劉 濤 宋 敏 鞏彥龍 董萬濤 李清林 孫定平 周靈通

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展

劉 濤 宋 敏 鞏彥龍 董萬濤1李清林 孫定平 周靈通

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;間充質(zhì)干細(xì)胞;研究進(jìn)展

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性全身性疾病，主要影響滑膜關(guān)節(jié)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和功能障礙。據(jù)報(bào)道全世界RA的患病率是0.5%～1%，每年有400萬新發(fā)病例〔1〕。RA的發(fā)展是由免疫系統(tǒng)功能障礙所介導(dǎo)的，但確切的致病機(jī)制仍不清楚。RA的病理特征是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥(滑膜炎)，通過浸潤型炎癥、免疫細(xì)胞以及成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLSs)之間的相互作用導(dǎo)致軟骨和骨組織受侵蝕。RA一旦形成，侵蝕不會停止，會造成關(guān)節(jié)持續(xù)性的損害。研究證實(shí)，新的靶向治療已經(jīng)取得了很大的成功，例如，腫瘤壞死因子(TNF)-α抑制劑治療和B細(xì)胞耗竭治療使很多RA患者受益。然而，這些治療方法價(jià)格昂貴，并且目前使用的生物制劑達(dá)不到長期治療效果〔2〕。因此，開發(fā)新的和更有效的治療RA的方法是必要的。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在骨骼肌系統(tǒng)的治療和再生方面最具前景,尤其在軟骨再生方面。MSCs還具有來源廣、容易獲取、易培養(yǎng)、克服免疫排斥、能在宿主體內(nèi)長期存活等優(yōu)點(diǎn)，在治療RA領(lǐng)域具有廣闊的前景。

1 MSCs的生物特性

MSCs由于具有旁分泌作用、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)特性，目前已經(jīng)開展廣泛的移植治療研究。骨髓是這些細(xì)胞首要來源〔3〕。由于沒有明確的MSCs標(biāo)記，國際細(xì)胞治療協(xié)會已經(jīng)建立了最低標(biāo)準(zhǔn)，這些在體外細(xì)胞必須符合這些特點(diǎn)，才被認(rèn)為是MSCs。細(xì)胞表面標(biāo)志CD105、CD73、CD90高表達(dá)，MHC-I類分子低表達(dá)， MHC-Ⅱ、CD11b、CD14、CD34、CD45、CD31表達(dá)較少〔4〕。此外，這些細(xì)胞必須能夠在體外分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。體外培養(yǎng)MSCs具有3種生物特性，才將其用于細(xì)胞療法：(a)分化潛力；(b)營養(yǎng)因子，有利于組織重塑的分泌；(c)免疫調(diào)節(jié)特性〔5〕。

在過去的幾年中，已經(jīng)確定了其他幾個(gè)MSCs來源。經(jīng)過骨髓衍生的MSCs(BM-MSCs)，脂肪組織來源的MSCs(AT-MSCs)，與生育相關(guān)的MSCs(臍血、臍帶和胎盤組織，分別簡稱UCB-MSCs、UC-MSCs和PL-MSCs),在臨床上最常用的BMSCs的來源〔6〕。不同來源的MSCs的表型和功能特點(diǎn)是相似的。然而有細(xì)微的差別，這可能會導(dǎo)致從微環(huán)境生態(tài)位、局部功能(BM-MSC的造血支持作用和AT-MSC的免疫平衡)和個(gè)體發(fā)育年齡在分離和培養(yǎng)中被誘導(dǎo)。CD106就是一個(gè)例子，因?yàn)樗窃贏T-MSCs中相比其他MSC顯著降低。CD34，出現(xiàn)在AT-MSC原代和早期的培養(yǎng)中，而沒有在其他的MSCs。對于功能，UCB-MSC成脂分化能力明顯降低。對于基質(zhì)支持的能力，最近的研究表明，只有BMSCs能夠形成功能性造血微環(huán)境，而脂肪組織、臍帶和皮膚中培養(yǎng)MSCs則不能〔7〕。

2 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制

MSCs可以發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用于細(xì)胞的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。MSCs對T細(xì)胞的影響包括CD4+T細(xì)胞增殖受有絲分裂原(如植物血凝素或抑制刀豆蛋白A)或抗體(抗CD2、CD3和CD28)反應(yīng)抑制。此外，MSCs可以通過T細(xì)胞抑制白細(xì)胞介素(IL)-2、TNF-α的產(chǎn)生。MSCs也可誘導(dǎo)經(jīng)典CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的分化并保持其抑制功能。MSC對T細(xì)胞的影響已被證明是依賴于干擾素(IFN)-γ。除了對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，MSCs在體外能抑制B細(xì)胞的功能和分化〔8〕。此外，B細(xì)胞向炎癥部位趨化作用可以通過降低B細(xì)胞表面表達(dá)趨化因子受體CXCR4、 CXCR5和CCR7抑制。當(dāng)B細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)時(shí)，這些效應(yīng)對趨化因子受體已被證明是由IFN-γ取決。與先天免疫細(xì)胞的關(guān)系，MSCs能抑制來自單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞(DC)產(chǎn)生，減少表達(dá)人白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)和抗原提呈細(xì)胞(APC)上共刺激分子CD80和CD86。此外，由于MSCs的作用，APC使促炎性細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ和TNF-α減少和增加IL-10的產(chǎn)生。相對于NK細(xì)胞，MSCs可以降低靜息和IL-2激活的NK細(xì)胞的增殖及細(xì)胞毒性和IFN-γ的產(chǎn)生〔9〕。

MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制包括分泌吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)。IDO可以催化一種必需氨基酸色氨酸為犬尿氨酸，這對各種細(xì)胞的蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制作用。由MSCs產(chǎn)生的其他可溶性因子包括一氧化氮合酶(iNOS)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮，從而抑制細(xì)胞增殖。其他免疫抑制被MSCs介導(dǎo)機(jī)制包括肝細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、血紅素氧合酶-1和HLA-G5。除了可溶性因子，細(xì)胞MSCs與T細(xì)胞細(xì)胞間聯(lián)系也可以抑制T細(xì)胞功能，通過持續(xù)性CD69的表達(dá)和增加Treg相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平獲得調(diào)節(jié)表型標(biāo)志〔10〕。

3 MSCs 的分類和實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用

3.1 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(S-MSC) S-MSC屬于MSCs家族,S-MSCs用于在免疫抑制治療已被廣泛接受，其可以有效抑制活化的淋巴細(xì)胞增殖。雖然培養(yǎng)的S-MSC細(xì)胞形態(tài)和表型與BM-MSC相似，S-MSC有幾個(gè)優(yōu)勢。S-MSC在動物模型中較骨髓以及肌肉和脂肪MSCs有更大的增殖率〔11〕。此外，不管供體年齡和傳代培養(yǎng)發(fā)生變化，S-MSC都能保持其增殖能力。比較S-MSC與皮膚衍生MSCs顯示后發(fā)現(xiàn)，后者具有較少的免疫抑制特性，特別是受到IFN-γ刺激〔12〕。總之，S-MSC可以作為治療RA的MSC治療源。S-MSCs提取是從病變關(guān)節(jié)，如OA、RA和損傷的交叉韌帶。Koizumi等〔13〕提取分別來自病變OA、RA的S-MSC,從滑膜細(xì)胞增殖能力、炎癥因子基因表達(dá)水平、誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的潛力等比較發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為其具有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值，可以通過無支架組織工程方法修復(fù)軟骨，并且其在少量的滑膜組織提取通常是足夠的。S-MSCs還可以在關(guān)節(jié)不同部位提取，如髕上囊、髕下脂肪墊和外側(cè)或內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)區(qū)域。然而，來自不同關(guān)節(jié)部位的S-MSCs的能力不同。已經(jīng)注意到，從外側(cè)部位收獲的S-MSCs有較高的增殖率相比與其他區(qū)域〔14〕。這反映了需要更多的研究，了解不同的解剖區(qū)域內(nèi)的關(guān)節(jié)S-MSCs的免疫抑制能力之間的差異。

3.2 BMSCs BMSCs可以減少促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)。Park等〔15〕在DBA/1小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中發(fā)現(xiàn)BMSCs顯著降低血清IL-1β，TNF-α、IL-6和IFN-γ和增加IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β水平。Lee等〔16〕通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以誘導(dǎo)抗炎因子和抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的生產(chǎn)，BMSCs通過抑制炎性細(xì)胞因子(主要由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生)和活化T細(xì)胞改變DBA/1小鼠RA發(fā)病機(jī)制。Wei等〔17〕從小鼠骨髓分離培養(yǎng)MSCs，并在體外通過不同濃度的IL-6誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，通過檢測骨料的組織學(xué)和組織化學(xué)的性質(zhì)，表明IL-6呈劑量依賴性抑制骨髓MSCs向軟骨細(xì)胞的分化。Park等〔18〕通過注射TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSCs，發(fā)現(xiàn)可以預(yù)防RA的發(fā)展和減少骨侵蝕和軟骨的破壞。TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)的BMSCs抑制Ⅱ型膠原特異性T淋巴細(xì)胞增殖,下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些治療的作用與在腹腔和脾臟Ⅱ型膠原特異性CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞形成抑制的增加有關(guān)。此外，TGF-β轉(zhuǎn)倒BMSCs抑制破骨細(xì)胞的分化。

3.3 UC-MSCs UC-MSCs具有較高的增殖潛能，能降低病毒污染風(fēng)險(xiǎn)和更強(qiáng)的分化能力。UC-MSCs不僅可以抑制成熟樹突狀細(xì)胞的功能，也增加了Treg的免疫調(diào)控相關(guān)的部分。UC-MSCs具有中胚層分化潛能，使其向軟骨細(xì)胞分化的潛力增加。這些特性可能是由于部分特定的分泌因子，包括某些類型的細(xì)胞因子和生長因子〔19〕。據(jù)報(bào)道，血小板反應(yīng)蛋白2能在RA中通過抗炎因子抑制炎癥介質(zhì)的生產(chǎn)，如IFN-γ和TNF-α，誘導(dǎo)滑膜駐留T細(xì)胞耗竭和減少關(guān)節(jié)組織單核/巨噬細(xì)胞浸潤〔20〕。有研究表明，UC-MSCs能發(fā)揮對RA患者FLSs和T細(xì)胞抑制作用，響應(yīng)FLSs的侵襲行為和炎癥，抑制T細(xì)胞的活化和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)。UC-MSCs通過幾個(gè)可溶性因子，包括IDO、PGE2、IL-10和TGF-β1介導(dǎo)抑制T細(xì)胞和FLSs增生。靜脈輸注MSCs可顯著減少小鼠CIA的嚴(yán)重程度，臨床表現(xiàn)為改善各種炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌減少，并下調(diào)Th1和Th17細(xì)胞〔20〕。此外，在UC-MSCs治療小鼠CIA、Th2/Tregs和IL-10升高。

3.4 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs) 脂肪組織是一種干細(xì)胞的可再生來源，稱為ASCs，能釋放傷口愈合的重要生長因子，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，減少炎癥反應(yīng)，靶向治療受傷組織〔21〕。Gonzalez等〔22〕發(fā)現(xiàn)hASCs能抑制RA患者T細(xì)胞的抗原特異性反應(yīng)，hASCs通過膠原活化的CD4和CD8 T細(xì)胞抑制增殖反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。與此相反，經(jīng)過hASCs治療，IL-10產(chǎn)生的T細(xì)胞數(shù)和單核細(xì)胞數(shù)均明顯增加。hASCs的抑制活性是通過細(xì)胞間直接接觸，hASCs也刺激了Foxp3蛋白表達(dá)CD4(+)CD25(+)Treg的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制膠原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力。最后，hASCs通過由RA患者分離的滑膜細(xì)胞下調(diào)炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解酶的生產(chǎn)。Lopez-Santalla〔23〕觀察到輸注hASCs后小鼠RA的嚴(yán)重程度顯著下降，并伴隨著脾臟和外周血致病性GM-CSF(+)CD4(+)T細(xì)胞數(shù)量減少，在淋巴結(jié)(LNS)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的不同亞群如FOXP3(+)CD4(+)T細(xì)胞和IL-10(+)IL-17(-)CD4(+)T細(xì)胞的數(shù)量增加。Zhou等〔24〕發(fā)現(xiàn)hASCs抑制多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，降低抗原特異性Th1和Th17細(xì)胞增加，并誘導(dǎo)抗炎因子IL-10的產(chǎn)生。此外，其能誘導(dǎo)抗原特異性Treg細(xì)胞的產(chǎn)生與抑制膠原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力。

3.5 牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(GMSCs) 牙齦組織來源的MSCs，大量存在于人的牙齦。GMSCs易于分離，比BMSCs增殖更迅速。此外，GMSCs在信號通道中顯示穩(wěn)定的形態(tài)和功能特征以及不致瘤。Chen等〔25〕在DBA/1J小鼠CIA注入GMSCs，顯著降低關(guān)節(jié)炎病理評分的嚴(yán)重程度，下調(diào)炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-17A)生產(chǎn)，導(dǎo)致CD4+CD39+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加。

4 MSCs促進(jìn)RA軟骨新生

軟骨是一種特殊的結(jié)締組織，在體內(nèi)再生能力較差，具有自我修復(fù)能力。創(chuàng)傷性損傷或自身免疫過程是軟骨損傷和退變的主要原因之一，來源于組織工程學(xué)中的MSCs能分化為軟骨細(xì)胞，是新的治療途徑。Arufe等〔26〕對WJ-MSCs軟骨潛力分析表明它們具有多潛能和軟骨細(xì)胞的能力，在關(guān)節(jié)疾病未來的細(xì)胞治療是有用的。Wang等〔27〕表明，WJ-MSCs在聚羥基乙酸(PGA)支架播種密度，對其成軟骨細(xì)胞的潛力有重要作用。這項(xiàng)研究表明，WJ-MSCs在三維組織工程具有軟骨細(xì)胞分化的潛能；較高的播種密度更好地促進(jìn)生物合成和機(jī)械完整性，因而在軟骨組織工程WJ-MSCs播種密度至少為2 500萬細(xì)胞/ml。此外，MSCs能促進(jìn)透明質(zhì)酸和聚糖的產(chǎn)生以及關(guān)鍵基因SOX9、COMP的表達(dá)Ⅱ型膠原和FMOD〔28〕。Augello等〔30〕在RA小鼠模型關(guān)節(jié)注射BMSCs可以預(yù)防骨和軟骨的退變和不可逆的損傷的發(fā)生。BMSCs可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少，特別是TNF-α的血清濃度顯著下降。BMSCs是通過抗原特異性Treg的培養(yǎng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用?？傊捎谄浞只兔庖哒{(diào)節(jié)特性，MSCs是很有前途的軟骨修復(fù)的細(xì)胞療法。

5 小結(jié)及展望

隨著分子和細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，MSCs治療RA的研究取得了很大的進(jìn)展，MSCs成為治療RA的最有前途的治療方法之一。MSCs通過抑制樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和細(xì)胞的異常激活的免疫功能，在這些自身免疫性疾病的動物模型中顯示良好治療效果。然而，MSCs應(yīng)用在RA的實(shí)驗(yàn)和臨床療效還存在歧義〔31～33〕。這種矛盾可能是由于幾個(gè)因素。首先，根據(jù)來源和培養(yǎng)條件，MSCs的特性可能是不同；其次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用不同的實(shí)驗(yàn)方法，包括路線、數(shù)量和注射時(shí)間(在發(fā)病前和發(fā)病后)；第三，根據(jù)研究動物模型不同。在臨床研究中所使用的每一種動物模型都具有典型的病理生理。因此，沒有一個(gè)單一的模型可以代表人類疾病和準(zhǔn)確的預(yù)測MSCs的療效。總體而言，需要標(biāo)準(zhǔn)化的MSCs使用和適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?。此外，幾個(gè)基本問題仍有待回答。首先，因?yàn)槟壳皩υ隗w內(nèi)的MSCs的生理作用了解有限，所以了解MSCs生理功能很重要；其次，對MSCs的治療機(jī)制和療效、生存時(shí)間、分布和組織的引導(dǎo)及對MSCs的作用部位(局部或全身)進(jìn)行進(jìn)一步的研究；第三，了解MSCs在淋巴組織中轉(zhuǎn)運(yùn)，與免疫細(xì)胞相互作用的過程也是很重要的。了解MSCs在治療自身免疫性疾病中的作用機(jī)制，有助于擴(kuò)大MSCs在自身免疫性疾病中的臨床應(yīng)用。

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〔2016-06-17修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360554);甘肅省自然科學(xué)基金計(jì)劃(1506RJZA048);甘肅省財(cái)政廳基本科研業(yè)務(wù)課題(BH2010-428);甘肅省中藥現(xiàn)代制造工程研究院項(xiàng)目(YWW-2015049)

宋 敏(1964-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治頸肩腰腿痛的研究。

劉 濤(1990-)，男，在讀碩士，主要從事中醫(yī)藥防治骨關(guān)節(jié)疾病研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)01-0213-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.095

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院