楊 簡 范致星 楊 俊 丁家望 楊超君 曾 萍

(三峽大學(xué)心血管病研究所 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

大鼠miR-24腺病毒載體構(gòu)建和鑒定

楊 簡 范致星 楊 俊 丁家望 楊超君 曾 萍

(三峽大學(xué)心血管病研究所 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

目的構(gòu)建含miR-24基因的重組腺病毒，為后期研究miR-24在大鼠頸動脈球囊損傷所致血管再狹窄(RS)中的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法PCR釣取目的基因miR-24，連接入穿梭載體GV139。采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，將構(gòu)建的miR-24重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與輔助包裝質(zhì)粒(PBHG)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用實(shí)現(xiàn)重組，得到重組腺病毒，并進(jìn)行重組腺病毒擴(kuò)增、純化及滴度測定。結(jié)果成功構(gòu)建了大鼠miR-24腺病毒載體，滴度為1×109PFU/ml。結(jié)論成功獲得含miR-24基因的重組腺病毒，為后期順利開展有關(guān)miR-24在血管RS中的作用及分子機(jī)制研究提供了可能。

miR-24；腺病毒；載體；頸動脈；球囊損傷；再狹窄

miRs是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，22～25個(gè)核苷酸。其通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補(bǔ)配對結(jié)合，使靶mRNA降解或翻譯抑制，從而來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列生理進(jìn)程〔1〕。研究表明不同血管特異性miRs 如miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-205、miR-92a、miR-145等通過調(diào)節(jié)各自的靶mRNA，參與調(diào)控?fù)p傷血管再狹窄(RS)的病理生理過程或者發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)〔2～5〕。miR-24在機(jī)體內(nèi)含量的改變與病理性血管新生內(nèi)膜的形成有著密切的關(guān)系〔6〕。但有關(guān)miR-24在血管RS這一病理過程中的作用及其調(diào)控機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究旨在通過miR-24腺病毒載體的構(gòu)建、鑒定，腺病毒的包裝、擴(kuò)增、純化等實(shí)驗(yàn)過程，獲得具有一定滴度含miR-24基因的重組腺病毒，為后期研究miR-24在血管損傷所致RS中的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1大鼠miR-24穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)含AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切位點(diǎn)的引物，該引物同時(shí)含有目的基因5’端部分序列用于PCR釣取目的基因，引物序列正義鏈：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCGAAATCTTGAATGCAGTAGGC-3′，反義鏈：5′-GGAGGGAGAGGGGCGGATCCCTCTGCACTCTATTCAATG-3′。PCR反應(yīng)條件：98℃ 5 min；98℃ 10 s；55℃ 10 s；72℃ 30 s；30個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。對釣取的目的基因產(chǎn)物進(jìn)行AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切。用AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切腺病毒載體GV139以使其線性化，并與同樣被酶切的目的基因進(jìn)行連接。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，對長出的克隆進(jìn)行酶切鑒定和測序比對。

1.2腺病毒載體的包裝 本實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒抽提試劑盒提取構(gòu)建的miR-24穿梭質(zhì)粒DNA和輔助包裝質(zhì)粒pBHG loxΔE 1,3 Cre DNA，將提取的質(zhì)粒DNA 溶于除菌的TE緩沖液中，且保證A260/A280在1.8～2.0。將制備的質(zhì)粒DNA 5 μg加入一滅菌的離心管中并用DMEM混合均勻(共50 μl)，在室溫下溫育5 min。另取10 μl脂質(zhì)體2000試劑與50 μl DMEM 混合，同樣室溫下溫育5 min。把上述兩種稀釋液進(jìn)行混合，在室溫下溫育20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染至人胚腎293細(xì)胞培養(yǎng)液中混勻、培養(yǎng)。6 h后倒去培養(yǎng)液，加入含10% 血清的細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml，繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，若細(xì)胞出現(xiàn)病變、脫壁等現(xiàn)象，提示包裝成功。收集上清液(粗提液)，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3重組腺病毒的擴(kuò)增和純化及滴度測定 第1輪擴(kuò)增：將人胚腎293細(xì)胞傳入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待60%融合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶中加入粗提液2 ml，于培養(yǎng)箱中孵育90 min，最后再補(bǔ)加完全培養(yǎng)液3 ml并繼續(xù)培養(yǎng)。待出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變、細(xì)胞脫壁時(shí)，收集病毒上清液于-70℃保存。第2輪擴(kuò)增：將人胚腎293 細(xì)胞傳入T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待90%融合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，加入首輪擴(kuò)增的病毒液2 ml，置于培養(yǎng)箱中孵育90 min，最后補(bǔ)加完全培養(yǎng)液10 ml并繼續(xù)培養(yǎng)。待出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變、細(xì)胞脫壁時(shí)，收集病毒上清液于-70℃保存。將第2輪擴(kuò)增的病毒上清液按相關(guān)步驟進(jìn)行純化〔7〕，并感染人胚腎293細(xì)胞，以終點(diǎn)稀釋法計(jì)算滴度值。

2 結(jié) 果

2.1陽性克隆的鑒定與測序 PCR釣取的目的基因miR-24經(jīng)過交換、經(jīng)轉(zhuǎn)化后，行菌落PCR的鑒定，其結(jié)果與預(yù)期相符。重組陽性克隆測序，序列全部測通，miR-24穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2腺病毒載體包裝的結(jié)果 miR-24穿梭質(zhì)粒和腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞大約10 d后，觀測到細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，提示腺病毒包裝成功。

2.3重組腺病毒擴(kuò)增和純化及滴度測定的結(jié)果 兩輪擴(kuò)增時(shí)，大部分細(xì)胞都出現(xiàn)了典型的細(xì)胞病變及脫壁現(xiàn)象。對病毒濃縮液滴度測定，顯示病毒滴度為1×109PFU/ml。

3 討 論

介入治療、冠脈搭橋手術(shù)是冠心病目前主要的治療方式〔8〕。然而，冠脈支架術(shù)后限制了其遠(yuǎn)期療效，藥物涂層支架也沒有從根本意義上消除RS〔9〕。目前認(rèn)為RS 形成原因有：擴(kuò)張的球囊對血管壁的直接損傷；多種炎癥因子、細(xì)胞生長因子的釋放；原癌基因的異常表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)合成〔10〕。miRs廣泛存在于真核細(xì)胞中，能通過降解靶mRNA或抑制其翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡〔11〕。研究表明，機(jī)體內(nèi)miRs的改變與很多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這其中就包含了冠脈支架術(shù)后RS〔12〕。但有關(guān)miR-24在血管RS這一病理過程中所起作用的報(bào)道并不多。若能弄清miR-24在RS中的作用及分子機(jī)制，將可能為冠脈支架術(shù)后RS的有效治療提供新思路。腺病毒可感染分裂和非分裂細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)基因效率高、病毒滴度高、安全性好、外源性基因目的蛋白表達(dá)水平高、病毒基因組不整合宿主染色體等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，成為目前最具前景的載體之一〔13〕。

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〔2016-06-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81170133，81200088，81470387)；三峽大學(xué)碩士學(xué)位論文培優(yōu)基金(No.2015PY052)

楊 簡(1982-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管疾病臨床及基礎(chǔ)研究。

R714.252

A

1005-9202(2017)17-4175-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.003