郭慧敏，繆秋紅，譚永貴，朱 杰，劉 騰，劉光清

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

病毒樣顆粒的常用表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng)用進(jìn)展

郭慧敏，繆秋紅，譚永貴，朱 杰，劉 騰，劉光清

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

病毒樣顆粒是由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白組成，不含感染所必需的核酸成分，沒(méi)有感染性和復(fù)制能力，但是可以同時(shí)引起細(xì)胞免疫和體液免疫。由于具有與親本病毒相似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，病毒樣顆粒受到研究者的極大關(guān)注。與其他病毒亞單位疫苗相比，病毒樣顆粒具有安全高效的特點(diǎn)。本綜述論述了病毒樣顆粒的常用表達(dá)系統(tǒng)以及在生物制品方面的應(yīng)用。

病毒樣顆粒；表達(dá)系統(tǒng)；生物制品

Abstract:Virus-like particles (VLPs) formed by the structural proteins of viruses are essentially devoid of infectious genetic materials.Therefore, VLPS are non-infective and non-replicable but can still stimulate strong humoral and cellular immune responses. In the recent years, VLPs have received considerable attention due to their structures and morphology similar to native viruses. VLPs are safer and more effective than many other kinds of subunit vaccines against animal viral diseases. This paper reviews the expression systems and applications of VLPs in biological products.

Key words:Virus-like particles; expression systems; biological products

疫苗接種仍然是當(dāng)前控制和預(yù)防疾病感染的最有效途徑。目前最主要的疫苗以滅活或弱毒疫苗為主[1]，但這些疫苗具有很高的效力的同時(shí)也伴隨一些副作用，比如疫苗生產(chǎn)過(guò)程中存在傳播病原體的風(fēng)險(xiǎn)、化學(xué)滅活不徹底及弱毒毒力返強(qiáng)等問(wèn)題。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的興起，特別是重組DNA技術(shù)和基因工程的不斷發(fā)展，亞單位疫苗越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[2,3]。亞單位疫苗是將病原體的保護(hù)性抗原基因在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并以蛋白質(zhì)或多肽的形式制備成疫苗。該類疫苗具有安全性好，純度高，穩(wěn)定和生產(chǎn)方便等特點(diǎn)，但相比傳統(tǒng)疫苗，其免疫效果較差，這就要求在實(shí)際使用中，需要增加劑量，或通過(guò)使用免疫增強(qiáng)劑或佐劑的方式提高免疫效力，從而使亞單位疫苗的實(shí)際應(yīng)用受到了極大限制。病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）是亞單位疫苗研究中發(fā)現(xiàn)的一種具有高免疫效力、高安全性的疫苗，具有很高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

VLPs是利用重組DNA技術(shù)，由單個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白形成的空心病毒衣殼。VLPs沒(méi)有核酸成分，不能自我復(fù)制，沒(méi)有感染性。這些特點(diǎn)使得其在疫苗生產(chǎn)，疫苗投遞系統(tǒng)及生物工具方面都具有巨大的優(yōu)勢(shì)。本綜述將從常用表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用前景等方面介紹VLPs。

1 常用表達(dá)系統(tǒng)

現(xiàn)今絕大多數(shù)已批準(zhǔn)的亞單位疫苗都是基于VLPs設(shè)計(jì)的。細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)都已廣泛應(yīng)用于VLPs的生產(chǎn)。

1.1 大腸桿菌作為當(dāng)前制備重組蛋白的最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)并沒(méi)有廣泛用于VLPs的制備，這主要是由于其缺少類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾系統(tǒng)。但研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中可以表達(dá)一些無(wú)囊膜VLPs，這些無(wú)囊膜VLPs是由病原體的某個(gè)成分在大腸桿菌中表達(dá)并自我組裝形成，這些成分往往是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，具有自我組裝形成VLPs的特性[4]。全球第一個(gè)利用大腸桿菌表達(dá)的VLPs是戊型肝炎疫苗，該疫苗是通過(guò)將戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）的E2蛋白N端延伸至氨基酸368位置，并在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白p239，然后與鋁佐劑混合配置成疫苗。動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，即使在高滴度HEV的存在下仍可預(yù)防肝炎的發(fā)生，表明該疫苗具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)力[3]。近幾年來(lái)，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備VLPs的技術(shù)取得了一系列突破。有研究通過(guò)引入分子伴侶蛋白SUMO以及低溫培養(yǎng)的策略，促進(jìn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，并成功制備了2型豬圓環(huán)病毒樣顆粒[5]和犬細(xì)小病毒樣顆粒[6]。

1.2 酵母酵母是另一種重要的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，也被廣泛應(yīng)用于VLPs的生產(chǎn)。默克公司生產(chǎn)的可用于防治早期宮頸癌，陰道癌的Gardasil?和用于治療乙型肝炎的Recombivax HB?都是通過(guò)該表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的[7]。其中Gardasil?包含16、18、6和11型人乳頭狀瘤病毒（papilloma virus，HPV）的病毒樣顆粒并與鋁佐劑混合。盡管如此，與大腸桿菌相似，酵母在翻譯后修飾功能特別是蛋白糖基化的不足，限制了其在生產(chǎn)VLPs上的應(yīng)用。該系統(tǒng)通常也用于生產(chǎn)無(wú)囊膜VLPs，但含有艾滋病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的囊膜蛋白成分的Pr55Gag的VLPs在HIV-1在酵母中也獲得了成功的表達(dá)參考文獻(xiàn)。

1.3 昆蟲細(xì)胞昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中最常用的是昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)前葛蘭素史克公司生產(chǎn)的包含16和18型HPV的VLPs的疫苗就是通過(guò)該系統(tǒng)生產(chǎn)的，并由氫氧化鋁及3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A組成佐劑。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以行使蛋白的翻譯后修飾功能[8]，對(duì)目的蛋白進(jìn)行糖基化，并且可以使得外源蛋白大量積累，同時(shí)不含動(dòng)物病原體。但由于目的蛋白與桿狀病毒顆粒共表達(dá)，容易被污染，因此，VLPs的純化是使用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)時(shí)經(jīng)常面臨的問(wèn)題。昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)不僅可以用于生產(chǎn)無(wú)囊膜VLPs也可以生產(chǎn)具有囊膜結(jié)構(gòu)的VLPs。已有研究利用Sf21細(xì)胞成功表達(dá)了小反芻獸疫病毒樣顆粒[8]，而兔出血癥病毒樣顆粒也已在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)[9]。另外艾滋病病毒、人乳頭狀瘤病毒、輪狀病毒等都可以通過(guò)昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)VLPs。昆蟲細(xì)胞種類中的S2細(xì)胞是半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，這類細(xì)胞可以獨(dú)立于病毒感染來(lái)表達(dá)功能蛋白。S2細(xì)胞可以懸浮生長(zhǎng)并且容易達(dá)到高濃度，不但可以用于連續(xù)培養(yǎng)，而且容易擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，已經(jīng)成為研究者最新關(guān)注的表達(dá)系統(tǒng)。

1.4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比其他翻譯系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)最大的特點(diǎn)是能正確有效地識(shí)別真核蛋白的合成、加工和分泌信號(hào)，特別是能精確地完成糖基化、磷酸化等翻譯后修飾的過(guò)程，產(chǎn)生的蛋白具有完整的結(jié)構(gòu)和功能，因此被大量用于治療性重組蛋白的生產(chǎn)和研究。目前針對(duì)新生兒的用于預(yù)防乙肝病毒的GenHevac B?[10]和Bio-Hep?（Sci-B-VacTM）和針對(duì)大于18周歲的成人的Hepacare?都是通過(guò)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)的[11]。但哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量低，生產(chǎn)成本較高，細(xì)胞株穩(wěn)定性不足以及潛在的安全問(wèn)題等，是實(shí)際生產(chǎn)中面臨最大的問(wèn)題[12]。隨著外源蛋白翻譯后修飾問(wèn)題的日益突出，如何提高該表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平，改進(jìn)生產(chǎn)工藝成為當(dāng)下研究者所關(guān)注的重點(diǎn)。

2 應(yīng)用進(jìn)展

2.1 病毒樣顆粒作為病毒與宿主免疫研究的一種模型VLPs具有與親本病毒在形態(tài)大小和結(jié)構(gòu)上相似的特點(diǎn)，一方面，可以在低生物安全水平條件下，用于研究高致病性病毒的侵入及病毒粒子的抗體中和反應(yīng)[13]，而且VLPs作為載體可以攜帶外源病毒基因，同時(shí)可以研究病毒基因的復(fù)制和原始轉(zhuǎn)錄；另一方面，VLPs可以用于研究抗原遞呈細(xì)胞（antiqenpresenting cell，APC）特別是樹突狀細(xì)胞如何對(duì)病原體進(jìn)行識(shí)別，遞呈[14]以及加工等過(guò)程以及在受到特異性刺激后誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的過(guò)程[15]。

2.2 病毒樣顆粒作為疫苗病毒樣顆粒是病毒結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝形成的模擬自然病毒衣殼結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合體。一直以來(lái)（輔助性T）Th1細(xì)胞應(yīng)答被認(rèn)為是研制疫苗中的一個(gè)限制因素。對(duì)于大部分病原體，接種疫苗產(chǎn)生的保護(hù)性來(lái)源于特異性的中和抗體。由于VLPs可多重地，高密度地呈現(xiàn)抗原表位，因此相比其他亞單位疫苗，由VLPs組成的疫苗可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的產(chǎn)生,高效地誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫[16]。這表明，相比其他亞單位疫苗，低劑量的VLPs疫苗即可以引起相似的保護(hù)性免疫應(yīng)答。不過(guò)也有研究發(fā)現(xiàn)，大部分的VLPs只有在佐劑的存在下才能引起細(xì)胞免疫，而且，即使是形狀大小相似的VLPs，如乳頭瘤病毒和多瘤病毒，引起的免疫應(yīng)答情況也不同[17]。另外選擇不同的佐劑、不同給藥途徑也會(huì)引起不同的免疫應(yīng)答。為了得到好的免疫保護(hù)效力，有些病毒的VLPs，比如甲型流感病毒，可以形成與天然病毒粒子近似的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)，達(dá)到很好的免疫效果[18]。而另外一些病毒則需要對(duì)VLPs進(jìn)行修飾，比如乙肝HBV疫苗就是將大囊膜和中囊膜蛋白包含于乙肝病毒顆粒中，這樣不僅增加了動(dòng)物的中和抗體范圍，更重要的是增加了額外的T細(xì)胞表位，促進(jìn)早期的抗乙肝病毒反應(yīng)[19]；而對(duì)于艾滋病病毒，為了使得VLPs模擬完整的艾滋病病毒粒子，設(shè)計(jì)將與gag核心蛋白相關(guān)的囊膜蛋白包含于VLPs中[20]。疫苗制備的一個(gè)重要需求是安全性，VLPs作為空殼蛋白結(jié)構(gòu)，不含病毒核苷酸，沒(méi)有感染性，避免了弱毒疫苗和滅活疫苗的潛在的病毒復(fù)制、返強(qiáng)的安全隱患，具有極大的安全優(yōu)勢(shì)。

2.3 病毒樣顆粒作為抗原投遞工具疫苗能否激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，與給藥途徑和佐劑的正確選擇是分不開(kāi)的[21]?？乖豢乖f呈細(xì)胞（APCs）遞呈給免疫細(xì)胞，而APCs通?？梢宰R(shí)別直徑20 nm～3μm大小的抗原，樹突狀細(xì)胞識(shí)別抗原的最適直徑為40 nm[15]，恰恰與VLPs的大小范圍相一致。這表明，一方面，VLPs可以作為疫苗攜帶VLPs親本病原體的抗原，另一方面可以作為抗原投遞載體攜帶其他病原體的抗原，通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞捕獲，并交叉遞呈活化免疫細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)。一種方法是在體外將VLPs和目的抗原分別合成，通過(guò)化學(xué)結(jié)合的方法（比如共價(jià)鍵結(jié)合）將目的抗原連接到VLPs的表面附著點(diǎn)上[22]。這樣抗原的大小和結(jié)構(gòu)就不會(huì)受到VLPs折疊時(shí)的影響，可以保持完整的抗原性結(jié)構(gòu)和功能。另外一種方法是將目的基因與病毒的結(jié)構(gòu)基因融合形成嵌合VLPs。VLPs不僅可以攜帶親本病原體的抗原作為預(yù)防性疫苗，而且可以作為載體攜帶線性抗原，環(huán)形抗原，非蛋白成分等[23]應(yīng)用于疫苗中去。

2.4 VLPs作為疾病的監(jiān)控和診斷工具傳統(tǒng)疫苗接種時(shí)，很難區(qū)分受感染動(dòng)物是來(lái)自于病原體還是來(lái)自于疫苗本身。為此研究者研制了可以區(qū)分兩者的 DIVA（differentiating infected from vaccinated animals）疫苗[24]。作為一種標(biāo)記疫苗，這種疫苗通常是來(lái)自于缺失了一種或多種免疫原蛋白的疫苗株。VLPs是由一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白組成，不含病毒基因組，是一類更加安全的疫苗。另外，VLPs疫苗設(shè)計(jì)時(shí)可以根據(jù)病毒血清型的要求設(shè)計(jì)包含單價(jià)抗原或多價(jià)抗原的VLPs疫苗，這樣DIVA疫苗接種時(shí)使用DIVA型的VLPs疫苗，不僅可以預(yù)防控制疾病，還可以監(jiān)測(cè)和診斷疾病的發(fā)生和在動(dòng)物群中流行情況。

3 現(xiàn)有問(wèn)題及應(yīng)用前景

基于VLPs設(shè)計(jì)的疫苗被認(rèn)為既可以引起抵抗多種抗原的強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫，同時(shí)相比傳統(tǒng)疫苗更是一種安全的疫苗，并且由于其與親本病毒的大小和形態(tài)相似的特點(diǎn)，衍生出其在疫苗工藝中扮演佐劑和載體的功能，這都引起了研究者的極大興趣。但是，VLPs的應(yīng)用同樣具有很多限制性因素。首先，VLPs的制備工藝問(wèn)題。如何在實(shí)際應(yīng)用中選擇最合適的表達(dá)系統(tǒng)是面臨的首要問(wèn)題，特別是當(dāng)VLPs投入商業(yè)生產(chǎn)時(shí)，需要綜合考慮其安全性、效率性、生產(chǎn)成本還有免疫方式等問(wèn)題。其次，盡管研究表明相比其他亞單位疫苗，VLPs具有安全、高效的特點(diǎn)，現(xiàn)有的VLPs疫苗會(huì)引起特異性的B細(xì)胞免疫和T細(xì)胞免疫，但在病毒感染機(jī)體期間，有些病毒的抗原表位會(huì)發(fā)生變異，而VLPs對(duì)于變異后的抗原表位并不能引起機(jī)體高效的免疫應(yīng)答；佐劑使用和免疫方式也會(huì)影響VLPs的免疫效果。再次，從實(shí)際考慮，商業(yè)預(yù)防疫苗更多是多價(jià)疫苗，而VLPs的空間是有限的，如何將不同特異性蛋白結(jié)合于VLPs表面而不影響VLPs的正確折疊也是問(wèn)題之一。VLPs盡管仍面臨眾多在生產(chǎn)工藝和使用方法方面的問(wèn)題，但其在疫苗生產(chǎn)、疫苗制備工藝以及DIVA疫苗方面所展現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)仍為新型疫苗的研制提供了重要的研究平臺(tái)和廣闊的應(yīng)用前景。

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EXPRESSION SYSTEMS OF VIRUS-LIKE PARTICLES AND PROGRESS ON THEIR APPLICATIONS

GUO Hui-min, MIAO Qiu-hong, TAN Yong-gui, ZHU Jie, LIU Teng, LIU Guang-qing

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

S852.43

A

1674-6422（2017）04-0082-05

2016-01-18

公益性農(nóng)業(yè)科研專項(xiàng)（201303046）；上海市科委創(chuàng)新項(xiàng)目（13391901602）

郭慧敏，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

劉光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn.