雙極制界面電位法測定鯡魚精dsDNA與聯(lián)苯胺的結(jié)合參數(shù)

馬明明,張 彥,趙 強(qiáng)

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

雙極制界面電位法測定鯡魚精dsDNA與聯(lián)苯胺的結(jié)合參數(shù)

馬明明,張 彥,趙 強(qiáng)

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

將鯡魚精dsDNA通過自吸附方式固定在鉛筆芯電極(CP)表面制備出DNA/CP．在pH7.38磷酸緩沖溶液(PBS)中,考察聯(lián)苯胺(BZ)與鉛筆芯電極表面鯡魚精dsDNA相互作用后所導(dǎo)致的DNA/CP零流電位Ezcp變化． 結(jié)果顯示, 隨著BZ濃度或結(jié)合時間的增加,DNA/CP的Ezcp均正移;且當(dāng)BZ濃度在8.0×10-7～1.0×10-5mol·L-1或結(jié)合時間在2～18min內(nèi),Ezcp與BZ濃度對數(shù)lg[BZ]或結(jié)合時間呈正比關(guān)系． 由此計算出dsDNA與BZ結(jié)合反應(yīng)呈現(xiàn)一級動力學(xué)反應(yīng)方程,其結(jié)合比為1∶1,表觀結(jié)合常數(shù)為3.98×106L·mol-1,表觀速率常數(shù)為2.06×104s-1,半衰期為3.36×10-5s． 本方法簡單靈敏安全,對拓寬致癌或致毒小分子與DNA作用的研究方法有參考價值．

鉛筆芯;dsDNA;聯(lián)苯胺;雙極制界面電位法

0 引 言

近幾年癌癥呈高發(fā)和年輕化發(fā)展態(tài)勢,因此對誘發(fā)癌癥的機(jī)理研究越來越受到關(guān)注．致毒致癌性有機(jī)小分子與DNA結(jié)合后能顯著影響DNA的轉(zhuǎn)錄與合成,導(dǎo)致DNA發(fā)生突變,繼而引發(fā)癌癥．為了滿足日常分析檢測的需要,及時挽救生命,采用簡單快捷靈敏的方法研究DNA與致毒致癌性小分子物質(zhì)之間相互作用十分必要．目前,研究二者結(jié)合作用機(jī)制的方法有紫外光譜法、熒光光譜、拉曼光譜、紅外光譜、核磁共振譜、X-衍射晶體、圓二色譜、瑞麗散射共振光譜、黏度與熔點測試[1-8]、經(jīng)典電化學(xué)方法[9]等．然而,紫外光譜法靈敏度低;拉曼光譜、紅外光譜定量較困難;核磁共振譜、X-衍射晶體、圓二色譜法中所用的儀器昂貴、檢測成本高;黏度與熔點測試法只能定性;熒光光譜和瑞麗散射共振光譜需要特殊的試劑．而只有經(jīng)典電化學(xué)方法以其操作簡單、成本低廉、檢測周期短、易于微型化而受到廣泛關(guān)注．但經(jīng)典電化學(xué)方法在研究二者結(jié)合體系中,必須有電化學(xué)活性物質(zhì)參與,這就增加了研究成本;此外,結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)反應(yīng)特點未被探討．

聯(lián)苯胺(BZ)是24種致癌性芳香胺的一種．除了大量存在于水域和底泥中,聯(lián)苯胺還能夠通過空氣和土壤傳播,可引起膀胱癌、膽管癌等[10-11],對環(huán)境和人類構(gòu)成較大危害[12]．因此研究聯(lián)苯胺與DNA的結(jié)合機(jī)制就非常重要． 已有極譜法[13]計算出魚精子hsDNA與聯(lián)苯胺相互作用的結(jié)合常數(shù),但由于極譜法的汞電極易對操作人員健康造成危害,不適合被推廣使用,因此需要開發(fā)新的電化學(xué)方法．

雙極制界面電位法,最早也叫“零流電位法”,是近年國內(nèi)開發(fā)的一種新型界面電位傳感電分析技術(shù),國外并沒有此技術(shù)的研發(fā)．此方法簡單、靈敏、穩(wěn)定,可以實時在線監(jiān)測樣品與界面層物質(zhì)之間的作用,制作成本低廉,未來易于實現(xiàn)微型化、自動化和智能化．雙極制界面電位測量系統(tǒng)由一個電位回路和一個電流回路組成．由于溶液的旁路電阻大于導(dǎo)電材料電阻,回路電流經(jīng)工作電極、輔助電極端口后仍流經(jīng)導(dǎo)電材料．因此,回路電流是一個直流電流,遵守歐姆定律,電流值取決于回路電壓及電流回路的電阻．施加一定的線性掃描電位Eapp(vs.Eref)于電極材料后,所記錄的電流I-電位Eapp曲線中，電位Eapp=Eref+E+Ψ+IR,其中E為電極材料的電位,Ψ為電極材料雙電層的界面電位,I、R分別為回路電流和回路電阻．當(dāng)I=0時,零流電位Ezcp=E=Eapp(vs.Eref)-Ψ,因此電極材料Ψ變化,Ezcp才有相應(yīng)變化[14]．

目前,應(yīng)用雙極制界面電位法可以計算出聚胭脂紅與質(zhì)子的交換速率常數(shù)[15]，人血清白蛋白在金電極表面的吸附常數(shù)[16]，半胱胺酸在金電極表面自組裝過程的動力學(xué)常數(shù)[17]，抗腫瘤藥物小分子貝加因與dsDNA(雙鏈DNA)結(jié)合常數(shù)[18]及Cu2+/Cu+配合物與甘氨酸結(jié)合作用的穩(wěn)定常數(shù)測定[19]等.此外,雙極制界面電位傳感系統(tǒng)還可通過印跡聚合物與模板分子的結(jié)合作用檢測聯(lián)苯胺[20]、鄰甲苯胺[21]等．因此用雙極制界面電位法研究物質(zhì)間的作用機(jī)制既簡單又靈敏．

文中以自吸附方式在價格低廉的鉛筆芯(CP)表面構(gòu)筑了DNA/CP, 應(yīng)用雙導(dǎo)線制界面電位法測定了鯡魚精 dsDNA與BZ結(jié)合作用的熱力學(xué)與動力學(xué)參數(shù)．本方法簡單靈敏,可進(jìn)一步設(shè)計成檢測BZ的傳感器．

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 CHI610D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器廠,上海),UV-2450紫外分光光度計(日本島津),Quanta FEG 450 FESEM 型掃描電鏡 (美國 FEI 公司)．

1.1.2 試劑 1.0×10-4mol·L-1聯(lián)苯胺儲備液(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,分析純);1.0 g·L-1鯡魚精 dsDNA儲備液(AR,Sigma公司),其濃度由紫外光譜260nm處的吸光度進(jìn)行換算確定(ε=6 600L·moL-1·cm-1),臨用時配制;pH7.38磷酸緩沖溶液(PBS)．其他試劑均為分析純．實驗所使用水均為二次蒸餾水．實驗均在室溫下操作．

1.2 DNA/CP的制備

按照文獻(xiàn)[16]電極方法制備CP．以自制鉛筆芯(CP)電極為工作電極,鉑絲為輔助電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極,在-1.00～1.00V電位范圍內(nèi),以0.1V·s-1掃速在PBS(pH7.38)緩沖溶液中循環(huán)掃描多次對CP電極進(jìn)行活化．將活化好的CP電極置入含0.1g·L-1dsDNA的PBS(pH7.38)緩沖溶液中,自吸附20min后,水洗去除CP表面多余的dsDNA得到DNA/CP,晾干保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 方法

1.3.1 BZ與dsDNA結(jié)合作用的熱力學(xué) 按照圖1所示的連接方法,將DNA/CP串聯(lián)入CHI610D電化學(xué)工作站的工作電極端和對電極端之間,然后與飽和甘汞參比電極(SCE)一起浸入含一定量BZ的PBS(pH7.38)緩沖溶液中,靜置18min后,在-0.8～0.8V電位范圍內(nèi)以0.1V·s-1的掃速掃描一圈,記錄I-Eapp曲線上I=0處的電位值即零流電位Ezcp值．

1.3.2 聯(lián)苯胺與DNA相互作用的動力學(xué) DNA/CP、SCE連接方法同1.3.1．電解液為4.0×10-6mol·L-1BZ的pH7.38PBS．DNA/CP、SCE浸入電解液后,每隔2min 在-0.8～0.8V電位范圍內(nèi)以0.1V·s-1的掃速掃描一圈并記錄該時間的DNA/CP零流電位Ezcp．

每次測量后,將DNA/CP用蒸餾水清洗后即可用于下次測量．

2 結(jié)果與討論

2.1 BZ和鯡魚精dsDNA的相互作用

2.1.1 DNA/CP與CP 的差異 圖2是裸CP與DNA/CP分別在雙極制界面電位法下的I-Eapp曲線．由圖2可知,裸CP的Ezcp為33.4mV(曲線1),而DNA/CP的Ezcp為13mV(曲線2),比裸CP的Ezcp負(fù)移20.4mV,說明DNA吸附在鉛筆芯表面,其界面層與裸鉛筆芯明顯不同,導(dǎo)致二者具有不同的界面電位,從而產(chǎn)生不同的Ezcp．CP和DNA/CP的掃描電鏡圖(圖3)證明了這種推斷．從圖3(a)可以看出,裸CP的表面只顯示石墨的片層結(jié)構(gòu);由圖3(b)可以看出，DNA/CP表面不僅保留了石墨的片層結(jié)構(gòu),而且還在其表面散落有一簇簇的DNA,說明通過自吸附方式DNA能夠在石墨表面存在,因此表面結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了兩種電極的雙極制界面電位不同．

圖1 DNA/CP的雙極制界面電位法連接示意圖

Fig.1 Schematic diagram of interface potentiometry

2.1.2 聯(lián)苯胺和DNA結(jié)合作用的動力學(xué)特征 考察了鯡魚精dsDNA與BZ結(jié)合時間對DNA/CPEzcp的影響．圖4是DNA/CP在不同結(jié)合時間的I-Eapp曲線．根據(jù)圖4中的數(shù)據(jù)(未畫出18min后的I-Eapp曲線),記錄DNA/CP的Ezcp與結(jié)合時間之間的關(guān)系,結(jié)果如圖5所示．由圖5可以看出,在18min內(nèi),Ezcp隨結(jié)合時間的增加而逐漸正移;18min后,DNA/CP零流電位Ezcp不再變化,說明dsDNA與BZ的結(jié)合趨于飽和．

為了測定鯡魚精dsDNA與BZ結(jié)合作用的動力學(xué)參數(shù),假定dsDNA與BZ按式(1)結(jié)合成DNA·BZ, 即DNA+BZ=DNA·BZ．

假定dsDNA與BZ結(jié)合為一級反應(yīng),其瞬時反應(yīng)速率[22]可表示為

(1)

式中,N為與dsDNA結(jié)合的BZ分子總數(shù),n為在時刻t時與dsDNA結(jié)合的BZ分子數(shù),[BZ]0為溶液中BZ的初始濃度,kα為正向反應(yīng)速率常數(shù)．如果BZ、DNA各自分子之間均沒有明顯的相互作用,則n/N可以表示成dsDNA與BZ結(jié)合程度．以結(jié)合完全程度α代替n/N,式(1)可被簡化為[22]

(2)

分離變量并積分,可得dsDNA與BZ結(jié)合完全程度αi與任意反應(yīng)時間ti的關(guān)系為

ln(1-αi)=C-kα[BZ]0ti.

(3)

將未結(jié)合(t=0,反應(yīng)程度記為α=0)時的Ezcp記作Ezcp, α=0,完全結(jié)合時(反應(yīng)程度記為α=1)的Ezcp記作Ezcp,α=1．反應(yīng)過程中任意時刻ti的反應(yīng)程度αi可用簡單的內(nèi)插法[22]來估算,其值為

(4)

將式(4)代入式(3)得

(5)

根據(jù)圖5中2min～18min的Ezcp與時間線性方程,計算出C=0.038 24,kα為2.06×104(mol·L-1)-1·s-1．因此,dsDNA與BZ反應(yīng)的表觀結(jié)合速率常數(shù)kα為2.06×104(mol·L-1)-1·s-1,半衰期為3.36×10-5s．

圖4 不同結(jié)合時間的I-Eapp曲線

Fig.4 I-EappCurves at different binding time

2.1.3 BZ和dsDNA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合比 考察了BZ濃度對DNA/CP界面電位的影響．圖6是不同BZ濃度下DNA/CP的Ezcp．如圖6所示, 隨著BZ濃度的增加,DNA/CP的Ezcp逐漸正移;且當(dāng)BZ濃度在8.0×10-7～1.0×10-5mol·L-1的范圍內(nèi),Ezcp與BZ濃度對數(shù)lg[BZ]呈正比關(guān)系,結(jié)果如圖7所示．其線性方程為

Ezcp=0.195 4+0.041 14lg[BZ](r=0.998,n=7).

(6)

圖6 DNA/CP在不同濃度BZ溶液中的I-Eapp曲線

Fig.6 I-Eappcurves of DNA/CP in different concentration of BZ solution

由方程(6)計算出檢測限是1.96×10-7mol·L-1(S/N=3),因此通過雙極制界面電位法監(jiān)測BZ與dsDNA的結(jié)合作用,可進(jìn)一步創(chuàng)建檢測BZ的新方法．BZ與dsDNA結(jié)合常數(shù)的計算參考文獻(xiàn)[22]．

假定dsDNA和BZ按式(7)結(jié)合成DNA·BZm, 即 DNA+mBZ=DNA·BZm,則

(7)

式中,m是結(jié)合比, β是表觀結(jié)合常數(shù)．[DNA·BZm]為DNA與BZ結(jié)合物的濃度,[DNA]為游離DNA的濃度．

在BZ溶液中,DNA/CP雙極制界面電位Ψ可用能斯特方程[22]表示為

(8)

其中,K為DNA/CP的標(biāo)準(zhǔn)電極電位等參數(shù)的常數(shù)[22]．n為DNA凈電荷數(shù),文中n=2．F=96 485C·mol-1為法拉第常數(shù),R=8.314J·mol-1·K-1為氣體常數(shù),T為測試溫度,取T=298.15K．

由于Ezcp=Ψ+φSCE,因此,

(9)

2.1.4 方法的精密度和重現(xiàn)性 用同一根DNA/CP,按照濃度由低到高5次,再由高到低5次的順序,依次測定dsDNA與濃度為(8.0,10.0,20.0,40.0,60.0,80.0,100.0)×10-7mol·L-1的BZ作用后的零流電位值,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3%之內(nèi),說明此方法具有良好的精密度．

用5根DNA/CP,按照濃度由低到高的順序,分別測定dsDNA與上述濃度范圍內(nèi)的BZ作用后的零流電位值．實驗結(jié)果顯示,每根電極在同一濃度BZ中的零流電位基本相同,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過5%,因此本方法具有良好的重現(xiàn)性．

3 結(jié) 論

在雙極制界面電位法下,由于CP表面上dsDNA與溶液中BZ的結(jié)合作用,導(dǎo)致DNA/CP的零流電位發(fā)生相應(yīng)的變化,因此通過I-Eapp曲線和零流電位的變化即可實時跟蹤監(jiān)測二者的結(jié)合過程．據(jù)此計算出dsDNA和BZ結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù),并證明二者結(jié)合反應(yīng)為一級動力學(xué)方程．本方法操作簡單安全環(huán)保,成本低,不僅克服了傳統(tǒng)極譜法中使用汞電極易對人體造成危害的不足,而且還可以進(jìn)一步發(fā)展為檢測BZ的新方法．

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編輯:武 暉；校對：師 瑯

Determination of interaction parameters between Herring fine dsDNA and benzidine by interface potentiometry with double poles

MAMingming,ZHANGYan,ZHAOQiang

(School of Environmental and Chemical Engineering,Xi′an Polytechnic University,Xi′an 710048,China)

DsDNA was immobilized on the surface of pencil electrode (CP) by self-adsorption and then DNA/CP was obtained. The change of zero current potential of DNA/CP in pH7.38 PBS containing BZ was investigated. The results show that zero current potential of DNA/CP both shift positively with the increase of BZ concentration([BZ]) in the range from 8.0×10-7～1.0×10-5mol·L-1or interaction time from 2 to 18 min. The thermodynamic or dynamic constants of the complexion between dsDNA and BZ is accordingly determined by the relationship ofEzcpwith lg[BZ] or binding time. The binding reaction of dsDNA with BZ obeyed the first order kinetics. The binding ratio and the binding constant of this interaction is calculated as 1∶1 and 3.98×106L·mol-1, respectively. The reaction rate constant and half-life is estimated as 2.06×104s-1and 3.36×10-5s, respectively.The results show that the proposed approach is not only simple, rapid and safe, but also has advantages for studying the binding equilibrium of carcinogenic or toxic small molecular with DNA.

pencil; dsDNA; benzidine; interface potentiometry with double poles

1006-8341(2016)04-0520-07

10.13338/j.issn.1006-8341.2016.04.018

2016-04-15

陜西省科技攻關(guān)項目(2013KJ07-24)

馬明明(1969—),女，陜西省西安市人，西安工程大學(xué)教授，研究方向為功能材料制備與應(yīng)用.

E-mail:18220593193@163.com

馬明明,張彥,趙強(qiáng).雙極制界面電位法測定鯡魚精dsDNA與聯(lián)苯胺的結(jié)合參數(shù)[J].紡織高校基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)報,2016,29(4)：520-526.

MA Mingming,ZHANG Yan,ZHAO Qiang.Determination of interaction parameters between Herring fine dsDNA and benzidine by interface potentiometry with double poles[J].Basic Sciences Journal of Textile Universities,2016,29(4):520-526.

O 657.1

A