3種方式提取樣品中微生物總DNA并比較其濃度與純度，最后利用PCR擴增驗證提取效果．結(jié)果表明，酶消解法提取所得濃度最高，化學(xué)法次之，機械法最低，但DNA純度正好相反．經(jīng)PCR驗證，化學(xué)法的擴增效果較好．綜合上述指標，改良的化學(xué)法更適宜提取紙表微生物樣品中的總DNA．

紙表微生物； 大腸桿菌； 德氏乳桿菌； DNA提取

紙張的原料是植物纖維、填充料和膠料等物質(zhì)，這些成分皆可作為真菌和細菌生長的營養(yǎng)來源，因而經(jīng)常可以在紙質(zhì)文檔和書籍的表面發(fā)現(xiàn)微生物滋生的痕跡[1-3]．微生物對紙張的損害極大，一般而言，它造成的危害主要有以下幾點： (1) 降解紙張．紙張主要由纖維素這種大分子多糖組成，微生物在生長代謝過程中分泌的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷等物質(zhì)能將其分解[4-5]，造成紙張的老化；(2) 產(chǎn)生有機酸．微生物在代謝過程中會產(chǎn)生有機酸，例如真菌中的曲霉菌易產(chǎn)生檸檬酸和草酸，而細菌中的芽孢桿菌、葡萄球菌等可產(chǎn)生甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸等眾多有機酸[6]，這些有機酸易降低紙張的pH值，進而造成紙張發(fā)脆、加速紙張的老化；(3) 產(chǎn)生色斑．許多微生物在生長過程中會產(chǎn)生一些色素附著于紙張上，形成諸如狐斑等現(xiàn)象，使古籍善本的美觀度下降[7]；(4) 形成“書磚”．微生物的生長代謝過程常會伴有發(fā)潮發(fā)熱的現(xiàn)象，該現(xiàn)象在表皮葡萄球菌、農(nóng)桿菌等細菌中尤為嚴重，如果古籍檔案的保存環(huán)境不佳、管理不善，極易造成書頁粘連，形成“書磚”．

由于微生物會造成古籍、檔案等珍貴文本不可逆的損害，近年來它已成為古籍保護領(lǐng)域的研究熱點．最初，研究人員僅將目光放在可見的霉斑上，他們利用實驗室培養(yǎng)的方法采集、分離、鑒定紙表的微生物[8-9]．但是自然界中的微生物可培養(yǎng)的數(shù)量不到1%，這種方法會遺漏大部分的生物信息．近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，開始有科學(xué)家嘗試選用此法，不依賴于培養(yǎng)獲取全面的微生物信息[10]．然而，高通量測序鑒定紙表微生物多樣性的方法對樣品DNA的要求較高，而某些文檔由于其自身的特殊性(如珍貴的古籍善本、脆化嚴重的紙質(zhì)檔案等)，若僅采用棉簽輕微擦拭的方式進行樣品采集，所得樣本量較少，這類紙表的微生物DNA提取具有一定的困難性．目前，常依賴于進口試劑盒對這類紙表微生物進行DNA提取，成本較高，不適于大規(guī)模樣本的調(diào)研及紙表微生物研究的普及，如何開發(fā)一種適合的紙表微生物DNA提取方法迫在眉睫．

本文構(gòu)建了一個便于定量的紙表微生物模型，并針對此模型用經(jīng)改良的機械法、化學(xué)法和酶消解法提取了紙表微生物的DNA，以DNA的濃度、純度及PCR驗證結(jié)果為指標，評價了3種方法的優(yōu)缺點，得到了一套穩(wěn)定可用的紙表微生物的DNA提取方法．

1 材料與方法

1.1 材料

1.2.1 菌種

革蘭氏陰性菌代表菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)；革蘭氏陽性菌代表菌為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)；兩者皆為實驗室保藏菌株．

1.2.2 試劑

DNA抽提液Ⅰ： 100mmol/L Tris-HCl(pH9.0)；50mmol/L EDTA(pH8.0)；質(zhì)量濃度2%的SDS；DNA抽提液Ⅱ： 體積分數(shù)2%的Tritonx-100，質(zhì)量濃度10%的SDS，0.1mol/L的NaCl，0.01mol/L的Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L的EDTA；DNA抽提液Ⅲ： 1mol/L山梨醇，100mmol/L的EDTA，14mmol/L的β-巰基乙醇；TE緩沖液： 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L的EDTA．

1.2 方法

1.2.1 紙表微生物模型的構(gòu)建

不同紙表、同一紙表不同區(qū)域的微生物含量差異較大，為確保不同樣本間實驗結(jié)果的可比性，擬采用人工滴加菌種的方法，構(gòu)建一個標準模型用于后續(xù)評價．具體方法為： 將手工紙裁成3cm×3cm的正方形，121℃滅菌20min后烘干待用；過夜培養(yǎng)大腸桿菌(革蘭氏陰性菌，pH7.0左右)和德氏乳桿菌(革蘭氏陽性菌，pH5.8左右)，對二者分別進行平板計數(shù)，確保活菌數(shù)目在1.7×107以上；用移液槍吸取100μL的大腸桿菌滴在正方形手工紙的中央，任其吸收30min后陰干；用無菌棉拭子蘸取少量潤濕液后擦拭手工紙的紙表，順勢擦拭20下后將棉拭子頭撥下后留待提取微生物DNA；將大腸桿菌替換成德氏乳桿菌后重復(fù)上述步驟；每種提取方法重復(fù)3次，將100μL的大腸桿菌和100μL的德氏乳桿菌的菌液單獨用酚氯仿法提取DNA作為標準對照．

1.2.2 紙表微生物DNA的提取

1) 化學(xué)改良法

將谷艷昌等人[11]提出的一種化學(xué)法做進一步改良提取微生物DNA，具體方法為： 將棉拭子頭置于1.5mL的EP管中；加入500μL的DNA抽提液Ⅰ，于65℃水浴1.5h，每隔10～15min混勻1次；離心取上清，等體積的氯仿異戊醇抽提后,再用酚氯仿抽提2次；等體積異戊醇沉淀DNA,離心沉淀用75%乙醇洗2次,晾干,加30μL的TE緩沖液溶解,-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2) 機械改良法

參照金欣等人[12]提出的機械破壁法提取紙表微生物DNA，具體步驟為： 將棉拭子頭置于2mL的甘油管中，管中預(yù)先放置0.2g無菌玻璃珠；加入500μL的DNA抽提液Ⅱ；加500μL的10% SDS及800mL的氯化芐，劇烈震蕩至肉眼觀察呈乳狀；去除玻璃珠后將上述液體分裝至2個新的1.5mL的EP管種，52℃水浴1h，每10min震蕩混勻1次；重復(fù)酚氯仿的DNA提取步驟．

3) 酶消解改良法

參照周萬青等人[13]提出的溶胞酶消解法，具體操作步驟如下： 將棉拭子頭置于1.5mL的EP管中；加入500μL的DNA抽提液Ⅲ；加入200U的溶細胞酶(Lyticase)，于30℃溫育30min，每15min上下振蕩混勻一次；離心取上清，重復(fù)酚氯仿的DNA提取步驟．

1.2.3 DNA質(zhì)量的評定

將3種方法提取的DNA用Nanodrop 2000分光光度計測定其吸光度，比較DNA樣品的基因組DNA濃度及吸光度比值A(chǔ)260/A280；進一步用PCR擴增驗證3種方法的DNA提取效果，以直接從菌液中提取的微生物DNA作為參照，用16S rDNA通用引物(8F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；805R： 5’-GAC TACCAGGGTATCTAATC-3’)進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為： 95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，共40個循環(huán)；72℃ 8min；將PCR擴增所得產(chǎn)物利用1%的凝膠電泳進行跑膠后觀察比較．

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的濃度比較

利用Nanodrop 2000測定3種提取方法所得DNA濃度，結(jié)果如表1所示.從DNA的濃度上可知，酶消解法所得的DNA濃度高于其他兩種方法，大腸桿菌可達菌液濃度的53.76%，而德氏乳桿菌可達菌液濃度的38.76%．但該法的誤差較大，大腸桿菌中的誤差達到近50%；化學(xué)法次之，所得DNA濃度為15.30%和20.95%；機械法所得的DNA濃度最低，僅菌液的3.40%和4.85%．

表1 3種提取方法的DNA濃度比較

1) (每種方法提取的DNA濃度的均值)/(常規(guī)酚氯仿法提取的DNA濃度的均值)×100%得到；2) 常規(guī)酚氯仿法.

2.2 DNA的純度比較

通過Nanodrop 2000測定DNA的A260和A280吸光值，計算其比值，得到每個樣品的A260/A280值，結(jié)果如表2所示．一般而言，DNA的A260/A280比值在1.8～2.0間屬于純度較高．由此可知，通過機械法提取得到的DNA純度較高，革蘭氏陰性菌大腸桿菌的純度在1.813左右，而革蘭氏陽性菌德氏乳桿菌的純度在1.931左右；化學(xué)法獲得的DNA純度次之，在1.4～1.6左右；酶消解法獲得的DNA純度最低，在1.2～1.4左右．通過常規(guī)酚氯仿法提取得到的菌液中的DNA，其純度都較好，A260/A280比值在2.0左右．

表2 3種提取方法的DNA純度比較

*常規(guī)酚氯仿法.

2.3 PCR擴增結(jié)果比較

以提取的DNA為模板，利用通用引物進行PCR擴增后凝膠電泳，所得結(jié)果如圖1(見第718頁)所示： 經(jīng)通用引物擴增后，兩種細菌的菌液DNA樣品都擴增到了大約750bp左右的目的片段(Lane1～3為大腸桿菌的3個生物學(xué)重復(fù)，Lane14～16為德式乳桿菌的3個生物學(xué)重復(fù))；用改良的化學(xué)法提取的DNA為模板，兩種細菌都擴增到了與菌液DNA大小相近、亮度稍淺的目的片段，即化學(xué)法提取得到了兩種細菌完整的DNA信息，且能用于PCR后續(xù)操作；以機械法提取的DNA為模板，僅德式乳桿菌能得到預(yù)期條帶(Lane20～22)，而大腸桿菌則未能得到，這一結(jié)果也與大腸桿菌過低的DNA濃度相吻合；酶消解法中，盡管所得的DNA濃度較高(均值約為90ng·μL-1)，但A260/A280的比值偏低(均值約為1.250)，說明DNA中極可能混入了雜質(zhì)，進而可能影響了PCR反應(yīng)體系，2種細菌皆未能得到很好的擴增條帶．

3 討 論

本文針對一個紙表微生物的簡易模型，比較了3種不同的DNA提取方法所得到的DNA質(zhì)量，結(jié)果顯示改良后的化學(xué)法提取得到的兩種代表菌的DNA濃度皆符合要求，可用于后續(xù)高通量測序?qū)嶒灒?/p>

為了評價不同方法對紙表微生物DNA的提取效果，本文利用革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌德氏乳桿菌為模型用菌進行紙表菌液滴加．這兩種微生物經(jīng)過夜培養(yǎng)后，前者的pH值偏中性，比較符合普通紙張的pH范圍，而后者的pH值在5.8左右，與一些酸化紙表的pH值較為接近[14-17]；另一方面，這兩種微生物的實驗室培養(yǎng)較真菌而言稍簡便，易得到均勻的菌液體系，反觀真菌，由于在培養(yǎng)過程中易生成菌絲結(jié)構(gòu)，使菌液團結(jié)在一起，菌液中的菌體分布極不均勻，無法用于可重復(fù)的標準模型中，因而大腸桿菌和德氏乳桿菌是兩種比較適合作為模擬紙表微生物的模型用菌．

在構(gòu)建了簡易的可重復(fù)實驗的模型后，本文比較了3種不同的DNA提取方法，即化學(xué)法、機械法和酶消解法，這3種方法的主要差異在于前期的細胞裂解步驟．對于微量的DNA樣本而言，如何做到高效裂解細胞但又不損傷DNA是保證高質(zhì)量DNA的一大要素．DNA裂解方法有很多，除了本文中所用的3種，還有一些諸如液氮研磨法、超聲破碎法、變性劑裂解的方法[18-20]，經(jīng)過比較，最終選定適合從棉拭子中提取DNA的化學(xué)法、機械法和酶消解法．

在上述3種方法中，化學(xué)法運用了高濃度的陰離子去污劑SDS來提取DNA，避免了機械法中的強力機械破壁和酶消解法中過多的蛋白質(zhì)(酶)的代入，所得DNA較適合后期的PCR擴增；機械法中，雖然使用強力的破壁方法保證破壁完整，但過程中過高的溫度、大量的機械破壞可能造成了DNA損失，結(jié)果DNA回收率僅達3%～5%；酶消解法中，嘗試用大量的酶來溫和地破壁，但可能是由于引進了太多的酶，后期去除方式不夠徹底，造成整體的A260/A280比值偏低，盡管測得的DNA濃度較高，但可能是污染引起的，后期的PCR擴增效果并不理想．雖然化學(xué)法在這3種方法中表現(xiàn)優(yōu)異，但本文中的簡易模型與真實紙表微生物情況仍有差距．化學(xué)法中所用的SDS會根據(jù)所裂解的微生物種類不同而產(chǎn)生效果差異[21]，因此，在實際應(yīng)用時還需進一步調(diào)整改進該方法．

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A Simple Model and DNA Extraction of Microbes from Paper Surface

HUANG Yanyan1,2, ZHOU Yanjun2, YU Hui1, ZHONG Yang2

(1.ChineseAncientBooksPreservationandConservationInstitute,FudanUniversity,Shanghai200433,China;2.SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Microorganism is the current research hotspot as one of the important reasons caused serious damage for ancient books and documents. Since the amount of microbes on the paper surface is limited, their genome DNA has to be extracted with the expensive kits. In order to develop a cheaper and easier method, we first constructed a simple system to simulate the microbiota niche on the paper surface. The samples were collected with the cotton tip and the genome DNA were extracted with three different methods. The concentration and purity of DNA were compared with each other and the quality of DNA was evaluated with PCR amplification. The results showed that the concentration of the DNA extracted with enzyme method was the highest than those of chemical method and physical method, but the purity was just on the opposite. PCR results indicated that the DNA quality with the chemical method was better than other two methods, which implied that the chemical method was with potential to be adopted in the DNA extraction from paper surface.

microorganism from paper surface;Escherichiacoli;Lactobacillusdelbrueckii; DNA extraction

0427-7104(2016)06-0715-05

2016-10-15

黃艷燕(1983—)，女，博士研究生；鐘 揚，男，教授，E-mail： yangzhong@fudan.edu.cn.

Q 943.2

A