（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

基因芯片在豬遺傳育種中的應(yīng)用

許 棟，何 俊，賀長青，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

該文對基因芯片技術(shù)的原理、制備方式、分類、優(yōu)點以及近些年在豬的遺傳育種中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

基因芯片；抗病育種；豬肉品質(zhì)

隨著功能基因組學(xué)研究的不斷深入，用傳統(tǒng)的實驗方法如RT-PCR或Northern印記雜交法來研究基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，受電泳泳道數(shù)量的限制已經(jīng)不能滿足當(dāng)前研究的需求，而是需要能夠同時監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的技術(shù)，并且可以迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律，基因芯片技術(shù)應(yīng)運而生。

1 基因芯片技術(shù)

基因芯片（gene chip），又名DNA微陣列（DNA microarray）、生物芯片（biochip）、DNA芯片（DNA chip），它是一種小型的分析裝置，能夠?qū)Υ罅炕蚝瓦z傳信息進(jìn)行快速精準(zhǔn)的檢測、分析。制作基因芯片時，通過微加工技術(shù)，將大量的已知或未知的DNA序列片段點在經(jīng)特殊處理的玻片（規(guī)格為2×2 cm2）、金屬片或尼龍膜上，變性、固定后形成DNA微陣列?；蛐酒腔诤怂岱肿与s交發(fā)展的技術(shù)，它可同時對成千上萬個DNA片段進(jìn)行處理分析，具有技術(shù)操作簡單、自動化程度高、多樣品并行處理、檢測效率高、應(yīng)用范圍廣、序列數(shù)量大、分析速度快、所需樣品數(shù)量少、操作污染少等許多優(yōu)點，在很大程度上彌補了傳統(tǒng)核酸印跡雜交的許多不足[1]。

基因芯片有3種制備方式：簡易基因芯片、大規(guī)模芯片和光纖微珠芯片。簡易芯片一般用手工制作或者機械手點樣，涉及的基因數(shù)量少（不超過2 000個基因），主要是用來研究小部分特定基因的表達(dá)調(diào)控情況。大規(guī)模芯片涵蓋基因組規(guī)?；驍?shù)量大于10 000個基因的組織，制備樣品根據(jù)實際情況采用接觸式點樣、非接觸式點樣或者半導(dǎo)體技術(shù)。美國Affymetrix公司制備的基因芯片產(chǎn)品在1．28×1．28 cm2的基片上可包含30萬個20～25 mer寡核苷酸探針，其實驗室芯片的陣列數(shù)已經(jīng)超過100萬個探針。光纖微珠芯片技術(shù)（Beadarray technology）是基于光導(dǎo)纖維技術(shù)上發(fā)展起來的一種新的基因芯片技術(shù)，其用途主要集中在SNP（單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記）及基因型分析、基因表達(dá)譜分析和蛋白組學(xué)研究三大領(lǐng)域。相比其他的芯片制作技術(shù)，光纖微珠芯片具有密度高、測試重復(fù)性好和定制方便的優(yōu)勢。

目前廣泛使用的基因芯片大致分為兩類：以cDNA（互補脫氧核糖核酸）為探針的表達(dá)譜芯片和以寡核苷酸為探針的表達(dá)譜芯片。cDNA芯片以PCR產(chǎn)物[cDNA或EST（表達(dá)序列標(biāo)簽）片段]為模板，長度在數(shù)百到2 000個堿基對，其優(yōu)點是制作方便，適用于規(guī)模不大但研究目的特殊的項目使用，缺點是點樣濃度不均勻或者錯誤[2]。寡核苷酸芯片采用光蝕刻技術(shù)，以硅片作固相支持物，將經(jīng)過選擇優(yōu)化的序列如原位合成長約25個堿基對的寡核苷酸、或是預(yù)先合成好的長度60～100個堿基對的寡核苷酸點在載玻片上，制成芯片[3]。與cDNA芯片相比，寡核苷酸芯片的優(yōu)點是：無需擴(kuò)增，防止擴(kuò)增失敗影響實驗；減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因；雜交溫度均一，提高雜交效率；減少二級結(jié)構(gòu)。

2 基因芯片在豬遺傳育種中的應(yīng)用

研究人員以往只能用自制的基因芯片對豬基因組進(jìn)行研究，研究范圍并不廣，自美國Affymetrix公司推出豬的全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)芯片以來，對豬基因組的研究越來越廣泛，在目前可用的平臺，Affymetrix公司的豬陣列是豬基因組學(xué)研究中最敏感的和可重復(fù)的微陣列[4]。

基礎(chǔ)研究和人類生長發(fā)育、生理、病理知識的獲得與使用合適的生物模型密切相關(guān)。即使小鼠和大鼠是人類生物模型最常用的兩種哺乳動物，但是它們的許多生理參數(shù)如大小、喂養(yǎng)及呼吸速率實際上與人類的差異很大，此外，嚙齒類動物的基因組進(jìn)化速度要比人類基因組的進(jìn)化速度快[5]。盡管豬的妊娠周期長（豬114 d，老鼠20 d）且飼養(yǎng)昂貴，但作為與人類最相似的生物模型，它可以克服很多問題。尤其是豬與人這兩個物種在器官的大小、不同的解剖特點和生理和器官的發(fā)育上都非常相似，所以使用豬作生物模型來研究人類的一些重要問題如心血管[6-7]、胃腸道[8]、神經(jīng)系統(tǒng)[9]、眼睛[10]或肌肉[11]方面的疾病，還有與器官移植相關(guān)的研究[12-13]。豬已經(jīng)成為能夠克服日益增長的需求和可用于人類移植器官的供應(yīng)之間關(guān)系最重要的異種移植物種[12，14-15]。

有關(guān)豬的基因組結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)調(diào)控和潛在的生理病理分子機制的認(rèn)知遠(yuǎn)不如在大鼠和小鼠上取得的成果。豬基因組測序聯(lián)盟已經(jīng)完成了90%以上的豬基因組測序[16]。豬基因組的詳細(xì)信息以及一些新型的轉(zhuǎn)基因技術(shù)大大增加了我們創(chuàng)造特定且有用的豬模型的可能性。近來，豬脂肪和肌肉組織中的DNA亞甲基圖譜已經(jīng)發(fā)表[17]，基因組序列和基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析還要進(jìn)行進(jìn)一步地研究。大部分研究都集中在豬的免疫系統(tǒng)[18-22]，而全基因組的表達(dá)分析已經(jīng)在不同的組織中被描述[23]。

2.1 基因芯片技術(shù)在豬的抗病育種中的開發(fā)和應(yīng)用

基因芯片技術(shù)具有高通量、并行性和微型化的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病、腫瘤的診斷[24]，目前，我國豬傳染病流行的主要特點是多病原混合感染，繁殖障礙性傳染病普遍存在，呼吸道傳染病日益突出。采用基因芯片技術(shù)，借助多重PCR、核酸雜交以及酶標(biāo)技術(shù)，建立了由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（p orcine reproductive and respiraory syn drome virus，PRRSV）、豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine cirocovirus-2，PCV-2）、日本乙型腦炎病毒（Japanese B ence phalitis virus，JEV）和豬偽狂犬病病毒（porcine psudorabies virus，PRV）這6種病毒引發(fā)的豬病毒性繁殖障礙病低密度基因芯片診斷方法[25]。利用該方法可以對混合感染樣本中的6種病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測，達(dá)到鑒別診斷的目的。當(dāng)前引起豬繁殖障礙的3種主要病原體有PRV、PPV和JEV[26]，針對這3種典型的病毒成功制備了引起豬繁殖障礙的病毒性傳染病檢測基因芯片并進(jìn)行了該基因芯片的檢測方法研究，相比普通多重PCR，多個探針同時能夠?qū)ν粋€靶病原檢測，大大提高了檢測的靈敏度[27]。

副豬嗜血桿菌（HPS）是一種革蘭氏陰性桿菌的豬病原體，能導(dǎo)致副豬嗜血桿菌病，它的臨床癥狀是引發(fā)纖維蛋白的多發(fā)性漿膜炎，腦膜炎和關(guān)節(jié)炎[28]，其他臨床表現(xiàn)，如急性肺炎、急性筋膜炎、肌炎，急性敗血癥和微血栓的形成造成播散性血管內(nèi)凝血也有一些報道[29-31]?；蛐酒治鰯?shù)據(jù)表明，一系列的基因參與免疫反應(yīng)激活HPS入侵后，尤其是炎癥和急性期反應(yīng)的基因。這一發(fā)現(xiàn)可能有助于解釋的復(fù)雜機制系統(tǒng)性炎癥引起的疾病的發(fā)病機制，增加我們對感染革蘭氏陰性細(xì)菌HPS的理解[32]。豬鏈球菌是在豬斷奶后引起敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎的一種重要的致病菌，過去這些年，這種病原體被認(rèn)為是一種新型的人畜共患病的病原菌[33]。人類感染豬鏈球菌后主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和感染性休克[34]。Dang等人第一次采用基因芯片技術(shù)對豬流感病毒或鏈球菌或二者都有感染后的豬氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行了一個全面的基因表達(dá)分析，流感病毒在呼吸道上皮細(xì)胞中可以大量復(fù)制，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的炎癥細(xì)胞浸潤；在合并感染的情況下，這些細(xì)胞無法吞噬和殺死鏈球菌反而被高度激活，豬鏈球菌并不被視為主要肺病原體，但加劇了在合并感染下的促炎介質(zhì)產(chǎn)生，這可能是非常重要的發(fā)病機制[35]。這些研究成果為當(dāng)前豬流行病的治療提供了很多重要的依據(jù)和方向。

2.2 基因芯片技術(shù)在豬肉品質(zhì)改良中的應(yīng)用

利用基因芯片技術(shù)對不同品種的豬進(jìn)行研究，可以全面監(jiān)測不同遺傳背景的豬肌肉細(xì)胞在一定條件下的基因表達(dá)并進(jìn)行聚類分析，以此來研究肌肉細(xì)胞中聚類在一起的功能基因，當(dāng)一個或幾個未知功能的基因與已知功能類的基因聚在一類，就可推斷這個未知功能的基因具有已知功能類基因所具有的功能，從而獲得更多新的改良肉品質(zhì)的候選基因，豐富了豬的遺傳數(shù)據(jù)，也為豬肉品質(zhì)改良研究奠定了基礎(chǔ)。利用載有5 500個豬cDNA克隆的自制芯片上研究22周齡巴克夏豬的腰大?。t肌）和背最長?。ò准。@得了115個差異表達(dá)的基因[36]，WU T等人[37]在本地著名豬種金華豬和外來豬種長白豬的背最長肌的差異基因研究中，發(fā)現(xiàn)了一個新的脂肪沉積的候選基因，porcine FLJ36031（pFLJ）基因，在90日齡的金華豬中高表達(dá)，對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的沉積有明顯的促進(jìn)作用。為了獲得與肌肉生長和脂肪沉積相關(guān)的基因，利用基因芯片技術(shù)對本地的滇南小耳豬、藏豬和外來的長白豬、大白豬4個遺傳背景相差較大的4個豬種進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)CAV2、MYOZ2和FRZB基因是調(diào)節(jié)肌肉生長的關(guān)鍵基因，F(xiàn)ASN、SCD和ADORA1基因是調(diào)節(jié)脂肪沉積的關(guān)鍵基因，并且獲得了85個與肌肉生長相關(guān)的基因，27個與脂肪沉積相關(guān)的基因，這些成果為進(jìn)一步研究豬的經(jīng)濟(jì)性狀提供了新的方向[38]。很少有豬骨骼肌基因表達(dá)的比較研究，大部分人都關(guān)注背最長肌而不是比較背最長肌和半膜肌[36-37]，但是在這兩種肌肉中，差異表達(dá)的基因數(shù)量非常高，Hornsh j等[39]曾在這兩種肌肉類型中獲得了一個類似的表達(dá)譜，然而紅肌和白肌的比較研究遠(yuǎn)比背最長肌和半膜肌的比較研究多，這直接導(dǎo)致豬[36，40]和小鼠[41]中得到的差異表達(dá)基因很少。Frederic等[42]利用“Genmascq”芯片對90頭半同胞的杜洛克豬、大白豬和漢普夏豬的背最長肌和半膜肌進(jìn)行了研究，獲得了3 823個差異表達(dá)基因（P≤0．05），其中1 690和2 133個基因分別在背最長肌和半膜肌中過表達(dá)。

過去的十幾年里，利用基因芯片技術(shù)獲得了大量的豬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[43-45]，其中Affymetrix豬基因組芯片對豬轉(zhuǎn)錄組的研究表現(xiàn)出了特別優(yōu)越的性能[46-47]。

3 展望

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，人類已經(jīng)從基因組時代進(jìn)入了后基因組時代，基因芯片技術(shù)在各個領(lǐng)域已經(jīng)充分顯示出它的巨大作用，即便存在花費成本大、檢測結(jié)果具有不同程度的假陽性、易產(chǎn)生光暈效應(yīng)、結(jié)果處理和數(shù)據(jù)分析復(fù)雜、不能檢測蛋白質(zhì)水平的差異等問題。在生物科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的21世紀(jì)，基因芯片技術(shù)是集生命科學(xué)和信息科學(xué)于一體的技術(shù)，越來越多的科學(xué)家已經(jīng)利用該技術(shù)進(jìn)行品種改良的研究，目前已成為豬和其他家畜的分子育種和抗病研究的重要工具，為當(dāng)前快速實現(xiàn)品種改良和豐富遺傳數(shù)據(jù)資源做出了重要的貢獻(xiàn)。

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2016-12-07）

寧鄉(xiāng)花豬基礎(chǔ)研究（5026401-0315069）

許棟（1990-）女，漢，湖南岳陽人，博士在讀，學(xué)生，就讀于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物遺傳育種與繁殖專業(yè)，豬的分子遺傳，E-mail：112668472@qq.com